具有抗血栓形成活性的低聚糖混合物的製作方法

2023-05-03 06:21:46

專利名稱：具有抗血栓形成活性的低聚糖混合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有抗血栓形成活性的低聚糖混合物，尤其涉及由硫酸皮膚素衍生得來的低聚糖類物質。
背景技術：
硫酸皮膚素是具有抗血栓形成活性的線型多糖，其由交替的葡糖醛酸或艾杜糖醛酸殘基和N-乙醯基半乳糖胺殘基組成，這些殘基被不同程度地硫酸化。其抑制凝血酶活性的機理依賴於既結合肝素輔因子II(HCII，一種絲氨酸蛋白酶抑制劑)又結合凝血酶(因子IIa)本身的硫酸皮膚素。
過去對硫酸皮膚素及其降解產物已經有了很多研究，這些研究主要針對於具有有關活性的特異性片斷的鑑定和分離。例如生物化學雜誌(J.Biological Chemistry)第261卷，1986年7月第8854-58頁記載了含有12-14個結合於HCII上的糖殘基的片斷，該文還記載了沒有這種結合能力的二糖、四糖和六糖片斷。生物化學雜誌(J.BiologicalChemistry)第265卷，1990年10月第18263-71頁也記載了對HCII具有高親和能力的六糖。在WO91/15217中記載了結合HCII的含5-6個糖殘基的低聚糖及其有關物質。血栓形成研究(Thrombosis Research)，66，1992年第527-33頁指出分子量範圍是4-9KDa的低聚糖可以達到生物活性、清除、消失半衰期和生物利用度等因素的最佳平衡。WO93/05074記載了具有抗血栓形成活性的含11-13個糖殘基的低聚糖，WO93/05075記載了含7-12個糖殘基的低聚糖。血液(Blood)第81卷，1993年4月，1771-77頁得出結論具有完全催化活性的最小片斷為十六糖。
在早一些的研究中，這些所研究的片斷的製備方法通常包括起始物質硫酸皮膚素的降解和用親和色譜對這些片斷的分離。
目前正在研究的一種天然低分子量硫酸皮膚素(Desmin)的特徵在於硫酸根對羧酸根的比例為1.06(血栓形成研究(Thrombosis Research)，第83卷，第1期，103-109頁)。
從上可以明白許多低聚糖片斷可以從硫酸皮膚素中得到，這些低聚糖性質和其活性之間的關係是複雜的，至今也沒有完全弄明白。
發明的公開我們已經發現一些片斷的抗血栓形成活性可以達到令人滿意的程度，所述的片斷是從具有較低電荷密度的物質中分離得到並含有基於特異性二糖殘基的低聚糖混合物。
本發明的低聚糖與現有技術不同，因為它們帶有更多的負電荷。與以前應用的以及現有技術中記載的特異性片斷的分離方法相比，本發明低聚糖的製備方法更具有商業競爭力，因為它們可以更廉價地製備出來。這些硫酸皮膚素片斷對HCII的親和力比天然硫酸皮膚素出奇地高，因此可用來增強基於硫酸皮膚素藥物的抗血栓形成效能。
因此，本發明提供一種含有不同數目硫酸化二糖重複單元的線型低聚糖混合物，所述二糖重複單元由L-艾杜糖醛酸(IdoA)和N-乙醯-D-半乳糖胺(GalNAc)衍生得到，該線型低聚糖混合物具有下列性質(a)該混合物的90％或以上的分子量範圍是1600-20000，(b)硫含量為6.0-8.0％重量，(c)硫酸根/羧酸根比為1.2-1.6，(d)二硫酸化二糖含量為單硫酸化二糖含量的20-60％重量，和(e)抗凝血酶活性為20-60IU/mg。
該混合物從硫酸皮膚素製備得到，因此可能含有少量由D-葡糖醛酸衍生的殘基，儘管它優選沒有或基本上沒有這樣的殘基。還可能存在少量非Gal-NAc的己糖胺的殘基，例如N-乙醯基-D-葡糖胺(Glu-NAc)的殘基，儘管優選Gal-NAc是唯一存在的己糖胺。
太多數情況下，該Gal-NAc殘基在4-位硫酸化；在某些情況下，IdoA殘基在2-位硫酸化。在某些情況下，還可以見到在Gal-NAc的6-位發生硫酸化。因此，硫酸根羧基和二硫酸化單硫酸化二糖的比以及硫含量均可以變化，這主要取決於IdoA殘基的硫酸化程度。
式1表示通常存在於本發明低聚糖中重複的硫酸化L-艾杜糖醛酸和N-乙醯基-D-半乳糖胺單元的序列。

其中R為H或SO3-，和對於90％或更多的物質，n的範圍為3-37；對於分子分布的峰值點，n為10-15。
在這些殘基中，IdoA的1-位與Gal-NAc的3-位相連；Gal-NAc的1-位與IdoA的4-位相連。當用下面描述的方法製備時，一部分末端Gal-NAc殘基在1-位具有2，3，4-三羥基丁酸殘基(HO-CH2-CH(O-)-CH(OH)COO-)。抗衡離子是單價或二價陽離子，主要為鈉離子，但也可能為其它離子如鈣離子。本發明的實施方案低聚糖的特性可通過下列方法測定(1)按照Dedem Nielsen，Pharmeuropa(歐洲藥物)第3卷第3期，202-218(1991)的方法用凝膠滲透色譜測定分子量，(2)按照Ph.Eur.V.3.5.3的方法測定硫含量，(3)按照Ph.Eur.第828頁的方法測定硫酸根/羧基的比(4)按照Linhardt等，分析生物化學(Anal.Biochem.)181期第288-296頁(1989)記載的方法，測定二硫酸化/單硫酸化雙糖的含量，(5)用第4次國際肝素標準(International Heparin Standard)(代號.82/502)作為標準，在無血漿系統中用顯色分析(Diagnostica Stago法國)測定HCII介導的抗凝血酶活性。
混合物的硫含量通常在6.0-8.0％重量範圍內，優選6.5-8.0％範圍。硫酸根/羧基比的通常範圍是1.2-1.6，優選1.3-1.6。二硫酸化二糖的含量通常為單硫酸化二糖含量的20-60％重量，優選30-60％重量。本發明低聚糖的HCII介導的抗凝血酶活性的通常範圍是20-60IU/mg，優選30-60IU/mg。
本發明的低聚糖混合物可以這樣製備硫酸皮膚素通過高碘酸鹽氧化反應解聚，然後經氫硼化物還原反應，再酸水解，然後通過離子交換分級分離。
用作起始物質的硫酸皮膚素可以從動物腸例如豬黏膜或牛氣管中得到，它們具有下列特性比旋光度(4％的水溶液) -50°至-70°硫 5.3-6.3％(w/w)硫酸根/羧酸根比1.0-1.3HCII介導的抗凝血酶活性 2-10IU/mg解聚步驟包括的主要化學反應如下列反應方案所示，主要按照碳水化合物研究(Carbohydrate Research)36期，339-348頁(1974)描述的路線進行。
硫酸皮膚素的解聚反應

第一步，用高碘酸鹽處理硫酸皮膚素(1)導致非硫酸化IdoA殘基的選擇性氧化反應，產生開環二元醛(2)。後者經還原後得到二元醇(3)，該二元醇通過酸水解裂解得到兩個Gal-NAc封端的片斷，其中一個帶有2，3，4-三羥基丁酸末端基團。這種裂解反應可以在硫酸皮膚素鏈上的許多部位發生，因此得到不同鏈長度的片斷的混合物。然後這些片斷經離子交換分級分離可以得到所選擇的片斷。
進行起始的氧化步驟可以應用高碘酸或其鹽，例如鈉鹽，在溫度為0-30℃、pH範圍為5-8的含水介質中進行。進行還原步驟時可以應用氫硼化物例如氫硼化鉀或者應用優選的氫硼化鈉，在溫度為0-30℃、pH為6-9的含水介質中進行。進行酸水解反應時優選應用無機酸例如鹽酸或硫酸，可以選擇任何合適的溫度例如20-60℃。
該混合物的離子交換分級分離通常將較低硫酸化的片斷與相對高度硫酸化的片斷分離，其中相對高度硫酸化的片斷特徵為(a)該混合物的90％或以上的分子量範圍是1600-20000，(b)硫含量為6.0-8.0％重量，(c)硫酸根/羧酸根比為1.2-1.6，(d)二硫酸化二糖含量為單硫酸化二糖含量的20-60％重量，和(e)抗凝血酶活性為20-60IU/mg。
可應用離子交換樹脂通過分步洗脫法進行分級分離，其中的離子交換樹脂例如有Amberlite IRA 404，Amberlite IRA 900，Amberlite IRA 904，Amberlite IRA 958，Amberlite IRA 67，Amberlite IRA 68，LewatitS5428A，Lewatit S6328A，Lewatit S6328，Lewatit MP 500WS，Dowex 11，Dowex Monosphere 550A，Dowex MSA1或任何其它陰離子交換劑。
離子交換步驟可以這樣進行，將起始物質的溶液與該樹脂結合，然後根據洗脫溶液的離子強度從樹脂上洗脫出不同活性的餾分。低硫酸化低分子量產品通常先洗脫出來，將其棄掉，通過進一步洗脫可以得到所需要的高度硫酸化的低分子量物質。
本發明的低聚糖混合物可以作為抗血栓形成試劑以任何合適的方式製備成人藥或獸藥。這些藥物組合物通常包括一種或多種可接受的載體，並可以是適合例如非經腸、口服或局部用藥的形式。
該混合物可以製備成注射用的人藥或獸藥，並可以是單位劑量形式例如安瓿劑。注射用組合物可以是分散在油載體或含水載體中的混懸劑、溶液或乳劑，並可含有配製助劑例如懸浮劑、穩定劑、增溶劑和/或分散劑。
該組合物還可以製成口服製劑形式例如溶液、糖漿或混懸劑或製成在使用前與水或其它合適載體混合的乾粉；還可以應用固體組合物例如片劑、膠囊、錠劑、丸劑、大丸劑、粉劑、糊劑、粒劑、彈劑(bullets)或預混合製劑。
該組合物還能以局部給藥的劑型用於人藥和獸藥，例如軟膏、乳膏、洗劑、香波、粉劑、噴霧劑、浸泡劑(dips)或氣霧劑。
本發明的混合物可以與其它藥物活性成分聯合給藥。
對於用於人藥和獸藥的本發明混合物，其每日總劑量範圍是1-100mg/kg體重，優選3-30mg/kg體重，這些總劑量可以分次給藥，例如1-4次/天。
本發明的製劑可以用於治療各種血栓形成疾病例如深靜脈血栓形成(DVT)和中風以及在一般外科手術如髖骨置換(hip replacement)和膝部手術中用於預防血栓形成併發症。
下面通過實施例來闡明本發明實施例1把300g從豬腸黏膜中分離得到的硫酸皮膚素鈉溶於3升1％(w/v)氯化鈉溶液中，在攪拌下慢慢地把17.4g NaIO4加入到上述溶液中。在黑暗中攪拌該溶液過夜。然後小心地把6g NaBH4加入到該溶液中。在室溫下3小時後用鹽酸調整pH值至2.0，然後在60℃下攪拌該溶液3小時。再用氫氧化鈉調整pH值至5.5，過濾該溶液，用1.7倍體積的無水乙醇沉澱。得到的產品具有下列特性
比旋光度(4％的水溶液)-55°硫 6.3％(w/w)硫酸根/羧酸根比 未檢測(nd)HCII介導的抗凝血酶活性 7.5IU/mg將4.0g上述分離得到的低分子量硫酸皮膚素溶於200ml 0.5M氯化鈉溶液中，然後把200g Amberlite IRA 904離子交換材料加入到該溶液中。在60℃下攪拌1小時後，測定pH值和氯化鈉的濃度，把pH調整到5.8-6.0，並把氯化鈉的濃度調整到0.5(0.48-0.52)M。在60℃下攪拌該溶液過夜。排乾離子交換材料，棄掉溶液。在60℃和pH5.8-6.0下，該離子交換材料用200ml 1.2M氯化鈉溶液攪拌過夜洗脫兩次，洗脫出低硫酸化低分子量硫酸皮膚素。小心地排乾離子交換材料後，在60℃和pH5.8-6.0下，該離子交換材料用200ml 1.6M氯化鈉溶液攪拌過夜洗脫兩次，洗脫出高硫酸化低分子量硫酸皮膚素。過濾合併的洗脫液，用1.7倍體積的無水乙醇沉澱。再進行一次沉澱從而從該沉澱物中除去鹽，最後得到0.7g高度硫酸化的低分子量硫酸皮膚素，其具有下列特性峰值分子量(Mp) 6926Da，硫 6.9％(w/w)，硫酸根/羧酸根比未檢測二硫酸化二糖含量 未檢測HCII介導的抗凝血酶活性 36.6IU/mg在兔頸靜脈血栓模型(用5mg/kg的凝血酶原激酶處理的雄性和雌性Mol.Russian兔(體重2-2.5kg))中，上面得到的物質顯示ED50值為0.753mg/kg。實施例2
把4.0g按照實施例1的方法製備的低分子量硫酸皮膚素按照實施例1的方法與Amberlite IRA 904結合，在60℃和pH5.8-6.0下，用1.0M氯化鈉溶液攪拌過夜洗脫兩次，以洗脫出低硫酸化的低分子量硫酸皮膚素。再按照實施例1的方法洗脫出隨後分離的高度硫酸化的低分子量硫酸皮膚素，其顯示下列特性峰值分子量(Mp) 7170Da，硫 7.0％(w/w)，硫酸根/羧酸根比未檢測二硫酸化二糖含量 未檢測HCII介導的抗凝血酶活性 30.9IU/mg實施例313.0kg從豬小腸黏膜中分離的硫酸皮膚素鈉溶於130L去離子水中，再把617gNaIO4在攪拌下緩緩加入到該反應器中。該溶液在暗處攪拌過夜。小心地往該溶液中加入260g NaBH4。室溫三小時後，用鹽酸調整pH至2.0，在60℃下攪拌該溶液6小時。然後用氫氧化鈉調整pH值至5.7，用1.7倍體積的無水乙醇使該溶液沉澱。得到12.2kg產品，具有下列特性比旋光度 -53.5°硫5.7％(w/w)硫酸根/羧酸根比 1.3HCII介導的抗凝血酶活性6.1 IU/mg將上面分離的低分子量硫酸皮膚素溶於122升0.5M的氯化鈉溶液中，再往該溶液中加入4.9kg Amberlite IRA 68離子交換材料。該溶液在60℃攪拌過夜，排乾離子交換材料，棄掉溶液，然後在60℃和pH6.0下，用80升2.0M氯化鈉溶液過夜洗脫兩次。合併的洗脫液用1.5倍體積的無水乙醇沉澱兩次，用6.0μm過濾，從水溶液中噴霧乾燥。得到713g高度硫酸化的低分子量硫酸皮膚素(LMWDS)，其顯示下列特性峰值分子量 5000Da，硫 7.3％(w/w)，硫酸根/羧酸根比1.4二硫酸化二糖含量 39％HCII介導的抗凝血酶活性 44.5 IU/mg在兔頸靜脈血栓模型(用5mg/kg的凝血酶原激酶處理的雄性和雌性Mol.Russian兔(體重2-2.5kg))中，皮下注射3小時後，該LMWDS顯示ED50值為3.4mg/kg。
在類似的頸靜脈血栓模型中，在15隻兔的動物組中以三種劑量靜脈注射，然後立即研究LMWDS的效果。得到下列結果劑量(mg/kg)不顯示血栓形成的動物百分比1 123 6710 80
權利要求
1.含有不同數目硫酸化二糖重複單元的線型低聚糖的混合物，所述二糖重複單元由L-艾杜糖醛酸(IdoA)和N-乙醯-D-半乳糖胺(Gal-NAc)衍生得到，該線型低聚糖混合物具有下列性質(a)該混合物的90％或以上的分子量範圍是1600-20000，(b)硫含量為6.0-8.0％重量，(c)硫酸根/羧酸根比為1.2-1.6，(d)二硫酸化二糖含量為單硫酸化二糖含量的20-60％重量，和(e)抗凝血酶活性為20-60IU/mg。
2.如權利要求1所述的混合物，其中的低聚糖具有式1的結構
其中R為H或SO3-，和對於90％或更多的物質，n的範圍為3-37；對於分子分布的峰值點，n為10-15。
3.根據權利要求1或2的混合物，其硫含量為6.5-8.0％重量，硫酸根/羧酸根比為1.3-1.6，二硫酸化二糖的含量為30-60％和抗凝血酶活性為30-60IU/mg。
4.含有上面任意一項權利要求中的混合物和一種或多種載體的藥物組合物。
5.權利要求1所述混合物的製備方法，包括通過高碘酸鹽氧化使硫酸皮膚素解聚，然後用氫硼化物還原和酸水解，再用離子交換分級分離所述混合物。
6.根據權利要求5所述的方法，其中開始的氧化步驟是用高碘酸或其鹽在0-30℃和pH5-8的含水介質中進行的，還原步驟是用氫硼化物在0-30℃和pH6-9的含水介質中進行的，酸水解步驟是用無機酸在20-60℃下進行的。
7.根據權利要求5所述的方法，其中分級分離是用陰離子交換樹脂通過分步洗脫進行的。
全文摘要
含有不同數目硫酸化二糖重複單元的線型低聚糖的混合物,所述二糖重複單元由L－艾杜糖醛酸(IdoA)和N－乙醯－D－半乳糖胺(Gal－NAc)衍生得到,該線型低聚糖混合物具有下列性質:(a)該混合物的90%或以上的分子量範圍是1600—20000,(b)硫含量為6.0—8.0%重量,(c)硫酸根/羧酸根比為1.2—1.6,(d)二硫酸化二糖含量為單硫酸化二糖含量的20—60%重量,和(e)抗凝血酶活性為20—60IU/mg。該混合物可用作抗血栓形成試劑,製備過程為:用高碘酸鹽氧化硫酸皮膚素使其解聚,再用氫硼化物還原,然後酸水解,然後離子交換分級分離。
文檔編號A61P7/00GK1259143SQ98805797
公開日2000年7月5日 申請日期1998年5月15日 優先權日1997年6月3日
發明者M·倫德奎斯特, K·B·約翰森 申請人:裡奧藥物製品有限公司