一種編碼阿爾法－海螺毒素肽的基因及其應用的製作方法
2023-05-11 02:35:01 4
專利名稱：一種編碼阿爾法－海螺毒素肽的基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及多肽化合物阿爾法一海螺毒素肽Vc1.1的基因工程及其在製藥中的應用，屬於生物領域。
背景技術：
臨床中使用嗎啡等藥物來緩解癌痛、神經痛等頑固性疼痛會造成耐受、藥效短暫以及成癮等狀況，因此具有很大的局限性。自第一個鎮痛效果強於嗎啡1000倍的鎮痛藥物Ziconotide成功上市以來，其有效成分歐米加海螺毒素MV II A受到了生物醫藥界的極大關注。除此之外，有數種其它的海螺毒素也具有不成癮、低耐受的鎮痛效果。例如阿爾法—海螺毒素Vc1.1，它是一個由十六個胺基酸組成的多肽，具有拮抗神經元型菸鹼樣乙醯膽鹼受體(nAChr)的活性。該受體與痛覺的傳導相關，抑制該受體可以起到鎮痛作用，且在神經細胞受到傷害後，能夠加速神經損傷的恢復[Sandall DW，Satkunanathan N，Keays D A，et al.A novel R-Conotoxin identified by gene sequencing isactive in suppressing the vascular response to selective stimulation of sensory nerves in vivo，Biochemistry，2003，426904-6911]。與MV II A比較起來，Vc1.1具有如下特點(1)鎮痛效果強；(2)鎮痛持續時間長久；(3)給藥方便海螺毒素MVIIA的藥靶位於中樞神經系統，因此需顱內給藥或椎管注射，這大大限制了其使用，而Vc1.1可通過皮下注射、靜脈注射、肌肉注射和腹腔注射等發揮其鎮痛效果，這是由於Vc1.1的所作用的神經元型nAChr位於外周神經系統；(4)低耐受性，無成癮性；(5)副作用小這是由於Vc1.1藥靶確切、作用位點專一、用量低；(6)用途廣泛適用於所有的阿片類藥敏感型和不敏感型的疼痛，特別是癌痛、愛滋病痛、神經痛、糖尿病相關疼痛以及風溼引起的疼痛等[Satkunanathan N，Livett B，Gayler K，et al.Alpha-conotoxin Vc1.1 alleviatesneuropathic pain and accelerates functional recovery of injured neurones，Brain Research，2005，1059(2)149-158]。
由於天然Vc1.1的產量極少，工業化生產必須通過化學合成或基因工程方法來製備。化學合成反應步驟多、副產物多、純化技術複雜，對環境汙染大、對車間工人的健康不利，因此具有較高的製造成本。儘管採用基因工程方法可以克服化學合成的許多缺點，但目前在工藝上實現起來仍面臨許多挑戰(1)Vc1.1是16個胺基酸的小肽，分子量僅1.7kD左右，在復性或純化的過程中，均沒有針對此截留分子量的透析袋或超濾膜供選擇；(2)沒有簡便易行的方法對其進行鑑定和檢測由於分子量小，在SDS-PAGE電泳中很難聚集成一條窄帶，即使Tricine電泳也並非每次都能成功，此外，小分子量區的蛋白Marker難以購買且價格昂貴；(3)Vc1.1是富含二硫鍵的肽，這使其復性更加困難，而目前可供選擇的復性方法中必須用到低截留分子量的透析袋或超濾膜，由前所述，這難以實現；(4)由於分子量小，誘導表達中很容易被細菌胞內蛋白酶降解，難以單獨表達，因此必須考慮串聯表達或融合表達，這些方法都需切割表達產物以獲得目標分子。目前基因工程中用於切割蛋白的主要途徑有溴化氰裂解或凝血酶切割等溴化氰專一地裂解蛋白質中甲硫氨酸處的肽鍵，但試劑本身有劇毒，在製藥工業使用上受到嚴格的限制，且下一步還需要花費較高的成本來去除溴化氰；凝血酶價格較貴、酶切特異性差且容易變性失活。
可能由於存在上述技術瓶頸，目前未見基因工程法製備Vc1.1或與其類似的富含二硫鍵的小肽化合物的報導。
發明內容
技術問題本發明的目的是針對生產上述鎮痛藥物的現有技術基礎及其局限性，公開一種適用於本方法的Vc1.1基因及其應用。這種基因工程工藝使得從菌體裂解物中製備純度95％以上的Vc1.1僅需吸附、復性、酶切、洗脫這4個主要步驟即可，因此在大規模生產和臨床應用具有很強的競爭力。
技術方案一種編碼阿爾法一海螺毒素肽Vc1.1的基因，其特徵是，該基因的編碼鏈具有如下的核苷酸序列5』GGTTGCTGCTCTGACCCGCGTTGCAACTACGACCACCCGGAAATCTGCTAA3』。
根據大腸桿菌密碼子的偏好性，設計能夠以正確的讀碼框插入pET-32a(+)載體KpnI和EcoRI限制性酶切位點之間的核苷酸序列ggtaccgac gac gac gac aagGGTTGCTGCTCTGACCCGCGTTGCAACTACGACCACCCGGAAATCTGCtaagaattc(順序為5』到3』)。其中，下劃線部分為限制性酶切位點，斜體部分為腸激酶酶切位點，大寫字母部分為編碼區。這樣設計使得Vc1.1基因編碼區能夠以正確的讀碼框插入腸激酶位點和EcoRI酶切位點之間。合成上述序列的雙鏈，並製造KpnI和EcoRI的粘性末端，按照分子克隆中常規的雙酶切技術，將所得核苷酸序列整合入pET-32a(+)載體KpnI和EcoRI限制性酶切位點之間。測序驗證讀碼框正確性和插入的正確性，從而獲得重組載體pET-32-Vc1.1。上述幾個步驟示於圖1。
將重組載體轉化入大腸埃希氏桿菌BL21(DE3)(購於天為時代公司)，獲得重組基因工程菌株EBVc1.1。在T7強啟動子的開啟表達作用下，經過低溫24h誘導後，表達的Trx-Vc1.1融合蛋白(硫氧還原蛋白-Vc1.1融合蛋白)可佔菌體總蛋白的50％以上。破碎菌體後，立即將該融合蛋白結合到Ni2+親和層析柱(Ni-NTA或Ni-IDA)上，隨後用空氣飽和的復性緩衝液(20mM Tris-HCl；0.5M精氨酸；50mM NaCl；pH8.0)洗滌浸泡24h，用腸激酶酶切緩衝液(20mM Tris-HCl；2mM CaCl2；50mM NaCl；pH7.4)洗滌浸泡12h以上，按照每單位腸激酶切割5mg融合蛋白的用量將酶加入柱內，室溫反應24h進行充分酶切，期間循環流動酶切緩衝液讓其混勻，待柱子的顏色從淡藍色變為白色或米黃色之後，洗脫即可獲得具生物活性的Vc1.1。最後還可以對產物C末端用絲氨酸型羧肽酶進行醯胺化從而獲得更高活性和更強穩定性的Vc1.1。
上述的基因在製備鎮痛藥物中的應用醋酸扭體實驗證明，採用本發明中的方法製得的Vc1.1具有與天然Vc1.1同樣的生物活性在腹腔注射0.1μM濃度的肽溶液0.5mL/20gbw的藥物後，在1h、4h和16h時刻均具有於天然Vc1.1類似的顯著鎮痛活性(圖3)。且鎮痛效果以及作用時間均顯著強於已經上市的藥品Ziconotide(MVIIA)。
除Vc1.1以外，本系統適合於各種具有鎮痛活性的海螺毒素肽的製備，包括各種阿爾法類或歐米加類海螺毒素。同時，本系統也有助於各類富含二硫鍵的肽的製備。
有益效果基因工程中的克隆、誘導表達和破碎菌體並不是本發明所要解決的核心問題。重點部分在於創造了一種具有6個組氨酸結構的融合蛋白，該蛋白的結構用「Trx-6His--EK-Vc1.1」式表示。其中，EK為腸激酶酶切位點，而為防止6His吸附位點與Vc1.1距離太近而影響復性，在EK與6His間還存在pET-32a(+)載體本身表達的柔性序列，用在上述結構示意式中用「--」表示。6His與Ni-NTA或Ni-IDA樹脂具有很強的吸附作用，同時這種樹脂具有相當大的載量，使得表達的融合蛋白能牢固地、大量地結合在柱上。經柱上復性和腸激酶酶切之後，具有正確構象的Vc1.1分子被洗脫，而Trx蛋白則以「Trx-6His--EK-」的形式仍吸附在層析柱上，這樣的過程很方便地實現了目標蛋白的復性以及融合蛋白中目標蛋白與非目標蛋白的分離。隨後，用250mM的咪唑將「Trx-6His--EK-」洗脫後，該層析柱還可以繼續使用。經實驗證實，Ni-NTA經洗滌和再生可以反覆使用500次以上。
這種首創的將6His結構置於兩個組分之間的融合蛋白構建方式在表達、復性並純化這類富含二硫鍵的鎮痛小肽上具有以下突出優點1主要操作都在親和層析柱上進行全部的純化方法僅需要進行吸附、復性、酶切、洗脫四個步驟，大大減少儀器設備、人員、原料和能源的投入。使得產物純化步驟少。
本方法的核心部件是金屬離子親和層析柱。這是一種可以反覆再生且吸附6His效果優良的層析柱。其特點是載量大本工藝中1mLNi-NTA樹脂可以結合8mg重組蛋白；6His與柱子結合牢固本工藝中融合蛋白浸泡72h之後，仍然沒有任何物質能夠被酶切緩衝液洗脫。
在酶切過程中，柱子的顏色可很方便地作為判定酶切是否完全的依據。Ni-NTA在結合融合蛋白之後呈現淡藍色，隨逐漸被切下來的Vc1.1釋放並游離到填料間質溶液空間中，原本的淡藍色會逐漸轉變為白色或米黃色，此時，進行洗脫即可獲得具生物活性的Vc1.1。
2產物純度高利用本發明中的製備方法所得產物經反相HPLC檢測(圖2)，將峰面積積分後計算得知，一次純化的純度可達95.4％。該實驗檢測波長為215nm，上樣量100μL，乙腈洗脫濃度從0％到100％，柱型為SOURCE 5RPC ST。由圖可見所得產物具有較高的純度。相對於化學合成製備方法和一般的基因工程發酵，本方法制可顯著降低下遊的純化成本。
3易於對目標產物在高濃度下進行低試劑消耗量的操作由於目標產物牢固地吸附在柱上，更換緩衝系統時產物損失少。由於柱內體積很小，而吸附的蛋白量很大，因此在操作時試劑消耗少。
同時，在純化過程中，大部分步驟是將表達產物Trx-AP融合蛋白吸附在柱上進行，由於6His與親和層析柱的高度選擇性和特異性吸附，蛋白酶早已隨復性緩衝液流出。這樣，相對於普通基因工程純化方法的液相純化的方法而言，能夠有效地減少甚至杜絕大腸桿菌本體蛋白酶對於表達產物的降解。
4對環境汙染少，對生產工人沒有毒性在本方法中，所有反應都在層析柱的液相中進行，不會產生粉塵，對生產工人沒有毒性；製備過程中不使用也不產生有毒、汙染性的物質，因此相對於化學合成來說，對環境汙染大大減少。
5副產物少，且副產物具有其他用途本方法中唯一的副產物是融合蛋白切割後所剩下的硫氧還原蛋白(Trx蛋白)。在本方法最後一步切割並洗脫完成之後，Trx蛋白仍然吸附在在柱上。因此，本方法在純化Vc1.1的同時，也實現了Trx蛋白的純化。Trx蛋白據報導在體內具有抗過氧化、清除自由基、保護組織器官免受氧化損傷的作用，因此也是一種潛在的藥物前體。
儘管切割中所用到的腸激酶也隨Vc1.1被洗脫，但其用量十分微小，每獲得1mg的Vc1.1僅需使用約1μg的腸激酶，這在RP-HPLC中幾乎檢測不到。
經過經濟核算，用本發明所涉及的方法生產Vc1.1的成本為用化學合成法生產成本的1/20。
綜上所述，與Trx蛋白融合表達解決了前述的小肽獨立表達易被降解的問題；用高濃度的咪唑洗脫產物在SDS-PAGE上相對於酶切之前位置的高低來間接地檢測酶切是否成功，這同時也解決了Vc1.1的檢測問題；由於復性操作全部在柱上完成，這成功地解決了缺乏低截留分子量的透析袋或超濾膜的問題；更為方便的一點是，融合蛋白被牢固地吸附之後，使得我們可以在很小的柱體積內對其進行任意操作，例如任意更換緩衝系統、任意改變鹽濃度、復性、酶切等等。這些操作的試劑用量均很少，這是由於被吸附的蛋白處於一個很高的濃度狀態(1mLNi-NTA樹脂可以很牢固地結合8mg重組蛋白)，因此，在如此小的柱體積之內，僅需少量的試劑便可實現對於大量蛋白的操作，不用擔心產物被稀釋而需要濃縮或產物損失的問題。最為重要的一點是，蛋白分子由於被吸附儘管在如此的高濃度下也無法聚集在一起形成沉澱，同時也防止了分子之間的碰撞，在用空氣飽和的復性緩衝液充分浸泡之後，Vc1.1分子內完全正確配對的二硫鍵得以形成。
圖1.pET-32a-Vc1.1構建過程左上為KpnI、EcoRI雙酶切的具有粘性末端的線性載體；右上為單鏈合成、退火、連接所構建的包含腸激酶酶切位點編碼序列、Vc1.1編碼區以及KpnI、EcoRI粘性末端的序列；兩者經T4連接酶連接構成pET-32a-Vc1.1重組載體圖2.純化產物RP-HPLC的215nm處的峰圖檢測波長為215nm，上樣量100μL，乙腈洗脫濃度從0％到100％，柱型為SOURCE 5RPC ST圖3.1h、4h、16h時刻製備的Vc1.1、天然Vc1.1和MV IIA的鎮痛效果對比圖中，在所有時刻，所有組與生理鹽水在扭體抑制率上的差異均為極顯著(p＜0.01)，各個時刻，製備的Vc1.1、天然Vc1.1組差異不顯著)，天然Vc1.1組和MVIIA組差異極顯著(p＜0.01)
具體實施例方式(一)基因工程菌構建1.據大腸桿菌密碼子的偏好性，設計能夠以正確的讀碼框插入pET-32a(+)載體KpnI和EcoRI限制性酶切位點之間的核苷酸序列ggtaccgac gac gac gac aagGGTTGCTGCTCTGACCCGCGTTGCAACTACGACCACCCGGAAATCTGCtaagaattc(順序為5』到3』)。從而使得Vc1.1基因編碼區能夠以正確的讀碼框插入腸激酶位點和EcoRI酶切位點之間。
2.根據上述設計的基因序列，分別合成以下單鏈DNA(方向5』到3』)S1 CGACG ACGACGACAA GGGTTGCTGC TCTGACCCGC GTTGCAS2 ACGCGGGTCA GAGCAGCAAC CCTTGTCGTC GTCGTCGGTA CAS1 ACTA CGACCACCCG GAAATCTGCT AAGAS2 AATTCTTAGC AGATTTCCGG GTGGTCGTAG TTGCA3.上述所有單鏈DNA均用多核苷酸激酶在其5』端添加磷酸基團。
4.將步驟3所得DNA按照以下方案進行退火S1和S2進行退火；AS1和AS2進行退火，退火反應程序如下94℃5min；3個循環每個循環1min，每分鐘降低8℃；6個循環每個循環1min，每分鐘降低4℃；12個循環每個循環1min，每分鐘降低2℃；室溫30min。
5.記S1和S2退火產物為S，AS1和AS2退火產物為AS。將S與AS連接得到以上序列。
6.按照分子克隆中常規的雙酶切技術，將所得核苷酸序列整合入pET-32a(+)載體KpnI和EcoRI限制性酶切位點之間。測序驗證讀碼框正確性和插入的正確性，從而獲得重組載體pET-32-Vc1.1。上述幾個步驟示意於圖1。
7.分別將重組載體轉化入大腸桿菌BL21(DE3)，獲得重組基因工程菌株EBVc1.1。
(二)誘導表達以及表達產物的純化、復性和融合蛋白切割1.工程菌EBVc1.1在氨苄青黴素的選擇壓下生長，至對數生長末期(OD600＝0.8)時，加入0.1mM的IPTG進行誘導。22℃誘導24h後，收穫菌體。
2.菌體經過2000r/min離心富集後超聲破碎。收集包含體，用2M尿素洗滌後溶解於8M尿素和8mM的β-巰基乙醇，室溫封口反應12h。
3.將上述反應物結合到Ni-NTA或Ni-IDA親和層析柱上，隨後用用空氣飽和的復性緩衝液(20mM Tris-HCl；0.5M精氨酸；50mM NaCl；pH8.0)洗滌浸泡24h以上。
4.用腸激酶酶切緩衝液(20mM Tris-HCl；2mM CaCl2；50mM NaCl；pH7.4)洗滌浸泡12h以上。
5.按照每單位腸激酶切割5mg融合蛋白的用量將酶加入柱內，室溫反應48h以進行充分酶切。
6.用腸激酶酶切緩衝液洗脫經過切割下來的肽，純度可達95％以上。
7.用絲氨酸型羧肽酶催化目標肽的C末端醯胺化反應。
(三)用本發明所述方法製備的Vc1.1與天然Vc1.1經腹腔注射的鎮痛效果比較用醋酸扭體法測定藥物的鎮痛活性。ICR小鼠體重20g左右，雌雄各半，隨機分組，每組8隻。腹腔或皮下注射0.1μM濃度的肽溶液0.5mL/20gbw。給藥後1h時，腹腔注射0.8％的醋酸0.2mL/20gbw，記錄15min內的小鼠扭體次數。1h、4h、16h時刻Vc1.1、Vc1.1、Vc1.1和MV II A的鎮痛效果，以1h時刻生理鹽水組作為對照，測定扭體抑制率。結果如圖3所示，人工製得的Vc1.1與天然Vc1.1的鎮痛效果類似，其鎮痛效果在1h、4h和16h時刻顯著強於MVIIA(P＜0.01)。同時，兩種Vc1.1的有效作用時間均顯著長於MVIIA。
權利要求
1.一種編碼阿爾法一海螺毒素肽Vc1.1的基因，其特徵是，該基因的編碼鏈具有如下的核苷酸序列5』GGTTGCTGCT CTGACCCGCGTTGCAACTACGACCACCCGGAAATCTGCTAA 3』，該基因編碼阿爾法一海螺毒素肽Vc1.1，其胺基酸序列為GCCSDPRDNYDHPEIC。
2.一種包含權利要求1所述基因的載體，其特徵是，該載體在相容性宿主細胞中並且當宿主處於合適的生長狀態下時能夠生成Vc1.1肽或包含該肽序列的蛋白。
3.如權利要求2所述的基因載體，其特徵是，該載體是將編碼Vc1.1肽的多聚核苷酸按照與硫氧還原蛋白(簡稱Trx蛋白)基因同相位的讀碼框和編碼鏈5』到3』的順序重組在pET-32a(+)載體的腸激酶酶切位點與EcoRI位點之間所構建而成的。
4.一種被如權利要求1或2所述基因載體所轉化的宿主，其特徵是，該宿主能夠生成如權利要求2中所述的多肽或包含該多肽序列的蛋白。
5.如權利要求4所述的宿主，其特徵是，該宿主為將載體轉化入大腸埃希氏桿菌BL21(DE3)所構建的基因工程菌株EBVc1.1。
6.權利要求4所述宿主的應用，其特徵是，將該基因工程菌經過誘導表達Trx-Vc1.1融合蛋白，破碎菌體收集融合蛋白並將其結合到金屬離子親和層析柱上，經過復性、腸激酶切割融合蛋白、洗脫切割產物並進行或不進行C端醯胺化而獲得具生物活性的Vc1.1。
7.權利要求1所述的基因在製備鎮痛藥物中的應用。
8.權利要求6所述的方法在製備富含二硫鍵的鎮痛肽中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種編碼阿爾法一海螺毒素肽(Vcl.1)的基因及其利用方法。屬於生物領域。Vcl.1是具有2對二硫鍵的16肽，本發明公開了編碼這種肽的基因及其基因工程。該基因的利用方法包括將其重組入表達載體，轉化宿主細胞後在其中克隆並表達融合蛋白，經親和層析、復性並純化，獲得具有拮抗神經元型菸鹼樣乙醯膽鹼受體活性的Vcl.1肽。上述方法具有步驟少、質量穩定、產物純度高、製備成本低、副產物少以及不汙染環境等優點。所製備的Vcl.1在受體研究和藥物開發中也具有重要價值。
文檔編號C07K7/08GK1807622SQ20051002267
公開日2006年7月26日 申請日期2005年12月28日 優先權日2005年12月28日
發明者楊侖, 張治國, 連桂芳, 徐朗萊 申請人:南京農業大學