一種檢測玉米赤酶烯酮的方法

2023-05-11 04:51:11

一種檢測玉米赤酶烯酮的方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測玉米赤酶烯酮的方法，是採用Mannich法製備玉米赤酶烯酮的免疫抗原和檢測抗原，免疫Balb/c小鼠，並獲得相應的多抗血清，血清經過分離純化後，間接ELISA檢測其效價；然後將檢測抗原包被於酶標板上，過夜、封閉，再加入標準毒素溶液、樣品提取液，以及稀釋後的多抗；反應後，加入羊抗鼠IgG-HRP，再加入底物溶液顯色，終止後，在450nm處檢測OD值，繪製相關標準曲線，進而求出待測樣品中ZEN的含量，有益效果：更有效的利用參加反應的毒素分子，從而節省成本；整個過程簡便、易於操作、毒素分子的利用率也相對較高；該檢測方法操作簡便，無需專業人員培訓，便於實地生產應用。
【專利說明】一種檢測玉米赤酶烯酮的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於一種檢測真菌毒素的方法，特別涉及一種檢測玉米赤酶烯酮的方法。【背景技術】
[0002]玉米赤黴烯酮(Zearalenone,ZEN)是由粉紅鐮刀菌和其他鐮刀菌產生的一種激素類真菌毒素，常見於玉米、小麥、大米、大麥、小米和燕麥等穀物中，它可引起各種穀物的病變，有類似雌激素的毒作用，可刺激含雌激素受體的乳腺癌細胞增長，導致動物激素水平過高以及嚴重的生殖問題，還具有潛在的致癌性。目前用於檢測玉米赤酶烯酮的方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、酶聯免疫法。薄層色譜法檢測方便，但檢測限高，不能很好的定量；高效液相色譜法檢測準確、檢測低，但需要複雜的樣品前處理過程、專門的儀器以及專業的人員培訓；前述的這些方法均存在著一些不足，不能有效快速地測出相應穀物中所含有的玉米赤黴烯酮。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是針對現有的檢測玉米赤酶烯酮的方法中存在的一些問題而提供的一種檢測玉米赤酶烯酮的方法。
[0004]本發明所述的檢測玉米赤酶烯酮的方法是採用Mannich法製備玉米赤酶烯酮的免疫抗原和檢測抗原，免疫Balb/c小鼠，並獲得相應的多抗血清，血清經過分離純化後，間接ELISA檢測其效價；然後將檢測抗原包被於酶標板上，過夜、封閉，再加入標準毒素溶液、樣品提取液，以及稀釋後的多抗；反應後，加入羊抗鼠IgG-HRP，再加入底物溶液顯色，終止後，在450nm處檢測OD值，繪製相關標準曲線，進而求出待測樣品中ZEN的含量，具體步驟如下所述:
[0005]第一步、製備陽離子化蛋白，主要製備陽離子化牛血清蛋白cBSA和陽離子化雞卵清蛋白cOVA ；
[0006]第二步、採用Mannich法製備免疫抗原ZEN_cBSA和檢測抗原ZEN_cOVA ；
[0007]第三步、取健康的6-8周雌性Balb/c小鼠4隻，初次免疫用完全弗氏佐劑乳化後腹腔注射，每隻鼠免疫劑量為100 μ g ZEN-cBSA,注射體積為0.2mL ;之後加強免疫每兩周腹腔注射一次，乳化用不完全弗氏佐劑；最後一次免疫使用生理鹽水代替不完全弗氏佐劑，採用尾靜脈注射，注射劑量和前面幾次相同；一共免疫6次；從第3次免疫開始，每次免疫後10天斷尾取血，間接ELISA檢測小鼠血清效價；
[0008]第四步、小鼠在最後一次免疫後的第10天,摘眼球取血,處死小鼠；所獲血液先置於室溫下2h，然後在4°C條件下3500rpm離心20min，離心之後的血清凍存於_20°C的冰箱中；
[0009]第五步、純化離心後的血清，間接ELISA確定血清效價；
[0010]第六步、檢測抗原包被於酶標板上，在4°C條件下過夜；
[0011]第七步、使用乙腈-水提取待檢樣品中的毒素，乙腈與水的體積比為85:15;[0012]第八步、洗滌酶標板，加入封閉液，反應2h ；
[0013]第九步、洗滌，凍存酶標板；或者加入標準毒素溶液、樣品提取液，添加稀釋後的血
清上清；
[0014]第十步、洗滌，加入二抗羊抗鼠IgG-HRP反應；
[0015]第十一步、洗滌，加入底物液顯色；
[0016]第十二步、終止，450nm處酶標儀檢測反應孔OD值。
[0017]第二步中製備得到的免疫抗原中ZEN與cBSA的分子個數比的範圍為10:1-20:1。
[0018]第三步中初次免疫和加強免疫乳化成功的標準是乳液在水中呈滴狀，不會迅速擴散，免疫的抗原劑量為IOOyg/只。
[0019]第五步中血清效價的判斷標準為陽性孔的最大稀釋倍數，而陽性孔的判斷標準為(A待檢樣品-A空自)/ (Aratt-Ase) >=2.1，其中A為待檢孔在450nm條件下的OD值。
[0020]第六步中檢測抗原ZEN-cOVA使用100mmol/L pH=9.6的Na2CO3-NaHCO3緩衝液稀釋到 2 μ g/mL。
[0021]第九步中封閉過的酶標板能夠直接用於檢測玉米赤酶烯酮，血清上清按照效價/2的倍數稀釋後加入，也可以凍存於_20°C下，便於以後隨時進行檢測。
[0022]本發明的有益效果:
[0023]1、毒素免疫和檢測偶聯的蛋白選用陽離子化的蛋白，即陽離子化牛血清蛋白(cBSA)和陽離子化雞卵清蛋白(cOVA)，陽離子化蛋白較正常蛋白可以結合更多的毒素分子，同時更有效的利用參加反應的毒素分子，從而節省成本；
[0024]2、偶聯方法選擇Mannich法，而非傳統的活性酯法和酸酐法。傳統的方法往往需要先對毒素分子進行肟化，而肟化往往伴隨較為複雜的有機反應。肟化過程不僅需要引入各種有毒有害試劑、過程繁瑣，而且毒素有可能在這個過程中損失，影響後期偶聯的效率。Mannich法則省去了較為繁瑣的肟化過程，整個過程簡便、易於操作、毒素分子的利用率也相對較高；
[0025]3、此法較傳統的高效液相法，更易於操作，且特異性強；較薄層色譜法，檢測限低，易於定量；檢測抗原包被在酶標板上後，可凍存起來，便於後期樣品的檢測；且該檢測方法操作簡便，無需專業人員培訓，便於實地生產應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為多抗血清間接競爭ELISA曲線圖，其中橫坐標為ZEN濃度的對數，ZEN濃度單位為ng/mL ;縱坐標為檢測孔OD值B與空白孔OD值BO的比值。
【具體實施方式】
[0027]本發明所述的檢測玉米赤酶烯酮的方法是採用Mannich法製備玉米赤酶烯酮的免疫抗原和檢測抗原，免疫Balb/c小鼠，並獲得相應的多抗血清，血清經過分離純化後，間接ELISA檢測其效價；然後將檢測抗原包被於酶標板上，過夜、封閉，再加入標準毒素溶液、樣品提取液，以及稀釋後的多抗；反應後，加入羊抗鼠IgG-HRP，再加入底物溶液顯色，終止後，在450nm處檢測OD值，繪製相關標準曲線，進而求出待測樣品中ZEN的含量，具體步驟如下所述:[0028]第一步、製備陽離子化蛋白，主要製備陽離子化牛血清蛋白cBSA和陽離子化雞卵清蛋白cOVA ；
[0029]第二步、採用Mannich法製備免疫抗原ZEN_cBSA和檢測抗原ZEN_cOVA ；
[0030]第三步、取健康的6-8周雌性Balb/c小鼠4隻，初次免疫用完全弗氏佐劑乳化後腹腔注射，每隻鼠免疫劑量為100 μ g ZEN-cBSA,注射體積為0.2mL ;之後加強免疫每兩周腹腔注射一次，乳化用不完全弗氏佐劑；最後一次免疫使用生理鹽水代替不完全弗氏佐劑，採用尾靜脈注射，注射劑量和前面幾次相同；一共免疫6次；從第3次免疫開始，每次免疫後10天斷尾取血，間接ELISA檢測小鼠血清效價；
[0031]第四步、小鼠在最後一次免疫後的第10天,摘眼球取血,處死小鼠；所獲血液先置於室溫下2h，然後在4°C條件下3500rpm離心20min，離心之後的血清凍存於_20°C的冰箱中；
[0032]第五步、純化離心後的血清，間接ELISA確定血清效價；
[0033]第六步、檢測抗原包被於酶標板上，在4°C條件下過夜；
[0034]第七步、使用乙腈-水提取待檢樣品中的毒素，乙腈與水的體積比為85:15 ;
[0035]第八步、洗滌酶標板，加入封閉液，反應2h ；
[0036]第九步、洗滌，凍存酶標板；或者加入標準毒素溶液、樣品提取液，添加稀釋後的血
清上清；
[0037]第十步、洗滌，加入二抗羊抗鼠IgG-HRP反應；
[0038]第H^一步、洗滌，加入底物液顯色；
[0039]第十二步、終止，450nm處酶標儀檢測反應孔OD值。
[0040]第二步中製備得到的免疫抗原中ZEN與cBSA的分子個數比的範圍為10:1-20:1。
[0041]第三步中初次免疫和加強免疫乳化成功的標準是乳液在水中呈滴狀，不會迅速擴散，免疫的抗原劑量為IOOyg/只。
[0042]第五步中血清效價的判斷標準為陽性孔的最大稀釋倍數，而陽性孔的判斷標準為(A待檢樣品-A空自)/ (Aratt-Ase) >=2.1，其中A為待檢孔在450nm條件下的OD值。
[0043]第六步中檢測抗原ZEN-cOVA使用100mmol/L pH=9.6的Na2CO3-NaHCO3緩衝液稀釋到 2 μ g/mL。
[0044]第九步中封閉過的酶標板能夠直接用於檢測玉米赤酶烯酮，血清上清按照效價/2的倍數稀釋後加入，也可以凍存於_20°C下，便於以後隨時進行檢測。
[0045]具體實施過程如下所述:
[0046]一、製備多抗血清:
[0047]1、製備陽離子化蛋白:
[0048]取670 μ LIOOmmoI/L的乙磺酸(MES)溶液(ρΗ=4.8)置於冰浴中，加入相同體積的乙二胺(EDA)，然後用0.4mol/L的稀鹽酸溶液調節混合液的pH值為4.8，標記為A液；取500 μ L MES緩衝液，向其中加入50mg牛血清蛋白(BSA)和30mgl_ (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，標記為B液；將B液加入到A液，室溫下磁力攪拌反應2h ;加入400μ L2mol/L的醋酸溶液終止反應。蒸餾水中透析72h，得到的脫鹽的陽離子化牛血清蛋白(cBSA)冷凍乾燥後，保存於_20°C，同樣的方法製備陽離子化雞卵清蛋白(cOVA)；
[0049]2、製備免疫抗原和檢測抗原:[0050]免疫抗原的製備:稱量600 μ g的cBSA作為偶聯物溶解於500 μ L MES溶液中，稱量IOOyg ZEN溶於50 μ L 二甲基甲醯胺(DMF)中；將ZEN溶液緩慢加入到cBSA溶液中，輕輕攪拌混合液，然後向混合液中加入50 μ L的甲醛，立即移入37°C培養箱中，輕輕攪拌反應24h。用離心過濾純化裝置純化ZEN-cBSA結合物，重複2次，凍幹後，保存於_20°C的冰箱中；
[0051]同樣的方法選擇cOVA作為偶聯物製備檢測抗原；
[0052]3、免疫小鼠:取健康的6-8周雌性Balb/c小鼠4隻，初次免疫用完全弗氏佐劑乳化後腹腔注射，每隻鼠免疫劑量為100 μ g ZEN-cBSA,注射體積為0.2mL ;之後加強免疫每兩周腹腔注射一次，乳化用不完全弗氏佐劑；最後一次免疫使用生理鹽水代替不完全弗氏佐劑，採用尾靜脈注射，注射劑量和前面幾次相同；一共免疫六次；從第三次免疫開始，每次免疫後十天斷尾取血，間接ELISA檢測小鼠血清效價；
[0053]4、最後一次免疫後，第10天，摘眼球取血，處死小鼠；血液室溫下靜止2h後，3500rpm離心20min,血清凍存於_20°C的環境下；
[0054]5、採用正辛酸法純化血清:抗血清用4倍體積的60mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩衝液稀釋，用lOOmmol/L NaOH調至pH4.5 ;邊攪拌邊緩慢滴加辛酸(25mL/L血清稀釋液)，加完後，攪拌30min ；IOOOOrpm離心30min,收集上清；紗布過濾後，按1/10體積加入10XPBS,5mol/L NaOH調至pH7.4 ;上清液4°C預冷，計算總體積，按277g/L加入硫酸銨粉末，邊加邊攪拌，加完後繼續攪拌30min ;5000rpm離心15min,棄去上清,收集沉澱；沉澱用少量透析液溶解，透析並更換兩次透析液；收集上清液，-20°C的條件下凍存；
[0055]6、間接ELISA檢測上清液效價:陽性孔的判斷標準為(A待檢樣品-A空白)/ (A陰性-A空θ) >=2.1，陽性孔的最大稀釋倍數即為抗體效價，其中A為待檢孔在450nm條件下的OD值。
[0056]二、標準試樣製備:
[0057]1、洗滌液:在IOOmmoI/L pH值為7.4的磷酸鹽緩衝液中加入0.05%的吐溫-20 ；
[0058]2、封閉液:在IOOmmoI/L pH值為7.4的磷酸鹽緩衝液加入1%牛血清白蛋白；
[0059]3、樣品稀釋液:在IOOmmoI/L pH值為7.4的磷酸鹽緩衝液中加入10%甲醇；
[0060]4、檢測抗原稀釋液:在pH值為7.4的磷酸鹽緩衝液中加入0.05%的牛血清白蛋白 BSA ；
[0061]5、終止液:Imo I/L鹽酸溶液；
[0062]6、提取液:乙腈:7jC =85:15 (體積比)；
[0063]7、底物液:選擇 Invitrogen 公司的 TMB Single Solution ；
[0064]8、製備玉米赤酶烯酮抗體包被反應板:用100mmol/L pH9.6的碳酸鹽緩衝液將ZEN-cOVA稀釋為2 μ g/mL,加到96孔酶標板中，每孔100 μ L，4°C冰箱放置過夜，棄去包被液，滿孔洗滌3次，每孔加200 μ L封閉液封閉，置於37°C 2h，棄其封閉液將包被板包裝後置-20°C冷凍保存；
[0065]9、製備玉米赤酶烯酮標準溶液:將樣品稀釋液為溶劑配製5_400ng/ml (5、10、20、30、50、100、200、400 )的赤酶烯酮標準系列溶液。
[0066]三、檢測樣品:
[0067]1、待測樣品前處理:稱取IOg粉碎且過20目篩的樣品置於磨口的IOOml錐形瓶中，加入乙腈-水(體積比85:15) 40ml，加塞振蕩30min，過濾即為待測樣液；[0068]2、反應孔標記:1-6號孔為玉米赤酶烯酮(ZEA)標準對照孔，7號孔為空白對照孔，另根據需要設定待測樣品孔的數量；所有反應孔設定平行樣；
[0069]3、根據標記依次加入配置好的標準溶液及待測樣液，在1-6號試管中加入玉米赤酶烯酮標準溶液50 μ L，在7號試管中加入50 μ L樣品稀釋液，在其餘孔中分別加入待測樣液 50 μ L ;
[0070]4、在各孔中分別加入50 μ L按照(效價/2)倍比稀釋的多抗上清，輕輕地振蕩，使各孔中的反應物混勻；
[0071]5、將酶標板置於37°C恆溫箱中孵育Ih ；
[0072]6、取出酶標板，甩掉反應液，拍幹，洗滌液滿孔洗滌，振蕩3min後，甩淨，拍幹，重複洗板3次；
[0073]7、酶標板反應孔每孔加入1:5000倍比稀釋的羊抗鼠IgG-HRP，置於37°C恆溫箱中孵育Ih ；
[0074]8、取出酶標板，甩掉反應液，拍幹，洗滌液滿孔洗滌，振蕩3min後，甩淨，拍幹，重複洗板5次；
[0075]9、酶標板每孔加入TMB溶液100 μ L，置於暗處室溫反應20min ；
[0076]10、取出酶標板，每孔加入終止液100 μ L，在450nm處測定各孔的OD值；
[0077]11、利用GraphPad Prism5軟體以標準溶液孔的OD值B與空白孔的OD值BO的比值(Β/Β0)為函數值，以標準溶液的濃度對數的為自變量，製作曲線，求回歸方程，見附圖1 ;根據方程可求出樣品孔對應毒素的濃度；
[0078]12、根據GraphPad Prism5軟體自帶的劑量_效應(抑制模型)對數據進行非線性回歸擬合，可得公式(I )，其中Y為待測樣品OD值和空白孔OD值的比值，X為所測樣品中ZEN的濃度，單位為ng/mL ;根據待測樣品前處理過程可得公式(2)，其中X為所測樣品中ZEN的濃度，單位為ng/mL，X為所測樣品中ZEN的含量，單位為ng/g，V為提取液的總體積，單位為mL, m為待測樣品的質量,單位為g ；
【權利要求】
1.一種檢測玉米赤酶烯酮的方法，具體步驟如下所述: 第一步、製備陽離子化蛋白，主要製備陽離子化牛血清蛋白CBSA和陽離子化雞卵清蛋白 cOVA ； 第二步、採用Mannich法製備免疫抗原ZEN-cBSA和檢測抗原ZEN-cOVA ； 第三步、取健康的6-8周雌性Balb/c小鼠4隻，初次免疫用完全弗氏佐劑乳化後腹腔注射，每隻鼠免疫劑量為100 μ g ZEN-cBSA,注射體積為0.2mL ;之後加強免疫每兩周腹腔注射一次，乳化用不完全弗氏佐劑；最後一次免疫使用生理鹽水代替不完全弗氏佐劑，採用尾靜脈注射，注射劑量和前面幾次相同；一共免疫6次；從第3次免疫開始，每次免疫後10天斷尾取血，間接ELISA檢測小鼠血清效價； 第四步、小鼠在最後一次免疫後的第10天，摘眼球取血，處死小鼠；所獲血液先置於室溫下2h，然後在4°C條件下3500rpm離心20min，離心之後的血清凍存於_20°C的冰箱中；第五步、純化離心後的血清，間接ELISA確定血清效價； 第六步、檢測抗原包被於酶標板上，在4°C條件下過夜； 第七步、使用乙腈-水提取待檢樣品中的毒素，乙腈與水的體積比為85:15 ; 第八步、洗滌酶標板，加入封閉液，反應2h ； 第九步、洗滌，凍存酶標板；或者加入標準毒素溶液、樣品提取液，添加稀釋後的血清上清； 第十步、洗滌，加入二抗羊抗鼠IgG-HRP反應； 第H^一步、洗滌，加入底物液顯色； 第十二步、終止，450nm處酶標儀檢測反應孔OD值。
2.根據權利要求1所述的一種檢測玉米赤酶烯酮的方法，其特徵在於:所述的第二步中製備得到的免疫抗原中ZEN與cBSA的分子個數比的範圍為10:1-20:1。
3.根據權利要求1所述的一種檢測玉米赤酶烯酮的方法，其特徵在於:所述的第三步中初次免疫和加強免疫乳化成功的標準是乳液在水中呈滴狀，免疫的抗原劑量為100 μ g/只。
4.根據權利要求1所述的一種檢測玉米赤酶烯酮的方法，其特徵在於:所述的第五步中血清效價的判斷標準為陽性孔的最大稀釋倍數，而陽性孔的判斷標準為-Ase) /(Aratt-Ase) >=2.1，其中A為待檢孔在450nm條件下的OD值。
5.根據權利要求1所述的一種檢測玉米赤酶烯酮的方法，其特徵在於:所述的第六步中檢測抗原 ZEN-cOVA 使用 100mmol/L pH=9.6 的 Na2CO3-NaHCO3 緩衝液稀釋到 2 μ g/mL。
6.根據權利要求1所述的一種檢測玉米赤酶烯酮的方法，其特徵在於:所述第九步中的血清上清按照效價/2的倍數稀釋後加入。
【文檔編號】G01N33/64GK103808938SQ201410098274
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月16日 優先權日:2014年3月16日
【發明者】劉靜波, 陳曉飛, 張燕 申請人:吉林大學