一種展示流感病毒非結構蛋白ns1的重組t4噬菌體及其應用的製作方法

2023-05-10 22:23:16 2

專利名稱：一種展示流感病毒非結構蛋白ns1的重組t4噬菌體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，更具體地，涉及展示流感病毒非結構蛋白NS1的重組T4噬菌體的構建、表達和應用。本發明還涉及該重組T4噬菌體在檢測流感抗體中的應用，特別是採用該重組T4噬菌體區分病毒感染禽群和疫苗免疫禽群。
背景技術：
禽流感(Avian Influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的禽類(家禽和野禽)的一種感染和/或疾病綜合症。發生在雞、鴨、鵝、鴿子等禽類和鳥類身上，但主要侵害火雞和雞，哺乳動物如豬、馬、海豹、人等也可感染。根據禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)株的致病性、禽的種類、環境、飼養管理條件以及並發疾病等因素，感染後的禽只表現為無症狀感染、輕度的上呼吸道症狀、產蛋量下降到急性的致病性死亡等多種形式，直接影響雞體的健康及其產品質量，是現代化養禽業難以對付的重要禽類呼吸道傳染病之一，與馬立克氏病、傳染性法氏囊病、白血病、網狀內皮增生症等一樣，也是嚴重威脅家禽的重要免疫抑制病。被世界動物衛生組織列為A類動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。
目前多採用「免疫」兼「撲殺」的措施來控制禽流感。中國大陸、墨西哥等國家和地區採用這一措施有效地控制了禽流感的流行。採用滅活疫苗免疫控制禽流感的方法越來越受到重視，越來越多的國家和地區採用免疫的方法。但隨之而來的一個問題是，免疫造成了對疫情監測的幹擾。因為傳統的監測禽流感的血清學方法主要是兩個一是瓊脂擴散試驗(AGP)，一是血凝抑制試驗(HI)。這兩種方法都不能區分禽流感疫苗免疫產生的抗體和禽流感病毒感染後產生的抗體。
禽流感病毒(AIV)為單股負鏈RNA病毒，屬於正黏病毒科A型流感病毒屬，A型流感病毒基因由8個不連續的病毒RNA節段組成。片段8即NS基因在8個片段中最短，編碼非結構蛋白，有兩個讀碼框，可編碼2種蛋白質即NS1和NS2，兩者的分子量分別為25kDa和14kDa。這兩種蛋白質大量存在於感染細胞中，NS1主要在核內，NS2主要在細胞漿內，在病毒粒子中存在少量的NS2蛋白成分。在感染的早期NS1被大量合成，而NS2在後期才會合成生產。在細胞感染的早期，可發現細胞核內有大量的NS1聚集，也可在細胞質內發現。作為病毒的非結構成分，這種蛋白的出現僅僅只局限在病毒感染期，而不會出現在成熟的禽流感病毒中，因而在使用滅活疫苗免疫時不會產生相應的抗體。因此，針對NS1蛋白的抗體只可能出現於野毒感染群中。從而可以將NS1及其抗體作為病毒感染機體的一個標記用以區分免疫群和感染群的鑑別診斷。
NS1的作用最近受到了研究者們極大的興趣。許多學者試圖用NS1的表達產物作為抗原來鑑別AIV感染禽群和免疫禽群。為了獲得大量純化的NS1蛋白，一般採用基因工程的方法來表達NS1基因。目前採用的方法一般是在大腸桿菌表達系統中表達NS1蛋白。本發明採用一種新的表達方法——噬菌體展示技術來獲得大量的具有活性的NS1蛋白。
噬菌體表面展示技術(phage display)是80年代發展起來的一項新的生物技術(Smith，1985)，它能將外源多肽和蛋白質以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，並保持相對獨立的空間構象和生物活性。T4噬菌體屬於有尾噬菌體中A群A2亞群的典型成員，其基本形態結構是頭長徑約95nm，橫徑約為65nm。T4噬菌體衣殼由3種必需衣殼蛋白組成主要的衣殼蛋白gp23和2個次要衣殼蛋白gp24、gp20。其中分子量為45kDa的gp23在每個病毒顆粒中有960個拷貝，而其餘2個次要衣殼蛋白拷貝數較少，gp24有55個拷貝，而gp20隻有12個拷貝。此外，在衣殼的外表面包被著2種非必需外殼蛋白分子量為9kDa的SOC和分子量為40kDa的HOC，二者相距7nm，以對稱的形式分布於噬菌體二十面體表面。SOC和HOC僅提供噬菌體額外的穩定能力，是在噬菌體衣殼裝配完成後才組裝到衣殼表面的，它們的缺失不影響T4噬菌體的繁殖和感染。將外源蛋白與T4噬菌體表面的SOC或者HOC蛋白形成融合蛋白，從而可以獲得具有外源蛋白的重組T4噬菌體。採用這樣的方法，獲得了表達愛滋病毒(HIV)gp120 V3肽、脊髓灰質炎病毒VP1(Ren et al，1996)、腦膜炎奈氏菌PorA(Jiang et al，1997)抗原蛋白、傳染性囊病病毒VP2(曹永長等，2003)、禽流感H5亞型和H9亞型HA蛋白(呂英姿等，2002)、口蹄疫VP1蛋白(史泉城等，2002)、雞新城疫病毒F蛋白和N蛋白(劉鈾等，2004)的重組T4噬菌體。

發明內容
(一)要解決的技術問題本發明的目的是獲得展示禽流感病毒非結構蛋白NS1的重組T4噬菌體，並採用該重組T4噬菌體作為抗原，區分禽流感滅活疫苗免疫動物和禽流感病毒感染動物的抗體，即區分疫苗免疫動物和病毒感染動物。
(二)技術方案本發明為一種展示流感病毒非結構蛋白NS1的重組T4噬菌體，是流感病毒非結構蛋白NS1與T4噬菌體SOC蛋白組成融合蛋白，位於重組T4噬菌體頭部表面。
本發明所述的重組T4噬菌體中，流感病毒非結構蛋白NS1為具有SEQ IDNO2所示序列的蛋白質；或具有SEQ ID NO2所示序列經改變、缺失或增加一個或若干個胺基酸殘基仍具有流感病毒非結構蛋白NS1活性的蛋白質；或與SEQ ID NO2所示的胺基酸序列有80％以上的同源性且具有流感病毒非結構蛋白NS1活性的蛋白質。
本發明所述的重組T4噬菌體中，編碼流感病毒非結構蛋白NS1的核苷酸序列為SEQ ID NO1；或SEQ ID NO1經改變、缺失或增加一個或若干個核苷酸仍表達具有流感病毒非結構蛋白NS1活性的蛋白質的序列；或與SEQID NO1所示核苷酸序列中連續200鹼基以上的區段有80％以上的同源性，且其表達產物仍具有流感病毒非結構蛋白NS1活性的核苷酸序列。
本發明還提供了所述的重組T4噬菌體的應用，將重組T4噬菌體作為抗原，直接免疫或將T4噬菌體與佐劑配合後製成疫苗免疫動物，獲得抗NS1的特異性抗體。
本發明的重組T4噬菌體應用，用於免疫的動物為兔、雞、鼠、山羊。
本發明所述的重組T4噬菌體的另一種應用，是以重組T4噬菌體作為抗原檢測動物血清中的禽流感特異性抗體，區分禽流感疫苗免疫動物和禽流感病毒感染動物的抗體，即區分流感病毒感染動物和流感病毒滅活疫苗免疫動物。
本發明中所述的應用，所使用的檢測方法是酶聯免疫吸附試驗。
本發明提供的重組T4噬菌體是採用基因重組的方法獲得的。其方法是(1)首先採用反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增NS1基因片段。提取禽流感病毒RNA，以F1(5′-ATG GAT TCC AAC ACT G-3′)和F2(5′-TCA AAC TTC TGA CTC-3』)為引物，在AMV反轉錄酶作用下合成NS1基因的cDNA，獲得RT產物。RT產物用作PCR擴增NS1基因片段的模板，以P1(5′-ATG AAT TCT ATG GAT TCC AAC ACT G-3′)和P2(5′-ATG AATTCG TCA AAC TTC TGA CTC-3′)為引物，按常規PCR方法擴增NS1基因，反應條件為94℃預變性3min；94℃變性40s，50℃退火90s，72℃延伸90s，循環30次；最後72℃延伸10min。PCR產物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。
(2)採用pR質粒(Ren et al，1996；任兆鈞，2004，CN1523114A)構建重組質粒pR-NS1。用EcoR I在37℃消化NS1基因的PCR純化產物，用EcoR I和CIAP在37℃消化質粒pR，接著在T4連接酶的作用之下，連接酶切回收後的NS1 PCR產物和質粒pR，連接產物轉化到大腸桿菌DH5α。轉化方法為常規CaCl2法。經氨苄青黴素(Amp)抗性篩選，獲得了插入NS1基因的重組子。然後用兩對特異性引物SOC-S(GAA TCA TAT GGC TAG TCT CGCGG)/P2和P1/P2進行PCR篩選。挑取單菌落接種於3mL LA/Amp培養液中，在37℃以200r/m振搖培養16-20小時。對PCR篩選陽性的細菌，離心收集菌體，抽提質粒，再經限制性內切酶消化鑑定和序列測定，獲得重組質粒pR-NS1。
(3)將重組質粒pR-NS1和缺陷性T4噬菌體T4-Z1(Ren et a1，1996；任兆鈞，2004，CN1523114A)進行同源重組，獲得展示NS1蛋白的重組T4噬菌體。
先用重組質粒pR-NS1轉化大腸桿菌DH5α，獲得的大腸桿菌記為E-NS1。然後進行以下操作在裝入500μL SC培養液的器皿中加入1μL氨卞青黴素(Amp)，然後加入10μL E-NS1，在37℃培養至光密度值OD600大約為0.5時，加入50μLT4-Z1，在35℃ 200r/m振搖培養至有細菌碎片出現。
在1個經高壓滅菌(15lpf/in2，20min)的試管中分別加入600μL培養超過12小時的新鮮大腸桿菌DH5α，不加溶菌酶，將在2-10℃儲存的高壓滅菌(15lpf/in2，20min)過的SC頂層培養基放在微波爐中溶解，待瓊脂溫度降到55℃左右的時候取2mL倒入裝有大腸桿菌DH5α的試管中。將混合液在旋渦震蕩器上混勻，立即倒在平皿上。等到瓊脂完全冷凝時，在SC頂層培養基上分別點10μL培養12小時以上的E-NS1細菌裂解液，待吸收完畢後，放在37℃培養16小時以上。
如果E-NS1中的質粒與T4-Z1發生了重組，成功地將NS1基因轉入T4噬菌體中，則在沒有加溶菌酶的平皿上可以生長出噬菌斑。重新鋪SC平板培養基，然後用滅菌牙籤把生長出的噬菌斑在SC板上點梅花斑。放在37℃培養12小時以上。生長良好的梅花斑用消毒好的刀片將其剝下，浸泡在磷酸緩衝液中6小時以上。
採用PCR篩選T4噬菌體轉化子。用特異性引物P1/P2從陽性梅花斑浸泡液中擴增到特異性條帶，則說明已獲得了展示NS1蛋白的重組T4噬菌體。
SC培養液按下列方法配製每1000mL中含有10g Tryptone和5g NaCl，加雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min後4℃保存。
SC底層培養基按下列方法配製每1000mL中含有10g Tryptone，5gNaCl和12g瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min，冷卻至50℃，加入滅菌的50mL 1mol/L Tris-HCl(pH7.5)和10mL 25％檸檬酸鈉·2H2O溶液，搖勻後倒平板，4℃保存。
SC頂層培養基按下列方法配製每1000mL中含有10g Tryptone，5gNaCl和7g瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min，4℃保存。用時加熱溶解，冷卻至50℃，加入滅菌的50mL 1mol/L Tris-HCl(pH7.5)和10mL 25％檸檬酸鈉·2H2O溶液，搖勻後備用。
(三)有益效果本發明具有明顯的優點和效果。本發明提供的重組T4噬菌體易於純化，展示在T4噬菌體表面的NS1蛋白具有完整的空間構象。由於SOC位點在T4噬菌體頭部表面具有960個拷貝，所以與SOC融合表達的NS1蛋白的拷貝數高。由於NS1蛋白分布於T4噬菌體頭部表面，因而T4噬菌體本身充當了NS1蛋白的載體，當本發明提供的重組T4噬菌體作為抗原時，NS1的免疫原性比單獨的NS1蛋白強。作為疫苗的抗原、或者作為免疫檢測的抗原使用時，和其它的蛋白表達系統表達的NS1蛋白相比，本發明所述的重組T4噬菌體具有明顯的優點。


圖1為NS1基因的PCR擴增產物電泳圖。M為DNA分子量標準DL2000DNA Marker；1-4為NS1基因PCR擴增產物；圖2為pR-NS1重組子的篩選結果。NS1基因的PCR產物大小為678bp；SOC-NS1融合基因的PCR產物大小約900bp。M為DL2000 DNA Marker，1、5為同一轉化子，2、6為同一轉化子，3、7為同一轉化子，4、8為同一轉化子，其中1、2、3、4為P1/P2特異性引物擴增的PCR產物，5、6、7、8為SOC-S/P2特異性引物擴增的PCR產物；圖3為重組整合質粒pR-NS1的構建示意圖。pR表示整合質粒，pR-NS1表示插入了NS1基因的重組整合質粒。Ampr表示氨卞青黴素抗性，Kpr表示卡那黴素抗性。e、soc、den V都是T4噬菌體上的基因。EcoR I、BamH I、Nde I、HindIII、Pst I、Pvu I是質粒上的限制性內切酶位點；圖4為NS1蛋白在重組T4噬菌體SOC位點展示模式圖。A為重組整合質粒pR-NS1；B為缺陷型T4噬菌體T4-Z1；C為重組後攜帶有目的基因NS1的重組T4噬菌體T4-NS1；圖5為重組T4噬菌體的PCR鑑定結果圖。泳道1-8是含有NS1基因的重組噬菌體的PCR產物，M為分子量標記；圖6為重組噬菌體T4-NS1的免疫印跡(Western blot)檢測圖。M為預染色的蛋白質分子量標準；1為重組噬菌體T4-NS1。
具體實施例方式
實施例1 採用反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增NS1基因片段按照RizolLS Reagent說明書(GibcoBRL公司產品)提取禽流感H5N1亞型病毒的RNA，以F1(5′-ATG GAT TCC AAC ACT G-3′)和F2(5′-TCA AACTTC TGA CTC-3′)為引物，在AMV反轉錄酶(TaKaRa公司產品)作用下合成NS1基因的cDNA，獲得RT產物。RT反應條件如下42℃ 60min，然後95℃ 3min。RT產物用作PCR擴增NS1基因片段的模板，以P1(5′-ATG AATTCT ATG GAT TCC AAC ACT G-3′)和P2(5′-ATG AAT TCG TCA AAC TTCTGA CTC-3′)為引物，按常規PCR方法擴增NS1基因，反應條件為94℃預變性3min；94℃變性40s，50℃退火90s，72℃延伸90s，循環30次；最後72℃延伸10min。PCR產物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察到特異性條帶(圖1)。結果表明，成功擴增得到了NS1的基因片段。
實施例2 重組質粒pR-NS1的構建採用pR質粒(任兆鈞，2004，CN1523114A)構建重組質粒pR-NS1，其構建過程如圖3所示。用EcoR I在37℃消化NS1基因的PCR產物，用EcoR I和CIAP在37℃消化質粒pR，接著在T4連接酶的作用之下，連接消化的NS1的PCR產物和質粒pR。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α。轉化方法為常規CaCl2法。經Ampr抗性篩選，獲得插入了NS1基因的重組子。然後用兩對特異性引物SOC-S(GAATCA TATGGCTAGTCTCGCGG)/P2和P1/P2進行PCR篩選(圖2)。挑取單菌落接種於3mL LA培養基中，37℃，200r/m振搖培養16-20小時，對PCR篩選陽性的細菌，8000r/m離心收集菌體，用E.Z.N.A.Plasmid Minipreps Kit(Omega公司產品)抽提質粒，再經限制性內切酶消化鑑定和序列測定，獲得重組質粒，鑑定正確的重組質粒命名為pR-NS1。
實施例3 重組噬菌體T4-NS1的獲得用重組質粒pR-NS1和缺陷性T4噬菌體T4-Z1(任兆鈞，2004，CN1523114A)進行同源重組，獲得展示NS1蛋白的重組T4噬菌體。其構建過程如圖4所示。先將重組質粒pR-NS1轉化到大腸桿菌DH5α，獲得的大腸桿菌記為E-NS1。然後進行以下操作在裝入500μL SC培養液的器皿中加入1μL氨卞青黴素(Amp)，然後加入10μL E-NS1，在37℃培養至光密度值OD600大約為0.5時，加入50μLT4-Z1，在35℃ 200r/m振搖培養至有細菌碎片出現。
在1個經高壓滅菌(15lpf/in2，20min)的試管中分別加入600μL培養超過12小時的新鮮大腸桿菌DH5α，不加溶菌酶，將在2-10℃儲存的高壓滅菌(15lpf/in2，20min)過的SC頂層培養基放在微波爐中溶解，待瓊脂溫度降到55℃左右的時候取2mL倒入裝有大腸桿菌DH5α的試管中。將混合液在旋渦震蕩器上混勻，立即倒在已鋪有SC底層培養基的平皿上。等到瓊脂完全冷凝時，在SC頂層培養基上分別點10μL培養12小時以上的E-NS1細菌裂解液，待吸收完畢後，放在37℃培養16小時。
如果E-NS1中的質粒與T4-Z1發生了重組，成功地將NS1基因轉入T4噬菌體中，則在沒有加溶菌酶的平皿上可以生長出噬菌斑。重新鋪SC平板培養基，然後用滅菌牙籤把生長出的噬菌斑在SC板上點梅花斑。放在37℃培養12小時以上。生長良好的梅花斑用消毒好的刀片將其剝下，浸泡在磷酸緩衝液中6小時。
採用PCR篩選T4噬菌體轉化子。用特異性引物P1/P2從陽性梅花斑浸泡液中擴增到特異性條帶(圖5)，則說明已獲得了展示NS1蛋白的重組T4噬菌體。
SC培養液按下列方法配製每1000mL中含有10g Tryptone和5g NaCl，加雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min後4℃保存。
SC底層培養基按下列方法配製每1000mL中含有10g Tryptone，5gNaCl和12g瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min，冷卻至50℃，加入滅菌的50mL 1mol/L Tris-HCl(pH7.5)和10mL 25％檸檬酸鈉·2H2O溶液，搖勻後倒平板，4℃保存。
SC頂層培養基按下列方法配製每1000mL中含有10g Tryptone，5gNaCl和7g瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min，4℃保存。用時加熱溶解，冷卻至50℃，加入滅菌的50mL 1mol/L Tris-HCl(pH7.5)和10mL 25％檸檬酸鈉·2H2O溶液，搖勻後備用。
實施例4 用禽流感病毒直接感染小鼠製備小鼠抗禽流感抗體將30隻小鼠分成3組，每組10隻，飼養於隔離器中，每日飼餵滅菌的飲水和飼料。8周齡左右時接種病毒。其中一組用活的H5N1亞型禽流感病毒經肌肉注射感染小鼠，每隻小鼠0.2ml活病毒(病毒HA滴度為1∶28)；首次感染後第9天，再用同樣劑量的病毒感染一次。另一組按同樣的劑量、同樣的方式用活的H9N2亞型禽流感病毒感染小鼠(病毒HA滴度為1∶29)。第三組按同樣的劑量、同樣的方式接種禽流感滅活疫苗(肇慶大華農生物科技有限公司產品)。首次接種後15天，對小鼠進行眼球採血，常規方法製備血清，採用血凝抑制實驗(HI)測定其抗體水平，HI效價為8log2以上。將血清樣品分裝後置-20℃保存備用。
實施例5 重組噬菌體的免疫印跡(Western Blot)分析大量培養重組噬菌體T4-NS1，離心，按常規法用PEG/NaCl濃縮，當噬菌體滴度達到1011pfu/mL時，進行SDS-PAGE檢測。SDS-PAGE方法如下取重組噬菌體T4-NS1和T4噬菌體SOC缺失株T4-Z1各100μL，然後加入2×上樣緩衝液100μL，混勻後，樣品在-80℃冰箱和37℃烘箱內分別凍融三次。參照汪家政等(2000)編《蛋白質手冊》方法製備SDS-聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE)。積層膠濃度為5％，分離膠濃度為12％。將待檢樣品煮沸5min，取30μL加入凝膠點樣孔中，在電場作用下進行電泳。電泳緩衝液為Tfis-甘氨酸。電壓為80v/cm，待溴酚藍到達積層膠底部時電壓升高到160v/cm。待溴酚藍接近凝膠底部時，停止電泳，取下凝膠。接著進行免疫印跡(WesternBlot)分析。
Western Blot分析方法如下SDS-PAGE電泳結束後，不對凝膠進行染色。剪一張與凝膠相同大小的硝酸纖維素膜及兩張濾紙，與電泳之後的凝膠一起在室溫浸泡在轉移緩衝液中15min，按海綿-濾紙-凝膠-硝酸纖維素膜-濾紙-海綿的順序安裝轉印夾。將轉印夾中有膜的一側接正極，並在15V的電壓下轉移1.5小時。轉移後的膜用5％脫脂奶粉4℃封閉過夜，棄去封閉液，用TBS洗膜3次。棄去TBS，加入用1％脫脂奶粉/PBS以1∶100倍稀釋的禽流感病毒感染的小鼠血清(一抗)，溫和振搖3小時。棄去一抗，用TBS洗膜3次，每次約10min。棄去TBS，加入用1％脫脂奶粉/PBS以1∶1000倍稀釋的二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG抗體，珠海百奧公司)，溫和振搖至少1小時。棄去二抗，用TBS洗膜3次，每次約30min。棄去TBS，加入DAB溶液顯色，輕搖硝酸纖維素膜，待顯色達一定程度，用雙蒸水洗膜終止顯色反應。在39kDa位置可見一特異性條帶(圖6)。
實施例6 用重組噬菌體免疫小鼠製備小鼠抗NS1抗體將重組噬菌體製備成油乳劑疫苗，每ml含有1×1010pfu以上的重組噬菌體。將10隻小鼠飼養於隔離器中，每日飼餵乾淨的飲水和飼料。8周齡左右時用重組噬菌體油乳劑疫苗免疫小鼠，每隻小鼠0.2ml，首次免疫14天後，再用同樣劑量的疫苗加強免疫一次。加強免疫後14天，對老鼠進行眼球採血，常規方法製備血清，獲得的血清樣品分裝後置-20℃保存備用，並用ELISA檢測小鼠血清中NS1抗體水平。
實施例7 用重組T4噬菌體作為抗原檢測小鼠血清中NS1抗體以重組T4噬菌體為包被抗原，用ELISA檢測NS1抗體。ELISA程序如下將重組T4噬菌體用PBST(PBS，pH7.2，含0.05％吐溫20)稀釋為1×108pfu/ml，每孔加入100μL稀釋的重組T4噬菌體，4℃放置12小時以上。用清洗緩衝液(PBS，pH7.2，含0.05％吐溫20)洗3次後，每孔加入100μL5％的脫脂奶粉/PBS，37℃放置2小時。用清洗緩衝液洗3次後，每孔加入100μL用1％脫脂奶粉/PBS稀釋100倍的小鼠血清，37℃反應1小時。再用清洗緩衝液洗3次後，每孔加入100μL用1％脫脂奶粉/PBS稀釋1000倍的辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG抗體(珠海百奧公司)，37℃反應1小時。用清洗緩衝液洗3次後，每孔加入顯色液(10mg TMB溶於10ml無水乙醇)100μL，室溫觀察顏色變化。在20min時達到顯色高峰，每孔加入100μL終止液(1mol/L H2SO4)，終止顯色反應，在酶標儀上讀取OD450值。計算樣品檢測值(P)與陰性血清檢測值(N)的比值P/N，P/N值大於2.1時，判定為陽性。
用該方法檢測小鼠血清，發現禽流感病毒感染的小鼠血清和重組噬菌體油乳劑疫苗免疫的小鼠血清，其P/N值均大於2.1，判定為陽性；而禽流感滅活疫苗免疫的小鼠血清的P/N值小於2.1，判定為陰性(表1)。
表1小鼠血清ELISA檢測結果

實施例8 用重組T4噬菌體作為抗原檢測雞血清中NS1抗體ELISA程序如下將重組T4噬菌體用PBST(PBS，pH7.2，含0.05％吐溫20)稀釋為1×108pfu/ml，每孔加入100μL稀釋的重組T4噬菌體，4℃放置12小時以上。用清洗緩衝液(PBS，pH7.2，含0.05％吐溫20)洗3次後，每孔加入100μL 5％的脫脂奶粉/PBS，37℃放置2小時。用清洗緩衝液洗3次後，每孔加入100μL用1％脫脂奶粉/PBS稀釋100倍的雞血清，37℃反應1小時。再用清洗緩衝液洗3次後，每孔加入100μL用1％脫脂奶粉/PBS稀釋1000倍的辣根過氧化物酶標記的山羊抗雞IgG抗體(美國Sigma公司)，37℃反應1小時。用清洗緩衝液洗3次後，每孔加入顯色液(10mg TMB溶於10ml無水乙醇)100μL，室溫觀察顏色變化。在20min達到顯色高峰，每孔加入100μL終止液(1mol/L H2SO4)，終止顯色反應，在酶標儀上讀取OD450值。計算樣品檢測值(P)與陰性血清檢測值(N)的比值P/N，P/N值大於2.1時，判定為陽性。
該方法具有良好的特異性。用該方法檢測雞新城疫(ND)特異性血清、雞腦脊髓炎(AE)特異性血清、雞傳染性支氣管炎(IB)特異性血清、雞傳染性喉氣管炎(ILT)特異性血清、雞傳染性囊病(IBD)特異性血清，無交叉反應性。對採自現場的84份雞血清樣品進行檢測，檢出陽性66份，陰性18份(表2)。
表2雞血清ELISA檢測結果


序列表110華南農業大學120一種展示流感病毒非結構蛋白NS1的重組T4噬菌體及其應用130SEQ ID NO11601170PatentIn version 3.32101211654212DNA213Avian influenza virus4001atggattcca acactgtgtc aagtttccag gtagactgct ttctttggca tgtccgcaaa60
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110華南農業大學120一種展示流感病毒非結構蛋白NS1的重組T4噬菌體及其應用130SEQ ID NO21601170PatentIn version 3.32101211217212PRT213Avian influenza virus4001Met Asp Ser Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp1 5 10 15
His Val Arg Lys Arg Phe Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe20 25 30Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Lys Gly Arg Gly Ser35 40 45Thr Leu Gly Leu Asp Ile Arg Thr Ala Thr Arg Glu Gly Lys His Ile50 55 60Val Glu Arg Ile Leu Glu Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr65 70 75 80Thr Ala Ser Val Pro Ala Pro Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu85 90 95
Glu Met Ser Lys Asp Trp Leu Met Leu Ile Pro Lys Gln Lys Val Thr100 105 110Gly Ser Leu Cys Ile Arg Met Asp Gln Ala Ile Val Asp Lys Asn Ile115 120 125Thr Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val Ile Phe Asn Arg Leu Glu Ala Leu130 135 140Ile Leu Leu Arg Ala Phe Thr Asp Glu Gly Thr Ile Val Gly Glu Ile145 150 155 160His Thr Asp Glu Asp Val Lys Asn Ser Pro Leu Pro Ser Leu Pro Gly165 170 175Ala Ile Gly Val Leu Ile Gly Gly Phe Glu Trp Asn Asp Asn Thr Val180 185 190
Arg Val Ser Glu Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Asn Ser Asp Glu195 200 205Asn Gly Arg Pro Pro Leu Pro Pro Lys210 21權利要求
1.一種展示流感病毒非結構蛋白NS1的重組T4噬菌體，其特徵在於蛋白NS1與T4噬菌體SOC蛋白組成融合蛋白，位於重組T4噬菌體頭部表面。
2.根據權利要求1所述的重組T4噬菌體，其特徵在於流感病毒非結構蛋白NS1為1)具有SEQ ID NO2所示序列的蛋白質；2)具有SEQ ID NO2所示序列經改變、缺失或增加一個或若干個胺基酸殘基仍具有流感病毒非結構蛋白NS1活性的蛋白質；或3)與SEQ ID NO2所示的胺基酸序列有80％以上的同源性且具有流感病毒非結構蛋白NS1活性的蛋白質。
3.根據權利要求1或2所述的重組T4噬菌體，其特徵是編碼流感病毒非結構蛋白NS1的核苷酸序列為1)SEQ ID NO1；2)SEQ ID NO1經改變、缺失或增加一個或若干個核苷酸仍表達具有流感病毒非結構蛋白NS1活性的蛋白質的序列；或3)與SEQ ID NO1所示核苷酸序列中連續200鹼基以上的區段有80％以上的同源性，且其表達產物仍具有流感病毒非結構蛋白NS1活性的核苷酸序列。
4.一種製備抗NS1的特異性抗體的方法，其特徵在於將任意權利要求1-3的重組T4噬菌體作為抗原，直接免疫或將T4噬菌體與佐劑配合後製成疫苗免疫動物，獲得抗NS1的特異性抗體。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵是用於免疫的動物為兔、雞、鼠、山羊。
6.一種體外檢測動物血清中禽流感特異性抗體的方法，其特徵在於將任意權利要求1-3的重組T4噬菌體作為抗原與動物血清反應，然後檢測反應結果來評價血清中抗體是否存在。
7.根據權利要求6所述的方法，其中檢測方法採用酶聯免疫吸附法。
全文摘要
本發明涉及一種展示流感病毒非結構蛋白NS1的重組T4噬菌體，該重組T4噬菌體展示流感病毒非結構蛋白NS1與T4噬菌體SOC蛋白的融合蛋白。本發明進一步涉及重組T4噬菌體在檢測流感抗體中的應用。本發明提供的重組T4噬菌體易於純化，展示在T4噬菌體表面的NS1蛋白具有完整的空間構象；與SOC融合表達的NS1蛋白的拷貝數高；T4噬菌體本身充當了NS1蛋白的載體；當本發明提供的重組T4噬菌體作為抗原時，NS1的免疫原性比單獨的NS1蛋白強；作為疫苗的抗原、或者作為免疫檢測的抗原使用時，和其它的蛋白表達系統表達的NS1蛋白相比具有明顯的優點。
文檔編號C07K16/18GK1800376SQ20051012641
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月8日 優先權日2005年12月8日
發明者曹永長, 謝青雲, 陳麗, 馬靜雲, 畢英佐 申請人:華南農業大學