一種低密度脂蛋白膽固醇的選擇性吸附劑及其製備方法
2023-05-11 05:47:21
專利名稱：一種低密度脂蛋白膽固醇的選擇性吸附劑及其製備方法
技術領域：
本發明屬於化學合成和蛋白質生物分離工程領域，特別涉及到一種用於血液淨化中以選擇性吸附去除低密度脂蛋白膽固醇的以肝素為配基的吸附劑，本發明還涉及所述吸附劑的製備方法。
背景技術：
血液淨化療法是自20世紀80年代以來出現的一種非常規臨床治療方法，主要是通過清除血液中的某些致病物質來實現治療某些病症的一種獨特的治療方法，其實質是生物分離技術在醫學領域的應用。伴隨著生物分離技術以及生物材料的發展，血液淨化治療技術也得到了長足的進步。血液淨化療法的特徵是通過在體外建立臨時的人體血液循環支路，使血液流經吸附柱以除去血液中的某些致病物質，淨化人體的內環境，達到治療某些疾病的目的。肝素誘導的體外低密度脂蛋白(LDL)沉澱法(簡稱H.E.L.P.法)是血液淨化療法中的一種重要的選擇性治療方法，其原理是在特定的條件下游離肝素與LDL在體外形成共沉澱而將LDL過濾去除，達到淨化的目的。由於肝素不與Apo A、白蛋白或免疫球蛋白等形成沉澱，且對其他成份亦無影響，因此目前認為其是一種治療高脂血症特別是家族性高脂血症較好的療法，其除了應用在高脂血症的治療外，還可以用在動脈粥樣硬化、冠狀動脈旁路手術病、高脂血腎病變症候群、突發性感覺神經性聽力損失(SSHL)、外周動脈栓塞病、先兆子癇病、腦血管疾病等方面疾病，作為有效的輔助療法，故其有著廣闊的臨床應用前景。
醫學研究表明人體血液中的LDL增高是導致心腦血管疾病的一個獨立的致病因素。肝素是一種聚陰離子酸性粘多糖，其分子鏈上含有豐富的羥基、羧基、磺酸基等負電性基團，這是其能與帶正電性的低密度脂蛋白LDL特異性靜電結合的基礎，利用肝素能與LDL特異性靜電結合的特性可以將之從血液中除去，達到治療某些高脂血症的目的。目前，臨床上採用肝素誘導的體外LDL沉澱治療方法中，由於肝素是游離的，在治療循環過程中，不可避免會因為肝素的過量使用而有部分肝素隨血液帶進人體內。而肝素具有良好的抗凝血作用，過多的肝素殘留在人體內可能會引起出血、不凝血等副作用。所以，在治療中得增加陽離子吸附柱以除去過量肝素的單元，治療結束後，根據需要還得外加魚精蛋白以中和殘留的肝素，使得治療系統變得更加複雜繁瑣，增加治療成本，同時也使得此法在安全性上存在待改進之處。另外，此法還存在技術上保密和費用過高的缺憾。為此，為了完善此技術，同時也為了降低此法的治療成本，提高其使用的普及性，將肝素固定到一種載體上之後再行使用將是最理想的做法。
發明內容
研究證實，肝素、肝素衍生物或類肝素能夠吸附血液中帶正電性的LDL，主要是靠其分子上豐富的帶負電性的羧基和磺酸基的靜電作用。為此，必須保留這兩種基團不能參與反應和受到破壞，故本發明在將配基(肝素或肝素衍生物或類肝素)固定到載體上採用共價鍵結合方式而不採用離子鍵方式，從而防止羧基和磺酸基參與反應，使它們得到保留和不受破壞。
本發明的目的就是將配基(肝素或肝素衍生物或類肝素)固定到一種載體材料上，得到一種新的LDL選擇性吸附材料，以彌補先前方式的不足，此吸附劑克服了現有技術中沉澱療法存在的不足，能夠降低臨床應用中的副作用，並能降低成本，提高應用價值。同時本發明還提供一種所述配基的固定化途徑。通過選擇合適的載體，採用偶聯劑偶聯的方式將所述配基偶聯固定到載體上去以製得所述吸附劑。
本發明的基本技術方案是選用表面富含官能基團(羥基和/或氨基)且能滿足臨床應用要求的高聚物(如聚乙烯醇，其不需要預功能基化)作為載體材料，採用固-液合成法用偶聯劑如戊二醛與載體如聚乙烯醇先反應生成中間體，然後此中間體再與配基如肝素反應而將配基共價固定到載體上得到所述吸附劑。本發明提供的製備方法能夠保證其製備過程中吸附材料上保留配基分子的活性基團磺酸基和羧基不受損失和破壞。
為實現上述目的之一，本發明涉及的LDL選擇性吸附劑的主要成分包括載體和功能配基兩大部分。載體為表面含有游離官能基團(羥基和/或胺基)的天然的或者人工合成的高分子物質。比如聚乙烯醇為表面含有游離官能基團羥基的人工合成的高分子物質；聚醯亞胺為表面含有可反應的官能基團氨基的人工合成的高分子物質；殼聚糖為表面含有游離官能基團氨基和羥基的天然高分子物質。等等。
此外，還要求載體在37℃下不能溶解於體液中而始終保持其外形。
配基是本發明吸附劑發揮功能的關鍵成分。該配基分子上應含有帶負電性的磺酸基和羧基。比如肝素，或者肝素衍生物(如硫酸肝素、乙醯肝素等等)，或者是類似肝素結構和功能的物質(如硫酸多聚糖等等)。
為了達到使用上的要求，每克所述載體上偶聯固定不低於2μg的所述配基。
除了上述吸附劑的主體成分(載體和配基)外，還需要偶聯劑的幫助將配基化學偶聯固定到載體上。
被固定到載體上的配基要更好地發揮其選擇性吸附LDL的功能，則應該降低該配基的空間受約束程度，這可以通過在配基和載體之間再連接上一種長鏈的分子，它主要起「空間臂」的作用，目的是起到降低配基的空間受約束性、增強配基的空間自由度。引入「空間臂」後，可以增強配基的空間自由度，更好地發揮功能，但是其製備路線將變得複雜且製備成本也將提高，故是否需要引入「空間臂」得視需要而定。所述的「空間臂」物質為兩端分別含有羥基或羧酸基或者氨基的長鏈型分子，比如聚乙二醇、聚氧化乙烯、己二胺、己二酸等。
為實現上述目的之二，本發明吸附劑的製備方法的步驟如下(1)取載體置於適量惰性溶劑中，然後加入過量的偶聯劑，(根據需要，有的反應體系須再添加適當適量的催化劑)，施加攪拌，在0～90℃下反應1～16小時。反應結束，將載體過濾出來，用大量清水反覆衝洗，將殘留的惰性溶劑和偶聯劑衝洗掉，此即得中間產物。此中間產物的特徵是偶聯劑分子上的一個官能基團與載體表面上的官能基團進行共價鍵化合，偶聯劑分子上另外的一個或者2個及以上未參加反應的官能基團則保留下來以作下一步反應之用。
所述的惰性溶劑指不參與反應的溶劑，根據不同反應體系的要求，其選擇不同，比如可用環己烷、1，4-二氧六環、水、二甲基甲醯胺、甲醯胺、二甲亞碸、乙酸乙酯等。
所述的偶聯劑指含有兩個或者以上官能基團的物質，這裡多指含2個官能基團的物質，比如二醛類、二酸類、二胺類、二異氰酸酯類，根據載體表面本身所含官能基團的不同，所選的偶聯劑種類也不同。通過估算載體表面所含官能基團的多少並結合化學反應式來確定所需偶聯劑的最小加入量。載體表面官能基團的最小量可以載體的此官能基團的總摩爾數的5％為最低測算量，故偶聯劑的最小加入量以載體中此官能基團的總摩爾數的5％為其測算量。
所述的溶劑適量指所加的溶劑量至少要將所加入的載體全部淹沒。因為載體的形狀不同，密度不同，相同質量的載體，淹沒其所需的溶劑量也有差別。
所述根據需要須再添加適當適量的催化劑，這裡的催化劑根據載體表面所含官能基團的不同、所用偶聯劑的不同，催化劑的選擇也有差別。所能涉及到的催化劑包括強酸類(比如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、苯磺酸等)，弱酸類(如乙酸、丙酸等)，錫鹽類(比如二月桂酸二丁基錫、二丁基氧化錫、馬來酸錫、氯化亞錫等)，碳化二亞胺類。所指的適量一般以反應物總量的0.001％～3.0％為宜。
(2)將(1)中所得的中間體置於惰性溶劑中，加入不低於載體質量0.005％的配基(如肝素)適量，然後在0～60℃下振蕩反應8～72h。(根據所採用反應體系的不同，有的反應體系需要再加入催化劑)。反應結束，過濾出載體，然後反覆清洗載體，再乾燥，即得目標吸附劑。
所述的清洗為用水衝洗、浸泡，或者用PBS緩衝液衝洗、浸泡，或者兩者的結合使用，目的為洗脫未被固定到載體上的游離配基。
所述的乾燥為在60℃以下的乾燥方式，比如風乾、低溫烘乾、冷凍乾燥、低溫減壓乾燥等。
所述的根據需要須再加入的催化劑，這裡的催化劑同前面(1)所述，根據反應體系的不同，所使用的催化劑有差別。
所述的惰性溶劑如(1)中所指，根據不同反應體系的要求，其選擇有異。
(3)如果需要引入「空間臂」，可在(1)中所得的中間體的基礎上，再連接上「空間臂」，然後再連接上偶聯劑，最後再連接上配基，即得引入「空間臂」後的吸附劑。其衝洗乾燥方式同(2)中所述。具體表述為以(1)中所得中間體為反應物，將之置於惰性溶劑中，加入「空間臂」物質，(必要時須再入催化劑)，在0～90℃下攪拌反應1～20h，反應結束，過濾掉溶劑，用純的惰性溶劑衝洗掉多餘的反應物即「空間臂」物質，即得連接了「空間臂」的中間體，然後又以該中間體為反應物，置於惰性溶劑中，加入偶聯劑，(必要時須再入催化劑)，在0～90℃下反應1～20h，反應結束，過濾，再用純的惰性溶劑衝洗掉多餘的偶聯劑後備用。
所述的起「空間臂」作用的物質在前面已說明。其用量為(1)中偶聯劑用量摩爾數的2倍為其最大用量。
所述的惰性溶劑及其用量同(1)中的說明。反應體系不同，所使用的溶劑類別也有差別。
所述的催化劑及其用量同(1)中的說明。反應體系不同，催化劑的選擇也有差別。
根據載體表面所含官能基團的不同，以及所使用的「空間臂」分子端官能基團的不同，在得到中間體2時，在某種情形下可以直接按照(2)中的步驟繼續進行。
基於上述敘述，本發明具有以下優勢和效果(1)選用表面富含官能基團的高分子(如聚乙烯醇)作為載體材料，為提高配基的固定量奠定了基礎。
(2)採用共價鍵結合方式固定配基，保留了配基分子上的活性基團羧基和磺酸基，使配基的特異性吸附LDL的功能基得到了保留和不受破壞；同時，由於共價結合方式的牢固性，保證材料在實際使用時配基不會脫落，增強了使用上的安全性。
(3)此吸附劑製備過程簡便、條件溫和，原料豐富，製作成本低廉。
以上的優勢在臨床治療上將表現為降低病人的治療費用，同時安全性得到了增強，且其效果又能達到臨床使用的要求，具有極大的可推廣和普及的可能性和意義。
具體實施例方式
現結合實施例，對本發明做進一步的描述。
實施示例1以人工合成的高分子物質聚乙烯醇為載體、以二醛類(戊二醛)為偶聯劑為例取15g聚乙烯醇，加入25g戊二醛，再加入強酸催化劑鹽酸600μL和溶劑環己烷80mL，然後在回流溫度78℃下攪拌反應6～8個小時。反應結束，過濾，用清水反覆清洗數次後，濾幹，再加入蒸餾水30mL和弱酸催化劑乙酸400μL，最後加入2mg肝素，在60℃以下輕搖反應10～12h。反應結束，清水反覆清洗，濾幹，再在60℃以下風乾即得。
實施示例2以人工合成的高分子物質聚乙烯醇為載體、以二異氰酸酯類(甲苯二異氰酸酯)為偶聯劑、引入「空間臂」聚乙二醇(PEG)為例取80克聚乙烯醇，加入200mL的溶劑N，N』-二甲基甲醯胺，加入40mL甲苯二異氰酸酯(TDI)，加入1mL催化劑二月桂酸二丁基錫(TDBAL)，在70℃下攪拌反應6h。然後傾濾，用無水的乙酸乙酯清洗數次。再加入200mL的乙酸乙酯，加入60g PEG6000，加入1mL催化劑TDBAL，在60℃下反應8h。然後用60℃的乙酸乙酯清洗數次。再加上肝素10mg，催化劑碳化二亞胺50mg，水100mL，在室溫下攪拌反應1～3天。反應完畢後在清水中衝洗，然後在磷酸緩衝液PBS＝7.4的緩衝液中浸泡10～16h以上。然後傾濾，清水衝洗，60℃以下風乾。
實施示例3以人工合成的高分子物質聚乙烯醇為載體、以二異氰酸酯類(甲苯二異氰酸酯)為偶聯劑、引入「空間臂」己二胺為例100g聚乙烯醇加30mL TDI，加1mL TDBAL，加溶劑乙酸乙酯150mL，在60℃下攪拌反應6h。然後傾濾，再用無水乙酸乙酯衝洗數次。加上30mL預先融化的己二胺，加無水乙酸乙酯100mL，在常溫下振蕩反應1h。然後傾濾，用無水乙酸乙酯清洗數次。再加上10mL TDI，加上100mL乙酸乙酯，在常溫下振蕩反應1h。傾濾，用無水乙酸乙酯衝洗。然後加上100mL甲醯胺，加上20mg肝素，加上1mL TDBAL，在37～40℃下反應12h。然後傾濾，清水衝洗，再在PH＝7.4的緩衝液中振蕩浸泡10～12h，再傾濾，清水衝洗，然後再在60℃以下風乾。
實施示例4以人工合成的高分子物質聚醯亞胺為載體、以二醛類(戊二醛)為偶聯劑為例取15g聚醯亞胺，加入20g戊二醛，再加入催化劑乙酸450μL和溶劑水20mL，然後在60℃下攪拌反應3～5個小時。反應結束，過濾，用清水反覆清洗數次後，濾幹，再加入蒸餾水20mL和催化劑乙酸400μL，最後加入1mg肝素，在60℃以下輕搖反應8～12h。反應結束，清水反覆清洗，濾幹，再在60℃以下風乾即得。
實施示例5以天然的水不溶性高分子物質殼聚糖為載體、以二醛類(戊二醛)為偶聯劑為例取15g殼聚糖，加入30g戊二醛，再加入催化劑乙酸450μL和溶劑水20mL，然後在60℃下攪拌反應3～5個小時。反應結束，過濾，用清水反覆清洗數次後，濾幹，再加入蒸餾水20mL和催化劑乙酸400μL，最後加入2mg肝素，在60℃以下輕搖反應10～14h。反應結束，清水反覆清洗，濾幹，再在60℃以下風乾即得。
實施示例6以人工合成的高分子物質聚乙烯醇為載體、以二醛類(戊二醛)為偶聯劑、以肝素及其衍生物(硫酸肝素)的混合物為複合配基為例取15g聚乙烯醇，加入25g戊二醛，再加入強酸催化劑鹽酸600μL和溶劑環己烷80mL，然後在回流溫度78℃下攪拌反應6～8個小時。反應結束，過濾，用清水反覆清洗數次後，濾幹，再加入蒸餾水30mL和弱酸催化劑乙酸400μL，最後加入2mg複合配基(肝素最容易獲取，因此複合配基中肝素佔50～70％)，在60℃以下輕搖反應10～16h。反應結束，清水反覆清洗，濾幹，再在60℃以下風乾即得。
實施示例7被固定了的肝素的含量檢測1對於不引入「空間臂」的情況，比如實施示例1，4，5，6，採用固定化肝素含量檢測的分析方法——甲苯胺藍法對被固定了的肝素含量進行分析，由於不引入空間臂，反應相對簡單，反應效率較高，肝素的固定量為每克吸附劑不低於10μg，滿足使用的需要。
實施示例8被固定了的肝素的含量檢測2對於引入「空間臂」的情況，比如實施示例2，3，採用固定化肝素含量檢測的分析方法——甲苯胺藍法對被固定了的肝素含量進行分析，由於引入「空間臂」，反應相對複雜、步驟多使得反應效率下降，肝素的固定量為每克吸附劑不低於2.2μg，滿足使用的需要。
實施示例9肝素固定在載體上的穩定性試驗取吸附劑100g，裝入吸附柱中，用400mL 37℃的PBS循環地動態流經吸附柱，循環4h後，結束循環，取最終的循環液用甲苯胺藍比色法進行檢測所脫落出來的肝素量。檢測結果表明，在該檢測方法的靈敏度範圍(0.1μg級)內未檢測到最終的循環液中存在脫落出來的游離肝素，此表明固定化的牢固性。
實施示例10單柱效率試驗取該吸附劑100克裝入吸附柱中。將400mL稀釋後的血漿(1份血漿+1份緩衝稀釋液)循環地通過該吸附柱。經過2～5h的動態濾過實驗，該血漿的LDL水平下降了40％以上。
實施示例11雙柱效率試驗取該吸附劑200克等量分裝入兩根吸附柱中。將400mL稀釋後的血漿(1份血漿+1份緩衝稀釋液)循環地通過此兩根吸附柱。經過≥2～5h的動態濾過實驗，該血漿的LDL水平下降了70％以上。
實施示例12引入「空間臂」的吸附劑A和不引入「空間臂」吸附劑B的效率對照試驗分別取吸附劑A，B各100克裝入吸附柱中。將400mL稀釋後的血漿(1份血漿+1份緩衝稀釋液)循環地通過該吸附柱。經過≥2h的動態濾過實驗，對於吸附劑A，該血漿的LDL水平下降了60％以上；對於吸附劑B，該血漿的LDL水平下降了40％以上。表明引入「空間臂」增強了配基的空間自由性從而提高了吸附效率，但以反應步驟增多、反應過程複雜、反應效率降低、製備成本增加為代價。
權利要求
1.一種低密度脂蛋白膽固醇的選擇性吸附劑，其特徵是其成分包括載體和功能配基兩大部分，其中載體為表面含有游離官能基團羥基和/或胺基的在37℃下不能溶解於體液中且始終保持其外形的天然的或者人工合成的高分子物質，配基包括肝素，肝素衍生物，或類肝素中的一種或兩種及以上的混合，配基通過偶聯劑偶聯固定在載體上，其中，每克載體上偶聯固定至少2μg配基。
2.根據權利要求1所述的一種低密度脂蛋白膽固醇的選擇性吸附劑，其特徵是表面含有游離官能基團羥基和/或胺基的天然的或者人工合成的高分子物質包括殼聚糖、聚乙烯醇、聚醯亞胺、聚氨酯。
3.根據權利要求1所述的一種低密度脂蛋白膽固醇的選擇性吸附劑，其特徵是所述肝素衍生物包括硫酸肝素、乙醯肝素；所述類肝素包括硫酸多聚糖。
4.一種製備如權利要求1所述的一種低密度脂蛋白膽固醇的選擇性吸附劑的方法，其特徵是包括以下步驟(1)取載體全部淹沒於惰性溶劑中，然後加入偶聯劑，或再添加適當適量的催化劑，施加攪拌，在0～90℃下反應1～16小時；反應結束，將載體過濾出來，用純的惰性溶劑反覆衝洗，將殘留的偶聯劑和/或催化劑衝洗掉，此即得中間產物備用；或(2)以(1)中所得中間體為反應物，將之置於惰性溶劑中，加入空間臂物質，或再添加適當適量的催化劑，在0～90℃下攪拌反應1～20h，反應結束，過濾掉溶劑，用純的惰性溶劑衝洗掉多餘的反應物即空間臂物質和/或催化劑，即得連接了空間臂的中間體，然後又以該中間體為反應物，置於惰性溶劑中，加入偶聯劑，或再添加適當適量的催化劑，在0～90℃下反應1～20h，反應結束，過濾，再用純的惰性溶劑衝洗掉多餘的偶聯劑和/或催化劑後備用；(3)將(1)或(2)中所得的產物置於惰性溶劑中，加入不低於載體質量0.005％的配基，然後在0～60℃下振蕩反應8～72h，反應結束，過濾出載體，然後反覆清洗載體，洗脫未被固定到載體上的游離配基和或催化劑，再乾燥，即得目標吸附劑。
5.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵是所述的惰性溶劑包括環己烷、1，4-二氧六環、水、二甲基甲醯胺、甲醯胺、二甲亞碸、乙酸乙酯。
6.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵是所述的偶聯劑指含有兩個或者以上官能基團的物質，包括二醛類、二酸類、二胺類、二異氰酸酯類。
7.根據權利要求4、6所述的製備方法，其特徵是偶聯劑的最小加入量以載體中所含官能基團的總摩爾數的5％為其測算量。
8.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵是步驟(3)中的所述的清洗為用水衝洗、浸泡，或者用PBS緩衝液衝洗、浸泡，或者兩者的結合使用；所述的乾燥為在60℃以下的乾燥方式，包括風乾、低溫烘乾、冷凍乾燥、低溫減壓乾燥。
9.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵是步驟(2)中的所述的空間臂物質為兩端分別含有羥基或羧酸基或者氨基的長鏈型分子，包括聚乙二醇、聚氧化乙烯、己二胺；其用量為步驟(1)中偶聯劑用量摩爾數的0～2倍。
10.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵是步驟(1)、(2)、(3)中的所述催化劑包括強酸類鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、苯磺酸；乙酸、丙酸；二月桂酸二丁基錫、二丁基氧化錫、馬來酸錫、氯化亞錫；碳化二亞胺類；催化劑用量以反應物總量的0.001％～3.0％。
全文摘要
本發明涉及一種低密度脂蛋白膽固醇的選擇性吸附劑，其成分包括載體和功能配基兩大部分，其中載體為表面含有游離官能基團羥基和/或胺基的天然的或者人工合成的高分子物質，配基包括肝素及其衍生物，或類肝素中一種或及其複合，配基通過偶聯劑偶聯固定在載體上。本發明還涉及吸附劑的製備。本發明選用表面富含官能基團的高分子為載體，採用共價鍵結合方式固定配基，保留了配基上的活性基團羧基和磺酸基，使配基的特異性吸附LDL的功能基得到了保留和不受破壞；同時保證材料在實際使用時配基不會脫落，增強了使用的安全性。此吸附劑製備過程簡便、製作成本低廉。在臨床治療上將表現為降低病人的治療費用，並且安全、有效。
文檔編號C07K1/22GK1923357SQ200610095179
公開日2007年3月7日 申請日期2006年9月28日 優先權日2006年9月28日
發明者麻開旺, 王翔, 蔡紹皙, 江衛寧, 高瑋, 田學隆 申請人:重慶大學