用於遞送活性劑穿過生物膜的靶向納米載體系統的製作方法

2023-10-11 10:09:14

用於遞送活性劑穿過生物膜的靶向納米載體系統的製作方法
【專利摘要】本文中公開了納米顆粒、膠束和/或脂質體組合物，各包含封裝在一種或多種聚合物中的治療劑，其中維生素B12或其衍生物通過接頭基團連接於一種或多種聚合物，以及用於製備和使用所述組合物的方法。
【專利說明】用於遞送活性劑穿過生物膜的靶向納米載體系統
[0001]相關申請的交叉參考
[0002]本申請要求在35U.S.C.§ 119(e)下對2011年3月8日提交的美國臨時申請號61/450，541的優先權，將所述臨時申請的內容通過引用整體併入本文。
[0003]背景
[0004]雖然使用藥物活性化合物對疾病的治療是老生常談，但藥劑的開發受到對將藥物方便地以充足的量遞送至作用部位以獲得期望的藥理學效應的需要的挑戰。藥物遞送的方便途徑是口服遞送。其對於患者而言是優選的，因為其是非侵襲性的，對於醫生而言因患者的順從性也是優選的。然而該途徑對於許多藥物活性化合物可以是不可使用的，因為這些化合物在胃腸道被分解或不能被吸收。類似地，可在早期測試中顯示遠大前景的藥物因化合物可能不能到達它們期望的作用部位(因不能穿過生物膜)而失敗。例如，在癌症化學療法中，通常可能必需利用高水平的細胞毒性藥物對患者給藥，以實現有意義的療效，但這也可導致對正常細胞的損傷，從而導致顯著的有害副作用。
[0005]可能期望改變細胞毒性化合物的天然生物分布以便更多的藥物被遞送至腫瘤細胞，更少被遞送至正常組織。針對腫瘤特異性抗原的單克隆抗體已被用作指向腫瘤的靶向細胞毒性試劑，以改善治療指數(藥物的有效效應相較於其有害副作用的比率)。然而，單克隆抗體的使用可產生其它問題例如免疫原性，由此患者的免疫系統可產生針對抗體藥物綴合物的免疫反應。
[0006]因此期望具有安全有效並且可促進藥物穿過生物膜例如腸壁(在口服遞送中)和細胞膜(在疾病的治療中)的遞送的新型藥物遞送系統。本發明滿足該需要並且還提供相關有利方面。
[0007]發明概述
[0008]本發明涉及使用天然存在的維生素運輸系統進行的藥物活性化合物例如小分子藥物、蛋白質、肽和寡核苷酸穿過生物屏障的遞送。在一個方面，本發明涉及使用維生素B12運輸系統進行的藥物活性化合物的遞送，所述運輸系統通過將化合物包含在納米載體(例如，但不限於，含有有表面連接的維生素B12或衍生物的納米結構)中而在運輸過程中保護藥物活性化合物。在一些實施方案中，納米載體由合成、半合成聚合物或天然存在的聚合物製造而來。在其它實施方案中，納米載體由包含任選地與聚合物和/或其它藥學上可接受的賦形劑混合的活性劑的含聚合物納米顆粒核心製備而來。在其它實施方案中，納米載體是由具有親水末端基團的疏水分子製造而來的脂質體或膠束。
[0009]本發明還涉及用於製備納米載體、含所述納米載體的藥物組合物和使用納米結構進行藥物遞送和治療疾病的方法。
[0010]令人驚訝地，本 申請人:發現能夠進行藥物遞送的納米載體可摻入小的親水性維生素B12分子或其衍生物(作為主要靶向基團)和任選地其它物理結合的或共價連接的分子(用於靶向或遞送)來形成。本發明的納米顆粒系統可用於捕獲在納米載體內的藥物活性化合物和/或結合於載體系統的一個組分的藥物活性化合物的藥物遞送。通過本發明的納米載體系統進行的藥物遞送可以是口服藥物遞送，其中納米載體被從腸腔轉移進入血流，和/或通過血流中納米載體至身體中患病細胞的靶向，所述細胞過表達促進維生素B12和/或其它納米載體連接的靶向基團的細胞吸收的受體。
[0011 ] 因此，在一個實施方案中，本公開內容提供了納米顆粒，所述納米顆粒包含被一種或多種聚合物封裝的治療劑和通過接頭基團連接於至少一種聚合物的維生素B12或其衍生物，或可選擇地基本上由其組成或由其組成。在一個方面，納米顆粒還包含除維生素B12外的連接於至少一種聚合物的祀向試劑。
[0012]在另一個實施方案中，本公開內容提供了膠束，所述膠束包含被膠束封裝的治療劑和連接於膠束作為靶向試劑的維生素B12或其衍生物，或可選擇地基本上由其組成或可選擇地由其組成。在一個方面，膠束還包含除連接於膠束的維生素B12外的第二靶向試劑。
[0013]還提供了包含上述實施方案的任一個的膠束或可選擇地基本由其組成或由其組成的脂質體。在一個實施方案中，還提供了脂質體，所述脂質體包含被脂質體封裝的治療劑和連接於脂質體作為靶向試劑的維生素B12或其衍生物，或可選擇地基本上由其組成或可選擇地由其組成。
[0014]在一些方面，脂質體還包括連接於脂質體的除維生素B12外的第二靶向試劑或衍生物。
[0015]在上述實施方案的一個方面中，將維生素B12或其衍生物連接於納米顆粒的表面上的至少一種聚合物和/或包埋在納米顆粒或膠束內。將維生素B12或其衍生物共價地或物理地連接於一個或多個聚合物。物理連接的非限定性實例包括VB12衍生物上的帶電荷的基團與納米顆粒或膠束的帶相反電荷的區域的之間的靜電結合相互作用，或VB12衍生物上的疏水基團與納米顆粒或膠束的疏水區域之間的疏水結合相互作用。VB12衍生物的非限定性實例包括VB12-5』 -O-羧基三氮唑、VB12-5』 -O-羧基咪唑、VB12-5』 -O-羧醯氨-C2-C20-烷基胺、VB12-5』 -O-羧醯氨-寡聚乙烯氧基胺和上述化合物的二羧酸衍生物。
[0016]在上述實施方案的另一個`方面中，一種或多種聚合物包含可降解的聚合物或穩定的聚合物，例如，以下一種或多種:葡聚糖、羧甲基葡聚糖、殼聚糖、三甲基殼聚糖或聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乙烯醇(PVA)、聚酐、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯酸酯、葡聚糖、殼聚糖、纖維素、羥丙甲纖維素、澱粉、樹狀聚合物、肽、蛋白質、聚乙二醇和聚(乙二醇-共-丙二醇)及上述聚合物的合成衍生物。
[0017]在上述實施方案的另一個方面中，連接VB12或衍生物的接頭是相同的或不同的，選自短肽鏈(H-[NHCHR_C0]n-0H)，其中η為1_20並且R對於η個胺基酸中的每一個胺基酸是相同的或不同的，是已知存在於天然胺基酸中的22個側基之一；短的烷基鏈(CH2)n，其中η=2-10，末端為兩個氨基或兩個羧基，或一個氨基和一個羧基；寡聚乙烯氧鏈(CH2CH2O)η，其中η=2-100，末端為兩個氨基或兩個羧基，或一個氨基和一個羧基；平均分子量為2kDa至70kDa的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)鏈，末端為兩個氨基或兩個羧基，或一個氨基和一個羧基；以及上述接頭的任何接頭的兩個或更多個的任意組合。
[0018]治療劑的非限定性實例選自小的或大的合成分子、蛋白質、肽、糖蛋白、核苷、核苷酸、人源化單克隆抗體、非人源化單克隆抗體、人源化和/或非人源化單克隆抗體的治療相關片段以及用於進行RNA幹擾(RNAi)試劑(包括dsRNA、siRNA、miRNA或反義RNA或其組合)。在一些方面，治療劑選自鎮痛藥、抗過敏藥、抗心絞痛藥、抗心律失常藥、抗生素、抗凝齊?、抗痴呆藥、抗抑鬱藥、抗糖尿病藥、抗組胺、抗高血壓藥、抗炎藥、抗腫瘤藥、抗寄生蟲藥、退熱劑、抗逆轉錄病毒藥、抗潰瘍藥、抗病毒劑、心血管藥、降膽固醇藥、CNS活性藥、激素、生長激素抑制劑、生長激素、補血藥、止血劑、低血壓利尿藥、角質離解劑、用於骨質疏鬆症的治療劑、疫苗、血管收縮劑和血管擴張藥。
[0019]還提供了組合物。在一個實施方案中，組合物包含上述實施方案的載體和納米顆粒、膠束或脂質體的一種或多種，或可選擇地基本上由其組成，或可選擇地由其組成。在一個方面，載體是藥學上可接受的載體。在另一個方面，組合物被配製來用於口服施用。
[0020]在另一個實施方案中，本公開內容提供了用於體內遞送治療劑的方法，包括給受試者施用有效量的上述實施方案的任何實施方案的納米顆粒、膠束、脂質體或組合物，從而遞送治療劑。還提供了上述實施方案的任何實施方案的納米顆粒、膠束、脂質體或組合物用於製備藥劑的用途。
[0021]在其它實施方案中，提供了用於製備納米顆粒的方法，其包括如下步驟，或可選擇地基本上由所述步驟組成，或可選擇地由所述步驟組成:將治療劑與至少一種聚合物(維生素Β12或其衍生物通過接頭基團連接於所述聚合物)於適當的溶劑中混合，任何地，其中聚合物對治療劑的比率在選自I至15%、I至40%、5至50%、5至40%、5至30%、10至35%或10至30%或其組合的範圍內。
[0022]在一個方面，所述方法還包括將除維生素Β12或衍生物外的第二靶向試劑在適當的溶劑中混合。在另一個方面，所述方法還包括將除維生素Β12外的第二靶向試劑連接於至少一種聚合物。在另一個方面，所述方法還包括修飾納米顆粒以進行納米顆粒的組分的交聯，其中組分包含金屬離子、具有至少兩個帶正電荷的基團或兩個帶負電荷的基團的小分子，或反應以形成至少兩個共價鍵的小分子。在另一個方面，溶劑是>50%的水。
[0023]在另一個方面，方法還包括從溶劑分離、純化和/或乾燥所得的納米顆粒。在一個方面，通過溶劑蒸發分離納米顆粒。在另一個方面，通過透析或切向流過濾分離納米顆粒。在另一個方面，通過過濾或離心 分離納米顆粒。在另一個方面，通過添加共溶劑，隨後過濾或離心分離納米顆粒。
[0024]在另一個方面，方法還包括通過用適當的溶劑洗滌納米顆粒來純化納米顆粒。
[0025]附圖概述
[0026]圖1描述了其中R代表如隨後定義的單齒配位軸向配體的維生素Β12的結構。在本發明的上述表現的任一表現中，維生素Β12可直接或通過適當的接頭附著至納米顆粒的上述組分之一。維生素Β12附著可通過維生素Β12的核糖單位上的2』或5』 -氧原子(如美國專利6，150.341所舉例說明的)或通過一個或多個醯胺基至羧基的轉化和隨後接頭基團的添加(參見，例如，Waibel等人，Cancer Res.，2008，68，2904-2911)或通過用可結合鈷的雙功能配體或化合物替代維生素B12的鈷原子上的軸向配體(R)來進行，如美國專利6，262，253中所舉例說明的。
[0027]圖2描述了本發明的3個示例性納米顆粒結構,稱為納米膠囊(nanocapsule)、聚合物納米顆粒和納米顆粒。在納米膠囊中，用天然或合成聚合物或脂質(在膠束或脂質體的情況下)包被藥物或利用聚合物和/或其它藥學上可接受的賦形劑配製的藥物(在納米顆粒的中心以白色顯示的)的小納米顆粒。維生素B12(以黑色圓圈描述的)和任選地其它靶向基團(灰色和白色圓圈)通過任選的接頭基團共價或物理地結合至納米顆粒的表面。在聚合物納米顆粒的情況下，將形成納米顆粒的藥物、聚合物和任選地藥學上可接受的賦形劑緊密地混合。可在納米顆粒形成之前將維生素B12和任選的其它靶向基團結合於聚合物或可在納米顆粒形成之後連接它們。對於牽涉連接靶向基團的聚合物的納米顆粒形成，可將一些靶向基團包埋在納米顆粒中，將一些呈現在納米顆粒的表面上。在藥物納米顆粒的情況下，任選地包含其它賦形劑的聚合物的薄層覆蓋藥物或藥物與其它賦形劑的混合物的更大的納米顆粒。可在包被之前將靶向基團連接於聚合物或在包被藥物納米顆粒之後將其連接於聚合物。
[0028]圖3是顯示Abraxane或Cobrazane綴合物對腫瘤生長的抑制的曲線。用人白血病K562細胞植入無胸腺裸鼠，使異種移植腫瘤生長至150 - 200mm3的尺寸。將動物隨機分組(每組7隻),用鹽水對照、Abraxane (200mg/kg紫杉醇)或Cobraxane (100或200mg/kg紫杉醇)腹膜內注射給藥，每周測量腫瘤尺寸約3次。曲線顯示所有3個活性組的腫瘤生長抑制(相對於鹽水對照)。紫杉醇劑量為50%的Cobraxane優於Abraxane,等劑量的Cobraxane事實上減小腫瘤尺寸。
[0029]發明詳述
[0030]將本文中引用的所有技術和專利公布通過引用整體併入本文。
[0031]所有數字名稱例如pH、溫度、時間、濃度和分子量，包括範圍，都是以0.1或1.0(視情況而定)的增量變化((+)或(_))的近似值。應當理解，儘管並未總是明確地聲明，但所有數字名稱之前冠以術語「約」。還應理解，儘管並未總是明確地聲明，但本文中描述的試劑僅僅是示例性的並且這樣的等同物在本領域是已知的。
[0032]如本說明書和權利要求中所使用的，除非另外明確地另有所指，否則單數形式「一種」、「一個」和「所述」包括複數所指物。
[0033]「包含」是指包括引述的元素的化合物、組合物和方法，但不排除其它。「基本上由……組成」，當用於定義化合物、組合物或方法時，應當意指不包括顯著影響所述技術的基本和新型特徵的其它元素。「由……組成」應當意指不包括未在權利要求中指定的任何元素、步驟或成分。由這些過渡術語的每一個定義的實施方案在本技術的範圍內。
[0034]如本文中所用，「納米顆粒」、「納米載體」或「納米結構」是指直徑小於約I微米的微觀粒子。在一些實施方案中，納米顆粒的尺寸範圍為約Inm至約1，OOOnm的直徑或可選擇地約IOnm至約lOOOnm、或可選擇地約IOnm至約900nm、或可選擇地約IOnm至約800nm、或約IOnm至約700nm、或可選擇地約IOnm至約600nm、或可選擇地約IOnm至約500nm、或可選擇地約20nm至約1000 ;或可選擇地約20nm至約800nm、或可選擇地約20nm至約700nm、或可選擇地約20nm至約600nm、或可選擇地約20nm至約500nm ;或可選擇地約30nm至約lOOOnm、或可選擇地約30nm至約900nm、或可選擇地約30nm至約800nm、或可選擇地約30nm至約700nm、或可選擇地約IOOnm至約900nm、或可選擇地約200nm至約lOOOnm、或可選擇地約300nm至約lOOOnm、或可選擇地約400nm至約lOOOnm、或可選擇地約500nm至約1000nm ；或可選擇地約600nm至約1000nm ;或可選擇地約700nm至約1000nm ;或可選擇地約800nm至約1000nm ;或可選擇地約900nm至約1000nm ;或可選擇地約IOOnm至約300nm ;或可選擇地約200nm至約600nm ;或可選擇地約300nm至約600nm ;或可選擇地約500nm至約800nm。
[0035]如本文中所用，「聚合物」是指通常由通過共價化學鍵連接的重複結構單位組成的天然存在的、合成的或半合成的大分子(高分子)。用於執行本發明的聚合物具有在I至5000kDa的範圍內的分子量。聚合物可以是穩定的，可降解的以及由隨機共聚物或嵌段共聚物構成的。
[0036]如本文中所用，「隨機共聚物」是指包含兩個或更多個重複結構單位的聚合物，其中單個重複結構單位的序列是隨機的和非預定的或確定的。
[0037]如本文中所用，「嵌段共聚物」是指包含兩個或更多個重複結構單位的聚合物，其中單個重複單位彼此連接在完整聚合物鏈內形成可辯認的重複結構單位的嵌段。
[0038]如本文中所用，「帶電荷的基團」是指被完全電離，從而導致具有帶正荷或負電荷，或可能地多個正電荷或多個負電荷的化學官能團。聚合物可具有多個帶電荷的基團作為聚合物鏈的組分，和/或作為至聚合物的附著(直接附著或通過接頭的方式)。聚合物的帶電荷的基團可以是天然存在的或合成的。帶電荷的基團可以是治療活性化合物的部分，作為該化合物的原有組分或作為治療活性化合和折合成類似物，例如前體藥物。
[0039]如本文中所用，「可電離基團」是指在生理pH或接近生理pH下被部分電離，從而導致該基團具有部分正電荷或部分負電荷的化學官能團。可電離基團的電荷可隨PH而變化。聚合物可具有多個可電離基團作為聚合物鏈的組分，和/或作為至聚合物的附著物(直接連接或通過接頭連接)。聚合物可電離基團可以是天然存在的或合成的。可電離基團可以是治療活性化合物的部分(作為該化合物的原有組分或作為治療活性化合物的合成類似物例如前體藥物)。
[0040]如本文中所用，「聚合電解質絡合物」或「PEC」是指由兩個或更多個具有化學官能團的化合物之間的多個離子鍵的形成產生的三維結構，所述化學官能團是帶電荷的和/或可電離的，其中至少一種化合物具有淨負電荷並且至少一種化合物具有淨正電荷，至少一種化合物優選是聚合物。PEC的直徑通常可在Inm至數微米的範圍內，平均顆粒尺寸和顆粒尺寸分布受構成組分的化學和物理性質以及製備方法控制。PEC可以是水溶性的(即納米顆粒在水中的懸浮導致清澈透明的液體)或不溶於水的(即納米顆粒在水中的懸浮導致混濁的液體)。PEC納米顆粒通常可在約Inm至約1，OOOnm直徑的範圍內，或可選擇地在約5nm至約400nm或可選擇地約IOnm至約300nm的範圍內。
[0041]如本文中所用，術語「多核苷酸」包括脫氧核糖核酸(DNA)，以及適當時，核糖核酸(RNA)。術語還應當被理解為包括從核苷酸類似物製備的RNA或DNA的等同物、衍生物、變體和類似物並且，同樣地適用於描述的實施方案，單鏈(有義或反義)和雙鏈多核苷酸。脫氧核糖核苷酸包括脫氧腺苷、脫氧胞苷、脫氧鳥苷和脫氧胸苷。為了清楚起見，當在本文中提及核酸時，其可以是DNA或RNA，使用術語「腺苷」、「胞苷」、「鳥苷」和「胸苷」。應理解，如果核酸是RNA，則具有尿嘧啶的核苷酸是尿苷。
[0042]術語「多核苷酸」和「寡核苷酸」可互換使用，是指具有任何長度的核苷酸的聚合物形式(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物)。多核苷酸可具有任何三維結構，以及可進行任何功能(已知的或未知的)。下列是多核苷酸的非限定性實例:基因或基因片段(例如，探針、引物、EST或SAGE標籤)、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重組多核苷酸、分枝多核苷酸、質粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可包含修飾核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，可在多核苷酸裝配之前或之後賦予對核苷酸結構的修飾。核苷酸的序列可被非核苷酸組分中斷。可在聚合之後，例如通過用標記組分綴合來進一步修飾多核苷酸。術語還指雙鏈和單鏈分子。除非另外指定或要求，否則作為多核苷酸的本發明的任何實施方案包括雙鏈形式和已知或預測組成雙鏈形式的兩個互補單鏈形式的每一個。
[0043]多核苷酸由如下4種核苷酸鹼基的特定序列組成:腺嘌呤㈧、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸嘌嘧啶(T);和當多核苷酸是RNA時，替代胸苷的尿嘧啶(U)。因此，術語「多核苷酸序列」是多核苷酸分子的字母表示。可將該字母表示輸入具有中央處理器的計算機中的資料庫並且用於生物信息學應用例如功能基因組和同源性研究。術語「多態性」是指基因或其部分的超過一種形式的共存。基因的存在至少兩種不同形式即至少兩個不同的核苷酸序列的一部分稱為「基因的多態性區域」。多態性區域可以是單核苷酸，其身份在不同的等位基因中不同。
[0044]如本文中所用，術語「載體」包括任何標準載體例如磷酸緩衝鹽溶液、緩衝液、水和乳劑，例如油/水或水/油乳劑以及不同類型的溼潤劑。組合物還可包含穩定劑和防腐劑。在本發明的一個方面，載體是緩衝溶液例如但不限於PCR緩衝液。
[0045]「基因遞送載體」被定義為可將插入多核苷酸運載進入宿主細胞的任何分子。基因遞送載體的實例是脂質體、生物相容性聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒包膜；金屬顆粒；和細菌，或病毒例如肝狀病毒、腺病毒和逆轉錄病毒、噬菌體、粘粒、質粒、真菌載體，以及通常用於本領域的已就在多種真核和原核宿主中的表達進行了描述的並且可用於基因療法以及用於簡單的蛋白質表達的其它重組載體。
[0046]「基因遞送」、「基因轉移」等，如本文中所用，是指外源多核苷酸(有時稱為「轉基因」)至宿主細胞內的引入，無論用於引入的方法。此類方法包括多種已知的技術例如載體介導的基因轉移(通過，例如，病毒感染，有時稱為轉導)、轉染、轉化或各種其它基於蛋白質或基於脂質的基因遞送複合物)以及有利於「裸露的」多核苷酸的遞送的技術(例如電穿孔、「基因槍」遞送和各種其它用於多核苷酸的引入的技術)。除非另有所指，否則術語轉染的、轉導的或轉化的可在本文中互換 使用，表示外源多核苷酸或來自其的表達多肽在細胞中的存在。引入的多核苷酸可穩定或瞬時維持於宿主細胞中。穩定的維持通常需要引入的多核苷酸包含與宿主細胞相容的複製起始區或至宿主細胞的複製子的整合例如染色體外複製子(例如，質粒)或細胞核或線粒體染色體。已知許多載體能夠介導基因至哺乳動物細胞的轉移，這在本領域中是已知並且在本文中進行了描述。
[0047]「RNA幹擾」(RNAi)是指基因表達(蛋白質合成)的序列特異性或基因特異性抑制，其由短幹擾RNA(siRNA)介導。
[0048]「短幹擾RNA」(siRNA)是指能夠介導RNA幹擾(RNAi)的雙鏈RNA分子(dsRNA)，長度通常為約10至30個核苷酸,或長度為11個核苷酸,長度為12個核苷酸,13個核苷酸,長度為14個核苷酸，長度為15個核苷酸,長度為16個核苷酸,長度為17個核苷酸,長度為18個核苷酸，長度為19個核苷酸，長度為20個核苷酸，長度為21個核苷酸，長度為22個核苷酸，長度為23個核苷酸，長度為24個核苷酸，長度為25個核苷酸，長度為26個核苷酸，長度為27個核苷酸，長度為28個核苷酸，或長度為29個核苷酸。如本文中所用，術語siRNA包括短髮夾RNA (shRNA)。針對基因或基因的mRNA的siRNA可以是識別基因的mRNA並且指導針對mRNA的RNA誘導的沉默複合物(RISC)，導致mRNA的降解的siRNA。針對基因或基因的mRNA的siRNA還可以是識別mRNA並且抑制mRNA的翻譯的siRNA。
[0049]「雙鏈RNA」 (dsRNA)是指可具有任何長度並且可在細胞內被切割成更小的RNA分子例如siRNA的雙鏈RNA分子。在具有有活性的幹擾素反應的細胞中，更長的dsRNA例如在長度上長於約30個鹼基對的dsRNA可觸發乾擾素反應。在不具有有能力的幹擾素反應的其它細胞中，dsRNA可用於觸發特異性RNAi。
[0050]microRNA或miRNA是具有21-23個核苷酸的單鏈RNA分子，其調苄基因表達。miRNA由它們從其DNA轉錄的基因編碼，但miRNA不翻譯成蛋白質(非編碼RNA);相反地每一個初級轉錄物(pr1-miRNA)被加工成稱為前-miRNA的短莖環結構，最終加工成功能miRNA。成熟miRNA分子與一種或多種信使RNA (mRNA)分子部分互補，它們的主要功能是下
調基因表達。
[0051]如本文中所用，siRNA載體、dsRNA載體或miRNA載體是指包含調節RNA的表達的啟動子的質粒或病毒載體。「siRNA啟動子」或調節siRNA、dsRNA或miRNA的表達的啟動子在本領域已知，例如 Miyagishi 和 Taira(2002)Nature Biotech.20:497-500 中描述的 U6啟動子，和Brummelkamp等人.(2002) Science296:550-3中描述的Hl啟動子。
[0052]如本文中所用，「可降解聚合物」是指可在特定條件下分解成更小的單位的聚合物。在一個方面，聚合物單位在原位(在體內)的重複降解允許小片段被排洩或否則消除。
[0053]如本文中所用，「穩定的聚合物」是指其中聚合物的主要結構(主鏈)不能在通常在體內發現的條件下分解的聚合物。在穩定的聚合物中，連接於聚合物主鏈的功能性基團仍然可能可在通常見於身體中的條件下被修飾或降解。
[0054]如本文中所用，「 烷基」是僅包含碳和氫原子(如果另外地未被取代的話)的飽和(不包含多個碳-碳鍵)脂肪族(不包含移位的η -電子系統)烴。名稱(nlC - n2C)烷基，其中nl和n2是I至6的整數，是指包含nl至n2 (並且包括n2)個碳原子的直鏈或支鏈烷基。本文中的烷基可以任選地被一個或多個選自滷素、羥基、烷氧基、芳氧基、羰基、硝基、氰基、竣基和燒氧擬基的實體取代。
[0055]如本文中所用，「接頭」是指用於將聚合物主鏈偶聯至另一個官能團或基團以空間隔離兩個實體的一群原子。因此，本發明的接頭具有基本上縱貫的軸，即，其基本上是線性的而非高度分枝的或成團的，雖然因由共價鍵合的原子之間所需的鍵角施加於結構的角度約束，結構當然不是嚴格線性的。接頭的實例包括但不限於包含官能團例如羧基、氨基、羥基和巰基的直鏈和支鏈烷基和烯基，通過所述官能團可形成共價鍵以將接頭連接至聚合物和其它組分。優選接頭是短肽鏈(H-[NHCHR_C0]n-0H)，其中η為1_20，或可選擇地1_18，或可選擇地1-16，或可選擇地1-14，或可選擇地1-12，或可選擇地2-14，或可選擇地2_12，或可選擇地3-20，或可選擇地4-18，或可選擇地5-20，或可選擇地5_18，並且R對於η個胺基酸中的每一個胺基酸是相同的或不同的，是已知存在於天然胺基酸中的22個側基之一，其中接頭是相同的或不同的，選自短肽鏈(H-[NHCHR-C0]η-ΟΗ)，其中η為1_20並且R對於η個胺基酸中的每一個胺基酸是相同的或不同的，是已知存在於天然胺基酸中的22個側基之一；短的烷基鏈(CH2)n，其中η=2-10，末端為兩個氨基或兩個羧基，或一個氨基和一個羧基；寡聚乙烯氧(oligoethyleneoxy)鏈(CH2CH2O)n,其中n=2_100,末端為兩個氨基或兩個羧基，或一個氨基和一個羧基；平均分子量為2kDa至70kDa的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)鏈，末端為兩個氨基或兩個羧基，或一個氨基和一個羧基；-c (O) NH (CH2) 6NH- ；-C (O) NH (CH2) 6NHC (0) CH2- ；-C (0) NH (CH2CH2O) 2CH2CH2NH- ；-C (0)NH (CH2CH2O) 2CH2CH2NHC (0) CH2 [OCH2CH2] 23NH-或其任意組合。可通過本領域已知的縮合反應(產生醯胺鍵)之一將肽接頭整合進入聚合物化合物。
[0056]如本文中所用，「治療劑」是指當給患者施用時可提供有益效應的化合物、化合物的混合物或生物製劑。
[0057]如本文中所用，「胺基酸」是指包含通常被一個碳原子分隔的氨基(-NH2)和羧基(-C00H)的化合物。中心碳原子可包含取代基，所述取代基可以是帶電荷的，可電離的，親水的或疏水的。蛋白質的22個基本構件塊的任一個具有式NH2-CHR-C00H，其中R對於每一個特定胺基酸是不同的，立體化學以』L』構型存在。此外，術語「胺基酸」可任選地包括具有非天然』D』立體化學的胺基酸以及』D』和』L』胺基酸的修飾形式。
[0058]如本文中所用，「肽」是指胺基酸的鏈，其中每一個胺基酸通過醯胺鍵的形成連接至下一個胺基酸。肽通常被認為由達到30個胺基酸，或可選擇地達到25個胺基酸，或可選擇地達到20個胺基酸，或可選擇地達到15個胺基酸，或可選擇地達到10個胺基酸，或可選擇地達到5個胺基酸，或可選擇地約5-10個胺基酸，或可選擇地約10-15個胺基酸組成，然而術語「蛋白質」用於包含更長的胺基酸鏈的化合物。
[0059]如本文中所用，「糖蛋白」是指包含許多糖取代基的蛋白質。
[0060]如本文中所用，「滷代」或「滷素」是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)和碘(I)。
[0061]如本文中所用，伯、仲或叔烷基胺是指RNH2、RR」NH或RR』 R」 N基團，其中R、R』和R」獨立地代表(但不限於)烷基、環烷基、芳基、雜芳基和雜脂環部分。
[0062]如本文中所用，「維生素B12」或「VB12」(除非另有所指，否則包括VB12衍生物和VB12的類似物)是指系列另外地 稱為鈷胺素的化合物，其在結構上是相同的，變化僅在於連接至VB12鈷原子的單齒軸向配體(monodentate axial ligand)的性質,所述配體通常可以是氰化物(氰鈷酸)、甲基(甲基鈷胺素)、羥基(羥鈷胺素)或一氧化氮(亞硝醯鈷胺素)。在本領域中已知VB12衍生物可以例如通過在適當的條件下改變軸向配體來製備，將這樣的配體交換包括為本公開內容的部分。VB12衍生物的非限定性實例包括VB12-5』 -O-羧基三氮唑、VB12-5』 -O-羧基咪唑、VB12-5』 -O-羧醯胺-C2-C20-烷基胺、VB12-5』 -O-羧醯胺-寡聚亞乙氧基胺(oligoethyleneoxyamine)和上述化合物的二羧酸衍生物。VB12至脂質、納米顆粒和聚合物系統的連接(以產生本文中描述的遞送系統)可通過將一個或多個醯胺轉化成羧基，隨後使用游離羧基形成共價健來實現。或者，針對VB12的核糖單位的兩個羧基之一的共價鍵的形成可被使用。或者，可將VB12連接至聚合物系統，這可能也通過將適當的單齒配位配體通過任選的接頭添加至聚合物，在VB12的鈷原子與聚合物連接的單齒配位配體之間形成金屬配位鍵來實現。
[0063]如本文中所用，「疾病」或「醫學病況(medical condition)」是損害軀體功能,與特定的症狀和體徵關聯的生物體的異常狀況。
[0064]如本文中所用，術語「癌症」是指不同類型的惡性腫瘤，其大部分可侵入周圍組織，並且可轉移至不同部位，如由 Stedman’s Medical Dictionary,第 25 版(Hensyl ed.1990)定義。可使用本發明的化合物治療的癌症的實例(無限制性地)包括但不限於腦癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、口腔癌、皮膚癌和血癌。
[0065]如本文中所用，「親腫瘤(tumor-seeking)」基團是指已知優先搜出並且結合至贅生性細胞上的表面結構(所述表面結構不存在於正常細胞中或被正常細胞以顯著更小的程度表達)的實體或優先在腫瘤而非正常組織中積累的實體。
[0066]如本文中所用，術語「治療」(「treat'「treating'「treatment」)是指減輕或消除疾病和/或其伴隨症狀的方法。效應就完全或部分防止障礙或其體徵或症狀而言可以是預防性的，和/或就部分或完全治癒障礙和/或歸因於障礙的有害作用而言可以是治療性的。例如，患有癌症的個體的壽命可延長和/或疾病的一個或多個症狀可減少。
[0067]如本文中所用，「給藥」、「施用」或「施藥」是指以適合於治療特定疾病例如癌症的方式將本發明的化合物或包含本發明的化合物的藥物組合物遞送給患者。「施藥」可在整個治療過程中以一個劑量連續地或間歇地進行。確定施用的最有效方法和劑量的方法對於本領域普通技術人員來說是已知的，並且可用於治療的組合物、治療目的、待治療的靶細胞和待治療的受試者而變化。單次或多次施用可利用將由治療醫生選擇的劑量水平和模式來進行。適當的劑型和施用試劑的方法在本領域是已知的。還可確定施用途徑，並且確定最有效的施用途徑的方法對於本領域普通技術人員來說是已知的，將隨用於治療的組合物、治療目的、待治療的受試者的健康狀況或疾病分期以及靶細胞或組織而變。施用途徑的非限定性實例包括口服施用、經鼻施用、注射和局部塗藥。
[0068]「患者」或「受試者」是指易患疾病的任何高等生物。這樣的高等生物的實例包括但不限於小鼠、大鼠、兔、狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、魚和爬行動物。在一些實施方案中，「患者」或「受試者」是指人類。
[0069]如本文中所用，術語「治療有效量」是指具有如下效應的本發明的化合物或化合物的組合的量:(a)防止障礙在可能對障礙易感，但可以還未被診斷為患有其的受試者中發生；(b)抑制障礙，即停止其發展；或(C)減輕或改善障礙。例如，但不限於，(I)減小腫瘤的尺寸；⑵抑制(即，減慢至一定程度，優選停止)腫瘤轉移；⑶一定程度地抑制(即減慢至一定程度，優選停止)腫瘤生長；(4)減輕至一定程度(或優選消除)與癌症相關的一個或多個症狀；和/或(5)延長患者存活時間。
[0070]如本文中所用，「藥物組合物」是指一種或多種本發明的化合物與其它化合物例如藥學上可接受的賦形劑或載體的混合物。藥物組合物的目的是促進本發明的化合物至患者的施用。
[0071]如本文中所用，「藥學上可接受的賦形劑」或「藥學上可接受的載體」是指對生物體不引起顯著刺激並且不消除施用的組合物的生物活性和性質的賦形劑。「藥學上可接受的載體」或「藥學上可接受的賦形劑」是指可用於本發明的組合物的任何稀釋劑、賦形劑或載體。此類賦形劑或載體包括但不限於離子交換劑、鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白質例如人血清白蛋白、緩衝物質例如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、鹽或電解質例如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體矽、三矽酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、基於纖維素的物質、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、石蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物、聚乙二醇和羊毛脂。適當的藥物載體描述於《雷氏藥學大全》(Remington’s Pharmaceutical Sciences) , Mack Publishing Company,本領域的標準參考書。優選就期望的施用形式即口服片劑、膠囊、酏劑、糖漿劑等選擇它們，它們與常規藥物實踐一致。
[0072]用於進行本發明的方法[0073]在一個方面，本發明涉及納米顆粒，所述納米顆粒通過將一種或多種治療劑與一種或多種合成、半合成或天然聚合物(其中維生素B12或其衍生物通過適當的接頭基團連接於至少一種聚合物)在導致納米顆粒形成的條件下一起置於適當的溶劑或溶劑混合物中來形成。任選地連接其它用於靶向或遞送的物理結合或共價連接的分子。可使用幫助納米顆粒形成或幫助將維生素B12或其衍生物置於納米載體的表面上的其它組分。聚合物和治療活性試劑可單獨地或與其它上述組分組合地形成納米顆粒。
[0074]在其它方面，本發明涉及納米載體，所述納米載體通過將一種或多種合成、半合成或天然聚合物(其中維生素B12或其衍生物通過適當的接頭基團連接於至少一種聚合物)在導致納米載體形成的條件下一起置於適當的溶劑或溶劑混合物中來形成。任選地連接其它用於靶向或遞送的物理結合或共價連接的分子。可包括幫助納米顆粒形成或幫助將維生素B12置於納米載體的表面上的其它組分。聚合物可單獨地或與其它上述組分組合地形成納米顆粒。在納米載體形成後將一種或多種治療劑注入納米載體以完成藥物遞送系統。
[0075]在其它方面，本發明涉及納米顆粒，所述納米顆粒通過將治療劑或治療劑的混合物的晶體或非晶體納米顆粒與一種或多種合成、半合成或天然聚合物(其中維生素B12或其衍生物通過適當的接頭基團連接於至少一種聚合物)一起置於適當的溶劑或溶劑混合物中來形成。任選地連接其它用於靶向或遞送的物理結合或共價連接的分子。任選地，納米顆粒的形成可利用幫助用聚合物包被納米顆粒或幫助將維生素B12置於納米顆粒的表面上的其它組分。聚合物和治療活性試劑可單獨地或與其它上述組分組合地形成納米顆粒。
[0076]在其它方面，本發明涉及納米顆粒，所述納米顆粒通過首先通過將治療劑的溶液與一種或多種合成、半合成或天然聚合物在導致納米顆粒形成的條件下一起置於適當的溶劑或溶劑混合物中形成治療劑的聚合物納米顆粒來形成。隨後用一種或多種合成、半合成或天然聚合物(其中維生素B12或其衍生物通過適當的接頭基團連接於至少一種聚合物)包被所得的納米顆粒。任選地連接其它用於靶向或遞送的物理結合或共價連接的分子。可包括其它組分，所述組分幫助納米顆粒形成或幫助將維生素B12置於納米顆粒的表面上。聚合物和治療活性試劑可單獨地或 與其它上述組分組合地形成納米顆粒。
[0077]在其它方面，本發明涉及納米顆粒，所述納米顆粒通過首先通過將治療劑的溶液與一種或多種合成、半合成或天然聚合物在導致納米顆粒形成的條件下一起置於適當的溶劑或溶劑混合物中形成治療劑的聚合物納米顆粒來形成。任選地隨後用一種或多種合成、半合成或天然聚合物(其可包含或可以不包含共價連接的分子用於靶向或遞送)包被所得的納米顆粒。隨後將維生素B12或其衍生物通過適當的接頭基團通過物理或共價結合連接於納米載體的表面。可包括其它組分，所述組分幫助納米顆粒形成或幫助將維生素B12置於納米顆粒的表面上。聚合物和治療活性試劑可單獨地或與其它上述組分組合地形成納米顆粒。
[0078]在其它方面，本發明涉及裝載藥物的脂質體或膠束，所述脂質體或膠束通過本領域已知的方法來形成，其包含脂質(具有親水末端基團的疏水分子)的混合物，只要一些形成納米載體的脂質具有通過適當的接頭基團連接於脂質的疏水部分的維生素B12即可。任選地連接用於靶向或遞送的其它物理結合或共價連接的分子。可包括其它組分，所述組分幫助脂質體或膠束形成或幫助將維生素B12置於納米載體的表面上。脂質和治療活性試劑可單獨地或與其它上述組分組合地形成納米顆粒。[0079]在其它方面，本發明涉及裝載藥物的脂質體或膠束或納米顆粒，所述脂質體、膠束或納米顆粒描述於上文中，除形成無維生素B12或其衍生物和/或無其它物理結合或共價連接的用於靶向或遞送分子的裝載藥物的脂質體、膠束或納米顆粒外，並且維生素B12或其衍生物和其它任選的物理結合或共價連接的分子(用於靶向或遞送)在納米顆粒形成後被共價地或物理地連接。
[0080]在其它方面，本發明涉及從聚合物與藥物的混合物形成的納米顆粒或通過包被藥物或藥物-聚合物納米顆粒(如上文中所描述的)形成的納米顆粒，其中通過使用適當的交聯劑或適當的交聯劑的混合物交聯聚合物。可在納米顆粒形成之前、期間或之後引入交聯劑。
[0081]在其它方面，本發明涉及如所描述的，通過上述方法之一形成的納米顆粒，其中在藥物不存在的情況下形成納米顆粒，通過擴散將藥物引入形成的納米顆粒。
[0082]在一些實施方案中，納米顆粒通過將納米顆粒的組分一起置於含水環境中來形成，雖然也可使用本領域已知的其它溶劑系統。形成的納米顆粒可溶於或不溶於溶劑系統。可通過本領域已知的技術分離納米顆粒。例如,可溶性納米顆粒可通過用共溶劑沉澱,或通過除去溶劑(例如蒸發、冷凍乾燥或噴霧乾燥)來進行分離，任選地先進行純化方法例如切向流過濾(TFF)或離心超濾。不溶性納米顆粒可通過離心或過濾來分離，同樣的任選地先進行純化方法例如TFF。
[0083]隨後可利用標準方法將如上所述形成和分離的固體納米顆粒配製用於人或獸醫施用。例如，任選地利用適當的賦形劑，可能將納米顆粒配製成片劑或膠囊以用於口服施用，於小瓶中配製為凍幹或乾燥的製劑以隨後利用注射媒介物重建並且通過注射給人或動物施用，或配製為溶液或懸浮液以通過注射給人或動物施用。
[0084]本發明的納米顆粒的藥物製劑可用於口服藥物遞送和/或疾病靶向遞送多種治療劑，包括但不限於小的和大的合成分子、蛋白質、肽、糖蛋白、人源化和非人源化單克隆抗體和其治療相關片段以及用於實現單獨的或與基因遞送載體組合的多核苷酸的遞送的試劑。多核苷酸，包括例如為例如SiRNA、miRNA、dsRNA、mRNA和反義RNA以及DNA的試劑或編碼所述RNA幹擾(RNAi)的試劑，例如在基因療法應用中。
[0085]本發明的納米顆粒的藥物製劑可用於治療多種疾病，包括但不限於癌症、自身免疫病況、內分泌障礙、糖尿病、遺傳病況、染色體病況、病毒感染、細菌感染、寄生蟲感染、線粒體疾病、性傳播疾病、免疫障礙、平衡障礙、疼痛、全身性障礙、血液病況、血管病況、神經病況和肌肉、心臟和其它器官的病況。
[0086]在一個方面，提供了納米顆粒，所述納米顆粒包含用一種或多種穩定的或可降解的包含一種親水或疏水取代基的合成、半合成或天然聚合物包被的藥物納米顆粒，或可選擇地基本上由所述包被的藥物納米顆粒組成，並且維生素B12或其衍生物通過任選的接頭基團共價地連接於納米顆粒。
[0087]在一個方面，提供了納米顆粒，所述納米顆粒包含用一種或多種穩定的或可降解的疏水或親水的合成、半合成或天然聚合物包被的藥物納米顆粒，或可選擇地基本上由所述包被的藥物納米顆粒組成或由所述包被的藥物納米顆粒組成，並且維生素B12或其衍生物通過任選的接頭基團共價地連接於納米顆粒。
[0088]在一些實施方案中，合成、半合成或天然聚合物具有帶電荷或可電離的官能團，此類帶電荷的或可電離的基團可以相同或不同。
[0089]在一些實施方案中，上文指出的方面的納米顆粒還包含一種或多種選自聚乙二醇(PEG) ,PEG嵌段共聚物、聚乳酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺、合成聚合物、聚糖、表面活性劑和金屬離子的組分。
[0090]在一些實施方案中，將維生素B12或其衍生物連接於一種或多種所述組分。
[0091]在一些實施方案中，平均納米顆粒直徑在約20nm至約800nm的範圍內。
[0092]在一些實施方案中，納米顆粒被構造來用於受試者的口服施用。
[0093]在一些實施方案中，納米顆粒被構造來用於通過注射給受試者施用。
[0094]在一些實施方案中，納米顆粒被構造來通過靜脈內注射或輸注給受試者施用。
[0095]在一些實施方案中，納米顆粒被構造來用於通過腹膜內注射或輸注給受試者施用。
[0096]在一些實施方案中，納米顆粒被構造來用於給受試者皮下施用。
[0097]在一些實施方案中，納米顆粒被構造來用於通過局部敷用來給受試者施用。
[0098]在一些實施方案中，納米顆粒被構造來通過局部敷用來給受試者的黏膜表面施用。
[0099]在一些實施方案中，納米顆粒被構造來通過局部敷用來給受試者的皮膚施用。
[0100]在一些實施方案中，納米顆粒被構造來通過敷用來給受試者的眼睛的表面施用。
[0101]在一些實施方案中，聚合物的一種或多種可以是線性的、分枝的或交聯的多糖例如葡聚糖、纖維素、澱粉、殼聚糖、軟骨素、糖胺聚糖及其衍生物。
[0102]在一些實施方案中，聚合物的一種或多種是聚酯、聚酐、肽或蛋白質。
[0103]在一些實施方案中，聚合物的一種或多種是生物學上衍生的蛋白質或糖蛋白例如牛或人白蛋白。
[0104]在一些實施方案中，聚合物的一種或多種是聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)或聚乳酸乙醇酸(PLGA)。
[0105]在一些實施方案中，VB12是其中維生素B12的鈷原子上的軸向配體取代基是CN、Me、OH或NO的VB12衍生物。
[0106]在一些實施方案中，治療劑選自小的或大的合成或半合成分子、蛋白質、肽、糖蛋白、核苷、核苷酸、人源化單克隆抗體、非人源化單克隆抗體、人源化和/或非人源化單克隆抗體的治療相關片段，以及用於實現RNA幹擾(RNAi)的試劑例如dsRNA、miRNA、siRNA和反義 RNA。
[0107]siRNA可按照本領域已知的方法進行設計。參見，例如，Dykxhoorn, D.M.和Lieberman, J.(2006) 「Running Interference:Prospects and Obstacles to UsingSmall Interfering RNAs as Small Molecule Drugs,，，Annu.Rev.Biomed.Eng.8:377-402 ;Dykxhoorn, D.M.等人.(2006) 「The silent treatment:siRNAs as small moleculedrugs,，，Gene Therapy, 13:541-52 ；Aagaard, L.和 Rossi, J.J.(2007) 「RNAi therapeutics!Principles, prospects and challenges,，，Adv.Drug Delivery Rev.59:75-86 ；de Fougerolles, A.等人.(2007) 「Interfering with disease:a progress report onsiRNA-based therapeutics,，，Nature Reviews Drug Discovery6:443-53 ；Krueger, U.等人.(2007)「Insights into effective RNAi gained from large-scale siRNA validationscreening, 」01igonucleotidesl7:237-250 ;美國專利申請公布 N0.:2008/0188430 ;和美國專利申請公布N0.: 2008/0249055。
[0108]siRNA可利用本領域已知的方法來製備。參見，例如，Dykxhoorn, D.Μ.和Lieberman, J.(2006) 「Running Interference:Prospects and Obstacles to UsingSmall Interfering RNAs as Small Molecule Drugs, ^Annu.Rev.Biomed.Eng.8:377-402 ；Dykxhoorn, D.M.等人.(2006) 「The silent treatment:siRNAs as small moleculedrugs,，，Gene Therapy, 13:541-52 ；Aagaard, L.和 Rossi, J.J.(2007) 「RNAi therapeutics!Principles, prospects and challenges,，，Adv.Drug Delivery Rev.59:75-86 ；de Fougerolles, A.等人.(2007) 「Interfering with disease:a progress report onsiRNA-based therapeutics,，，Nature Reviews Drug Discovery6:443-53 ；Krueger, U.等人.(2007)「Insights into effective RNAi gained from large-scale siRNA validationscreening, 」01igonucleotidesl7:237-250 ;美國專利申請公布 N0.:2008/0188430 ;和美國專利申請公布N0.: 2008/0249055。[0109]siRNA可被化學修飾以增加其穩定性和安全性。參見,例如，Dykxhoorn, D.M.和Lieberman, J.(2006)「Running Interference:Prospects and Obstacles to Using SmallInterfering RNAs as Small Molecule Drugs,，，Annu.Rev.Biomed.Eng.8:377-402 和美國專利申請公布N0.:2008/0249055 ο
[0110]在一些實施方案中，治療劑選自止痛劑、抗過敏藥、抗心絞痛藥、抗心律失常藥、抗生素類、抗凝血藥、抗痴呆藥、抗抑鬱藥、抗糖尿病藥、抗組胺藥、抗高血壓藥、消炎藥、抗腫瘤藥、抗寄生蟲藥、退燒藥、抗逆轉錄病毒藥物、抗消化性潰瘍藥、抗病毒藥、心血管藥物、降膽固醇藥、中樞神經活性藥物、激素、生長激素抑制劑、生長激素類、補血藥、止血藥、降血壓利尿藥、角質離解劑、用於骨質疏鬆症的治療劑、疫苗、血管收縮劑和血管擴張劑。
[0111]在一個方面，提供了用於製備包含上述方面和實施方案的任何方面和實施方案的納米顆粒的納米顆粒組合物方法，所述方法包括將一種或多種合成或天然聚合物、治療劑和維生素Β12或其衍生物在適當的溶劑中組合，隨後分離、純化和/或乾燥納米顆粒，或可選擇地基本上由所述步驟組成或可選擇地由所述步驟組成。在一些實施方案中，溶劑為>50%的水。
[0112]在另一個方面，提供了用於製備包含上述方面和實施方案的任何方面和實施方案的納米顆粒的納米顆粒組合物的方法，所述方法包括將兩種不能混溶的溶劑和表面活性劑混合以產生乳劑，任選地交聯納米顆粒，以及分離、純化和/或乾燥所得的納米顆粒，或可選擇地基本上由所述步驟組成或可選擇地由所述步驟組成。
[0113]在一些實施方案中，納米顆粒通過溶劑蒸發、噴霧乾燥或冷凍乾燥來分離。
[0114]在一些實施方案中，納米顆粒通過過濾或離心來分離。
[0115]在一些實施方案中，納米顆粒通過添加共溶劑，隨後通過過濾或離心來分離。
[0116]在一些實施方案中，純化步驟通過用適當的溶劑洗漆納米顆粒來實現。
[0117]在一些實施方案中，上述方面還包括修飾納米顆粒以實現納米顆粒的組分的交聯。
[0118]在一些實施方案中，上述方面還包括修飾納米顆粒以通過物理或共價連接將維生素Β12類似物或其衍生物添加至納米顆粒的表面。[0119]在一些實施方案中，上述方面還包括修飾納米顆粒以取代軸向配體(replacementaxial ligand)取代連接的維生素B12的一個或多個鈷原子上的軸向配體。
[0120]在另一個方面，提供了包含上述方面的納米顆粒和藥學上可接受的賦形劑或載體的藥物組合物。
[0121]在一些實施方案中，組合物被配製為片劑、膠囊或液體。
[0122]在一些實施方案中，將組合物在容器中配製為凍乾粉劑以隨後在藥學上可接受的注射媒介物中重懸浮或溶解藥物組合物。
[0123]在一些實施方案中，將組合物在藥學上可接受的注射媒介物中配製為懸浮液或溶液。
[0124]在另一個方面，提供了用於治療受試者的方法，包括施用有效量的上述方面的任何方面的納米顆粒或上述方面的任何方面的藥物組合物，或可選擇地基本上由所述步驟組成，或可選擇地由所述步驟組成。
[0125]在一些實施方案中，治療劑是抗糖尿病藥。
[0126]在一些實施方案中，治療劑是激素。
[0127]在一些實施方案中，治療劑是抗腫瘤藥。
[0128]在一些實施方案中，本發明的納米顆粒利用溶劑提取/蒸發法或該方法的改進法來產生。
[0129]在一些實施方案中，本發明的納米顆粒通過用本文中描述的聚合物包被(利用提取/蒸發法或該方法的改進法)晶體或非晶體顆粒(以便聚合物或聚合物混合物產生包圍活性藥物試劑的殼)來製備，並且聚合物包被的顆粒保持在納米顆粒尺寸範圍內。
[0130]口服藥物遞送
[0131]許多技術已被建議用於增強藥物活性化合物的口服生物利用性。作為實例，特別活躍的研究的一個領域一直以來是用於口服遞送胰島素的技術的開發。Khafagy等人(Advanced Drug Delivery Reviews59 (2007) 1521 - 1546)將各種口服膜島素法分類為:吸收促進劑；酶抑制劑；黏膜粘著聚合物系統；微粒載體遞送系統；和靶向遞送系統。
[0132]吸收或滲透促進劑是這樣的分子，其增加膜的流動性或拓寬細胞的膜之間的連接，從而提供細胞旁和跨細胞藥物運輸的小的短暫改善。對於吸收促進劑，存在許多不同的對口服藥物遞送不利的方面:
[0133]通常地，它們應當稍先於藥物分子出現在吸收位置上，以提供最大可能的藥物吸收。一旦促進劑分子的濃度在膜位置上下降(例如，通過在GI道中連續運輸，或由於其本身被吸附或代謝)，則膜的滲透性返回正常。
[0134]增加膜滲透性允許增加所有鄰近的分子(不僅僅是藥物分子)的滲透。
[0135]酶抑制劑減緩活性劑，特別地蛋白質和肽在GI道中酶促降解的速率。原則上，這在吸收位置上提供了更高濃度的活性劑，導致通過更大的濃度梯度進行的更大的被動吸收。該效應僅對天然地能夠容易地擴散穿過腸壁的活性劑是有益的，並且只有通過活性化合物的酶促降解來阻止這樣做。此外，GI道中酶活性的抑制可產生顯著的有害效應，因為蛋白質降解的抑制將是非選擇性的。例如，酶抑制劑將減小食物蛋白質的分解速率(從而減少吸收)。
[0136]蠕動導致材料源源不斷地流入GI道。沿著小腸(在小腸中大多數藥物活性劑據認為被吸收)移動的材料在約3小時的平均時間內進行這樣的移動。如果可能延遲藥物的流動，並且在吸收的位置給它們提供更大的接觸，則應當可能實現更高水平的藥物吸收，否則所述藥物在GI道中不能被良好吸收。由於黏膜粘著聚合物系統對GI道腔的黏膜表面的短暫『粘著』，基於這樣的聚合物的製劑具有顯示在上皮細胞層上延長駐留的潛能，從而在GI道中相對於其它材料減慢此類顆粒的流動。當配製成顆粒時，黏膜粘著聚合物還可給包埋的活性劑提供一定的保護作用，否則所述活性劑在GI道中可能被降解。由於聚合物製劑與GI黏膜之間直接接觸，因此該口服藥物遞送系統的其它潛在有利方面是活性劑從顆粒直接擴散進入黏膜和上層細胞層的可能性，以及顆粒被胞飲進入上皮細胞的可能性。所有這些潛在益處表明基於黏膜粘著聚合物的口服藥物遞送系統應當是高度有效的，然而迄今為止文獻中許多實例的結果顯示使用黏膜粘著聚合物製劑的藥物活性化合物的口服生物利用性的僅不大的改善。
[0137]許多必需營養物和維生素的胃腸道吸收可通過主動運輸過程來增強。這些過程通常需要材料結合表面受體，所述受體起始了過程，例如受體介導的胞吞作用，活性劑通過該過程被吸收進入上皮細胞。受體-活性劑複合物的解離發生，隨後其它過程促進活性材料轉移進入血流。已在文獻中被詳盡地記錄的一個運輸系統是用於維生素B12(VB12)吸收的過程。從食物釋放的VB12結合內因子(intrinsic factor) (IF，其在胃中產生並且在進食後傳送至GI道中)，隨後VB12-1F複合物結合主要位於迴腸中的Cubulin受體。隨後如上所述的受體-介導的胞吞作用發生。受體-1F-VB12複合物在上皮細胞中的解離導致VB12的釋放，其隨後結合轉鈷胺素II (一種促進VB12至血流的轉移的蛋白質)。
[0138]Russell-Jones及其其它人已證明VB12在GI道中的吸收機制可用於促進其它化合物的口服吸收。通過使用『Trojan Horse』法，活性劑通過可降解的接頭基團共價連接於VB12,或通過可降解的接頭基團共價連接於也連接於VB12或封裝於VB12所連接的納米顆粒中的聚合物(參見圖2)。在聚合物法中，可將多個藥物-接頭基團連接於單個聚合物鏈。對於這些可能性的每一種可能性，如果VB12結合至接頭或顆粒以不阻止對IF的結合，則這些構建體將結合GI道中的IF，並且主要在迴腸中通過cubulin受體吸收並運輸至血流。隨後可降解的接頭的分解將藥物釋放在血流中，從而完成其口服吸收。類似地，通過從納米顆粒擴散和/或納米顆粒結構在血流中的分解產生的藥`物釋放將導致活性劑的生物利用性。在活性劑通過接頭單一地綴合至VB12時，對於每一個受體介導的胞吞事件，一個分子的藥物被吸收。通過比較，聚合物法允許一次吸收多個藥物分子，一個聚合物鏈作為連接於該聚合物鏈的VB12結合IF和cubulin的結果而被吸收。當與1:1綴合物比較時，這允許口服吸收的『擴大』。類似地，VB12納米顆粒可運載許多拷貝的藥物，還允許擴大藥物吸收。
[0139]許多描述單一 VB12綴合物、VB12-聚合物綴合物和VB12-包被的納米顆粒的專利是已知的，以下列專利為代表(將其全部通過引用整體併入本文):美國專利:5，428，023、5，449，720、US5, 548，064,5, 574，018,5, 589，463,5, 807，832,5, 863，900,5, 869，466、5，589，463,6, 083，926,6, 150，341,6, 159，502,6, 221，397,6, 262，253,6, 482，413。
[0140]在一些實施方案中，將藥物連接於VB12的共價鍵的形成可能不是利用該技術的優選方法。針對藥物的共價鍵的形成，其可被化學改變。對於已接受監管機構批准其用作藥劑的藥物，新的活性藥物成分(API)已產生，其需要完全藥物開發程序來獲得其批准。藥物的釋放需要切割可降解的接頭，這可留下仍然連接於藥物的接頭的片段，以便成為不同的化學實體。通過將藥物捕獲在VB12-包被的納米顆粒中，其保持化學上不被改變，這樣先前批准的藥物應當不需要完全開發程序來讓監管機制批准該藥物的VB12-包被的納米顆粒製劑。
[0141]許多用於形成納米顆粒和利用這樣的納米顆粒進行藥物遞送的方法報導於文獻中。此外，用於口服藥物遞送的VB12-包被的納米顆粒已有描述(美國專利N0.6，159, 502 ；6，482，413 ;和公布N0.W02007131286)。這些專利中描述的製劑都不是從基礎研究推進至臨床的，因為這些技術的每一個具有重大的技術問題；例如較差的封裝/藥物對載體的微弱結合。本領域已知的製備方法還可引起蛋白質、肽和其它藥物活性成分的降解或變性，從而降低功效和引入額外的雜質。
[0142]本發明的目的是克服或至少緩解現有技術的上述不利方面的一個或多個不利方面。
[0143]疾病-靶向
[0144]在許多牽涉細胞增殖的疾病中，與正常組織相比較，存在增加的對某些維生素的需要。該現象可用於將藥物靶向疾病部位例如腫瘤。例如，葉酸(維生素B9)、核黃素、硫胺素和維生素B12已被報導並且用於將藥物和放射性物質靶向腫瘤以進行治療和診斷(美國專利 5，108，921,5, 416，016,5, 635，382,5, 688，488,7, 128，893,7, 601，332 和 Waibel 等人，Cancer Res.，2008, 68，2904-2911)。在大多數情況下，將藥物共價地連接於靶向系統，從而改變藥物和潛在地改變其藥理學和毒理學特徵譜。簡單方法被需要來將藥物靶向疾病部位而無需藥物化學修飾。
[0145]在許多疾病中，細胞具有增加的對維生素B12的需要，這反映在通過受體介導的胞吞作用促進該維生素的吸收的細胞表面受體的表達的增加。在機制上，維生素B12結合循環蛋白質轉鈷胺素II (TC-1I)，正是B12-TC-1I複合物被細胞表面受體識別。B12-TC-1I複合物結合導致複合物的受體介導的胞吞作用和內化，隨後維生素B12的釋放。對於維生素B12在GI道中的吸收，情況亦如此，當將這些分子化學地連接於維生素B12時，可使用『Trojan Horse』原理，利用維生素B12的細胞吸收過程來將分子運輸進入細胞。例如，R.Waibel 等人，Cancer Res.，2008，68，2904-2911。
[0146]本發明的一個目的是提供有效且同時不需要藥物修飾藥物的載體系統和製劑。
[0147]聚合電解質絡合物
[0148]用於本發明的聚合物，在一個方面，能夠形成聚合電解質絡合物。聚合電解質絡合物(PEC)是涉及兩個或更多個通過多電荷相互作用彼此結合的術語。為了形成納米顆粒PEC，通常化合物的至少一種參與包含多個帶電荷的(或可電離的)基團(全部為正或為負)的寡聚物或聚合物。該聚合物，當與含有一個或多個帶相反電荷的帶電荷的(或可電離的)基團接觸時，形成複合物，其中一種化合物上的帶電荷的基團與另一種化合物的帶電荷的基團形成離子鍵。通常地，兩種化合物都具有帶電荷的或可電離的基團，並且彼此形成多個離子鍵。其它相互作用例如疏水鍵合和H鍵合可用於增強一種化合物對另一種的結合的強度。在納米顆粒的形成中，兩種或更多種帶電荷的或可電離的化合物的許多分子一起形成納米顆粒尺度的三維基質。在裝載了藥物的PEC的情況下，簡單的實例可以是在適當的pH下在總體電荷上具有淨正電荷或淨負電荷的藥物活性肽與具有擁有與肽的電荷相反的電荷的帶電荷的(或可電離的)基質的聚合物。PEC的另一個實例由PEC從兩種聚合物形成產生，一種聚合物具有帶負電荷的基團，一種聚合物具有帶正電荷的基團。將這兩種聚合物與也包含藥物的含水環境接觸可導致PEC的形成，其中藥物在PEC形成過程中被捕獲在納米顆粒基質中。在這兩個一般實例的任一個中，受控藥物釋放可通過納米顆粒在身體中緩慢解離產生。PEC組分可化學經化學修飾以幫助納米顆粒形成；例如，叔胺至季胺的轉化或通過添加疏水基團。
[0149]理想地適合於裝載有藥物的PEC的形成的治療劑高度帶電荷(例如寡核苷酸)或包含多個帶電荷的基團(可與帶電荷的載體聚合物形成離子鍵)。此外，治療劑需要在PEC的形成和儲存的條件下是穩定的。PEC通常在含水環境中製造，並且在納米顆粒基質中包含水分子。這樣的條件對於許多治療劑是不太理想的，因此期望具有除PEC外的更適合於治療劑的穩定性和體內受控釋放(PEC所不適合的)的其它納米載體系統。
[0150]已提交了將VB12PEC描述為藥物遞送媒介物的專利申請(美國系列N0.61/378, 272, Multivitamin Targeting of RNAi Therapeutics),將所述專利申請通過引用整體併入本文。
[0151]納米載體
[0152]本發明的目的是提供新型納米載體系統和簡單的製備方法，通過所述系統和製備方法形成將維生素B12或其衍生物的分子呈現在所述納米顆粒的表面的納米顆粒以及將一種或多種治療活性化合物包含在納米顆粒內。
[0153]本發明的另一個目的是上述納米載體系統提供防止納米顆粒內包含的一種或多種治療活性化合物在身體隔室(body compartment)中降解或變性的一定保護作用，在所述身體隔室中如果不被保護的話，納米顆粒內包含的一種或多種治療活性化合物可能會被降解、變性或代謝。
[0154]本發明的另一個目的是上述納米載體系統具有通過利用維生素B12的身體的天然運輸機制從一個身體隔室運輸 至另一個隔室的潛在益處，包括但不限於從腸腔運輸至GI道的迴腸中的部分血液靜脈，穿過細胞膜以進入細胞區室，以及橫穿主要生物屏障例如血腦屏障。
[0155]本發明的另一個目的是上述納米載體系統可以以受控的方式釋放納米顆粒內包含的一種或多種治療活性化合物，以及化合物釋放可由藥物通過納米顆粒基質的擴散和/或基質降解導致。
[0156]本發明的另一個目的是上述納米載體系統可在體內的位置上釋放一種或多種納米顆粒內包含的治療活性化合物以實現治療上有意義的效應。
[0157]本發明的另一個目的是上述納米載體系統可在體內降解以允許納米顆粒的組分被完全代謝和從身體消除。
[0158]本發明的另一個目的是上述納米載體系統可通過本領域已知的方法來配製，以提供適合於給患者施用的藥物製劑。可適合於本發明的納米顆粒系統的藥物製劑的實例包括但不限於用於口服施用的片劑或膠囊、裝在小瓶中的凍乾粉劑(以隨後利用藥學上可接受的媒介物重建來用於注射進入患者)或用於注射進入患者的在藥學上可接受的媒介物中包含含有藥物的納米載體系統的液體。
[0159]本發明的另一個目的是將上述納米載體系統給患者施用以預防和治療疾病，包括但不限於癌症、自身免疫疾病、內分泌障礙、糖尿病、遺傳病況、染色體病況、病毒感染、細菌感染、寄生蟲感染、線粒體疾病、性傳播疾病、免疫障礙、平衡障礙、疼痛、全身性障礙、血液病況、血管病況、神經病況和肌肉、心臟和其它器官的病況。
[0160]在一個模式中，本發明由通過將一種或多種合成、半合成或天然聚合物與治療劑一起置於適當的溶劑中形成的納米顆粒組成。一種或多種聚合物包含通過適當的接頭共價地連接於聚合物的維生素B12(VB12)或其衍生物。任選地，一種或多種聚合物將包含用於靶向或遞送的其它物理結合的或共價連接的分子。納米顆粒的形成可任選地利用幫助納米顆粒形成或幫助將VB12置於納米顆粒的表面上的其它組分。聚合物和治療活性劑可單獨地或與其它上述組分組合地形成納米顆粒。VB12是在納米顆粒形成之前，通過共價連接於聚合物、連接於治療劑和/或連接於任選的另外組分引入的納米顆粒的必需組分。
[0161]在其它模式中，本發明由通過用聚合物包被治療劑的納米顆粒形成的納米顆粒殼組成。治療劑的納米顆粒可包含治療劑的晶體或非晶體形式或治療劑與一種或多種聚合物的混合物。本發明的納米顆粒通過用一種或多種合成、半合成或天然聚合物在適當的溶劑中包被治療劑的納米顆粒形成。包衣聚合物的一種或多種將包含通過適當的接頭共價結合於聚合物的VB12或其衍生物。任選地，一種或多種包衣聚合物將包含用於靶向或遞送的物理結合的或共價連接的分子。本發明的納米顆粒的形成可任選地利用幫助納米顆粒形成或幫助將VB12置於納米顆粒的表面上的其它組分。
[0162]在其它模式中，本發明由通過脂質封裝治療劑形成的膠束或脂質體組成。膠束或脂質體通過本領域已知的方法從組分形成，其中一些脂質包含通過適當的接頭共價地連接於脂質的VB12。任選地，一種或多種脂質將包含用於靶向或遞送的其它物理結合或共價結合的分子。本發明的膠束或脂質體可任選地利用幫助納米顆粒形成或幫助將VB12置於納米顆粒的表面上的其它組分。
[0163]在其它模式中，本發明由如上所述形成的納米載體、納米顆粒殼、膠束或脂質體組成，其中VB12不是納米載體、納米顆粒殼、膠束或脂質體的組分或組分的部分，其是在其形成後通過納米載體、納米顆粒殼、膠束或脂質體的表面與VB12或VB12衍生物之間的共價鍵形成，或通過納米載體、納米顆粒殼、膠束或脂質體與VB12或VB12衍生物之間的物理鍵(離子、親水和/或疏水)的形成引入至納米載體、納米顆粒殼、膠束或脂質體的表面的。
[0164]如早前所描述的，維生素B12包含單齒配位軸向配體。在本領域已知這些軸向配體可在適當的條件下交換，並且這樣的配體交換被包括為本公開內容的部分。例如，已知亞硝醯鈷胺素作為抗腫瘤劑可以是有效的，因為其用於將一氧化氮遞送至腫瘤(例如；Bauer, Ant1-Cancer Drugs, 1998, 9, 239)並且其可期望地將本發明的納米顆粒中的VB12轉化成亞硝醯基形式以增強治療效應。此外，為了通過任選的接頭將VB12分子連接於聚合物，可通過配體交換過程(如(例如；美國申請20020115595 ；Bagnato等人，J.0rg.Chem.2004, 69，8987)中所描述的)將VB12通過VB12的鈷原子連接於接頭。
[0165]或者，可使用本領域已知的其它方法連接VB12。例如，可選擇性水解VB12的一個或多個伯醯胺基以產生游離羧基或酯，隨後可利用本領域公知的方法，將VB12通過釋放的羧基經由任選地接頭連接於聚合物(例如；Wilbur等人，BioconjugateChem.1996，7，461-474)。通過任選的接頭將VB12連接於聚合物的優選方法包括利用本領域已知的方法(例如；McEwan 等人,Bioconjugate Chem.1999, 10, 1131-1136)與 VB12 的核糖單位的兩個羥基之一形成共價鍵。[0166]可用於形成本發明的納米載體和納米顆粒殼的聚合物的實例包括但不限於聚乳酸(PLA)，聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、聚乙烯醇(PVA)、聚酐、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯酸酯、葡聚糖、殼聚糖、纖維素、澱粉、樹狀聚合物、肽、蛋白質、聚乙二醇和上述聚合物的合成衍生物以及能夠形成聚合電解質絡合物(PEC)的聚合物。為了實現本發明的要求，聚合物可任選地通過一個或多個VB12分子之間的共價鍵(直接地或通過適當的接頭)來修飾。
[0167]可用於形成本發明的膠束和脂質體的脂質的實例包括但不限於在一個末端通過親水基團(可以是帶電荷或中性的)官能化的直鏈或支鏈烷烴或烯烴。為了實現本發明的要求，脂質可任選地利用一個或多個VB12分子的共價連接(直接地或通過適當的接頭)來修飾。適當的脂質包括但不限於單鏈兩親化合物和雙鏈兩親化合物，例如磷脂(例如磷脂醯膽鹼)，其它組分例如膽固醇、脂肪和在本領域已知修飾脂質體和膠束的性質的其它脂溶性分子還可用於形成本發明的納米膠囊。
[0168]在本發明的範圍內的是天然存在的聚合物或可容易獲得的合成聚合物直接用於本發明的納米載體的形成，或此類聚合物可進行合成修飾。修飾可包括但不限於帶電荷或可電離的基團的引入，VB12的連接以及促進納米載體形成和/或所得的納米載體的藥物質量的官能團(例如，疏水或親水的)的引入。
[0169]在本發明的範圍內的是天然存在的脂質或可容易獲得的合成脂質直接用於形成本發明的納米載體，或這樣的脂質可進行合成修飾。修飾可包括但不限於帶電荷或可電離的基團的引入，VB12的連接以及促進納米載體形成和/或所得的納米載體的藥物質量的官能團(例如，疏水或親水的)的引入。
[0170]在一些實施方案中，本發明的納米載體中治療劑對維生素B12的比率在1:20至約20:1的範圍內，或可選擇地在約1:15至約15:1的範圍內，或可選擇地在約1:10至約10:1的範圍內，或可選擇地在約1:5至約5:1的範圍內，或可選擇地在約1:2至約2:1的範圍內，或可選擇地本發明的納米顆粒中的治療劑對維生素B12的比率為約1:1，或可選擇地約2:1,或可選擇地約1:2，或可選擇`地約3:1，或可選擇地約1:3，或可選擇地約4:1，或可選擇地約1:4，或可選擇地約5:1，或可選擇地約1:5，或可選擇地約6:1，或可選擇地約1: 6，或可選擇地約7:1，或可選擇地約1:7，或可選擇地約8:1，或可選擇地約1:8，或可選擇地約9:1，或可選擇地約1:9，或可選擇地約2:3。
[0171]對於本領域普通技術人員明顯的是藥學上適當的納米顆粒還可通過使用超過一種特定類型的聚合物來形成。例如，在形成納米載體中，合成聚合物和半合成聚合物一起使得能夠形成納米載體。
[0172]此外，對於本領域普通技術人員來說明顯的是藥學上適當的納米載體還可通過摻入超過一種治療活性化合物來形成。
[0173]如上文中所指出的，在納米載體的形成中可能期望在納米載體形成之前、期間或之後使用另外的組分以控制納米顆粒的尺寸，控制穩定性和/或藥物釋放特徵譜。可能的另外的組分包括但不限於聚乙二醇(PEG)和PEG嵌段共聚物、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸和其它合成聚合物、澱粉、纖維素和其它多糖、脂肪酸和其它表面活性劑以及金屬離子，特別地二價和三價離子例如鋅、鎂和鈣。另外的組分可能還包括交聯劑例如環氧化合物、二醛澱粉、戊二醛、甲醛、二甲基辛二酸鹽、碳二亞胺、琥珀醯亞胺、二異氰酸鹽、醯疊氮、伊氏素(reuterin)和通過紫外線福射實現的交聯。[0174]如上文中所示，在納米載體的形成中可能特別期望在納米載體形成之前、期間或之後使用另外的組分以改善納米顆粒的靶向或其它生物性質。這些組分可共價地或物理地結合於納米載體的聚合物或其它組分，並且其目的是以足以提供另外的靶向選擇或有利於改善納米載體的藥物代謝動力學或藥效性質的量存在於納米載體以及VB12的表面上。此類另外的組分在本領域是已知的，可包括但不限於除VB12的維生素B、蛋白質和肽例如幹擾素、白蛋白和單克隆抗體或其片段、肽或通過其使得能夠跨膜轉移或幫助跨膜轉移的其它物質、黏膜粘著化合物和化合物例如聚乙二醇(PEG)和PEG嵌段共聚物，其減少網狀內皮系統(RES)對納米顆粒的吸收。
[0175]還如上所示的，除非VB12在納米顆粒形成後結合於納米顆粒，否則用於形成納米顆粒的組分之一必須包含共價地或物理地連接於該組分的VB12。VB12可能直接地或通過適當的接頭連接於組分聚合物、治療活性化合物的一種或多種或另外的組分(如果使用的話)之一。
[0176]在本發明的範圍內的是另外的組分的主要目的是促進VB12在其形成期間至納米顆粒的引入。例如，另外的組分可以是包含連接於5』-O或2』-O位置(或兩者)的脂肪酸的VB12，並且VB12通過脂肪酸部分與參與納米顆粒形成的其它疏水組分的疏水相互作用進行摻入。摻入VB12作為另外的組分之一的其它方法對於本領域普通技術人員來說是很顯然的。作為另一個實例，VB12的另外組分可利用已知強烈地結合納米顆粒形成的其它組分之一的化合物來進行功能化(例如眾所周知鏈黴抗生物素蛋白與生物素強烈地彼此結合；類似地，美國專利5，605，890舉例說明了環糊精-金剛烷「鎖與匙(lock and key)」結合系統)。
[0177]本發明中使用的聚合物可具有在1-10，OOOkDa範圍內的平均分子量。優選平均分子量可通過納米顆粒的形成的具體要求和期望的藥物性質來確定。在一些實施方案中，本發明的聚合物平均分子量在約1-10，OOOkDa的範圍內；或可選擇地在約1-5，OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約1-1，OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約l_500KDa的範圍內；或可選擇地在約1-1OOKDa的範圍內；或可選擇地在約10-10，OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約10-5000KDa的範圍內；或可選擇地在約10_4000KDa的範圍內；或可選擇地在約10-2000KDa的範圍內；或可選擇地在約IO-1OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約10_500KDa的範圍內；或可選擇地在約50-10，OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約50_5，OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約50-1，OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約50_500KDa的範圍內；或可選擇地在約100-10，OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約100-5，OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約100-1，OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約100_500KDa的範圍內；或可選擇地在約500-10，OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約500-1，OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約1000-10，OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約1000-5，OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約2000-10，OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約2，000-5，OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約4，000-10, OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約4000_5000KDa的範圍內；或可選擇地在約5，000-10, OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約6，000-10, OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約7，000-10, OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約8，000-10, OOOKDa的範圍內；或可選擇地在約9，000-10，OOOKDa 的範圍內。[0178]在一個實施方案中，本發明的納米顆粒的功能是促進或增強納米顆粒內包含的治療活性化合物的口服生物利用度。例如，治療活性化合物可因在GI道中的降解或變性或不能穿過腸壁和進入血流(或兩者)而具有較差的天然口服生物利用度。
[0179]在其它實施方案中，本發明的納米顆粒的功能是修飾納米顆粒內包含的治療活性化合物的口服生物利用度。例如，治療活性化合物可具有充足的口服利用度以當口服提供時在治療上是有效的，本發明的納米顆粒改善口服利用度(減少需要施用的藥物的量)和/或以期望的方式改變藥物的藥代動力學類型(pharmacokinetic profile)。
[0180]在其它實施方案中，本發明的納米顆粒的功能是幫助納米顆粒內包含的藥物活性化合物至疾病部位的靶向，尤其在其中對VB12的需要相較於正常情況下對維生素的需要增加的疾病中。已知顯示增加的對VB12的需要的疾病的實施例包括癌症、類風溼關節炎、銀屑病、急性白血病、淋巴瘤、克羅恩病、潰瘍性結腸炎和多發性硬化。用於至疾病部位的靶向遞送的藥物製劑可通過注射施用。
[0181]在其它實施方案中，本發明的納米顆粒的功能是將口服藥物遞送與靶向組合:在如上所述的口服藥物遞送後，隨後納米顆粒隨後被靶向疾病部位，也如上所描述的。
[0182]在其它實施方案中，本發明的納米顆粒的功能是將多核苷酸(例如SiRNA和反義RNA)和其它RNA幹擾治療劑遞送穿過細胞膜，以將活性劑質遞送進入細胞內環境和細胞核(在所述細胞內環境和細胞核中它們是有效的)，和用於基因療法。
[0183]在其它實施方案中，本發明的納米顆粒的功能是將在CNS障礙的治療中有效的治療劑遞送穿過血腦屏障。
[0184]可使用本發明的納米顆粒以有效量遞送穿過生物屏障的治療劑包括但不限於小分子、大分子、合成藥物、半合成藥物、天然存在的化合物、蛋白質、肽、核苷、核苷酸、止痛齊?、抗過敏藥、抗心絞痛藥、抗心律失常藥、抗生素類、抗凝血藥、抗痴呆藥、抗抑鬱藥、抗糖尿病藥、抗組胺藥、抗高血壓藥、 消炎藥、抗腫瘤藥、抗寄生蟲藥、退燒藥、抗逆轉錄病毒藥物、抗消化性潰瘍藥、抗病毒藥、心血管藥物、降膽固醇藥、中樞神經活性藥物、激素、生長激素抑制劑、生長激素類、補血藥、止血藥、降血壓利尿藥、角質離解劑、骨質疏鬆症的治療劑、疫苗、血管收縮劑和血管擴張劑。此類治療劑可使用有效地提供有益治療效應的給藥方案單獨使用，或與其它治療劑組合地使用。
[0185]作為止痛劑的治療劑的實例是嗎啡、氫嗎啡酮、輕嗎啡酮、左啡諾(1vorphanol)、左洛啡烷、可待因、納美芬、烯丙嗎啡、納洛酮(nalozone)、納曲酮、丁丙諾啡、布託啡諾或納布啡(nalbuf ine)。
[0186]作為抗過敏性化合物的治療劑的實例包括氨來咕諾、阿司咪唑、氮卓斯丁(azelastinep)、emirolast、alopatadine、色甘酸鈉(cromolyn)、芬哌丙燒、瑞吡司特、曲尼司特和曲咕諾。
[0187]作為抗心絞痛藥的治療劑的實例包括硝苯地平、阿替洛爾、苄普地爾、卡拉洛爾和依泮洛爾。
[0188]作為抗炎止痛劑的治療劑的實例包括醋氨酚、水楊酸甲酯、水楊酸羥乙酯、阿司匹林、甲芬那酸、氟芬那酸、噴哚美辛、雙氯芬酸、阿氯芬酸、雙氯芬酸鈉、布洛芬、酮洛芬、萘普生、普拉洛芬、非諾洛芬、舒林酸、芬氯酸、環氯茚酸、氟比洛芬、芬替酸、丁苯羥酸、吡羅昔康、保泰松、羥布宗、氯非宗、噴他佐辛、甲嘧啶唑、鹽酸噻拉米特等。[0189]作為甾類消炎藥的治療劑的實例包括氫化可的松、潑尼松龍(predonisolone)、地塞米松、曲安奈德、氟輕鬆、醋酸氫化可的松、醋酸潑尼松龍(predonisolone acetate)、甲潑尼龍(me thy Ipr edon i so I one)、醋酸地塞米松、倍他米松、戍酸倍他米松、氟米松、氟米龍、二丙酸倍氯米松(beclomethasone diproprionate)等。。
[0190]作為抗組胺藥的治療劑的實例包括鹽酸苯海拉明、水楊酸苯海拉明、苯海拉明、撲爾敏(chlorpheniramine hydrochloride)、馬來酸氯苯那敏，鹽酸氮異丙嗪、鹽酸曲批那敏(tripelennamine hydrochloride)、鹽酸異丙嗪、鹽酸甲吡吩嗪(methdilazinehydrochloride)等。
[0191]作為血管收縮藥的治療劑的實例包括萘甲唑啉、鹽酸四氫萘唑啉、鹽酸輕甲唑啉、鹽酸去氧腎上腺素、鹽酸曲馬唑啉等。
[0192]作為止血藥的治療劑的實例包括凝血酶、植物甲萘醌、硫酸魚精蛋白、氨基己酸、氨甲環酸、卡巴克絡、卡絡磺鈉(carbaxochrome sodium sulfanate)、蘆丁、橙皮苷等。
[0193]作為化學治療藥的治療劑的實例包括氨磺醯、磺胺塞唑、磺胺嘧啶、磺胺米隆、磺胺異n惡唑、磺胺索喃唳、磺胺甲噻二唑、呋喃西林(nitro furazone)、紫杉燒類(taxanes)、鉬化合物、拓撲異構酶I抑制劑和蒽環類(anthrocycline)。
[0194]作為抗生素的治療劑的實例包括青黴素、甲氧西林、苯唑西林、頭孢噻吩、頭孢噻啶(cefalordin)、紅黴素、林可黴素、四環素、金黴素、土黴素、美他環素、氯黴素、卡那黴素、鏈黴素、慶大黴素、桿菌肽、環絲氨酸和克林黴素。
[0195]作為角質離解劑的治療劑的實例包括水楊酸、鬼臼樹脂、podolifox和斑蝥素。
[0196]作為生長因子的治療劑的實例包括自分泌運動因子(Autocrine motilityfactor)、骨形態發生蛋白質(BMPs)、表皮生長因子(EGF)、促紅細胞生成素(EPO)、成纖維細胞生長因子(FGF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞一巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、生長分化因子_9(⑶`F9)、肝細胞生長因子(HGF)、肝癌衍生生長因子(HDGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、移動刺激因子(migration-stimulating factor)、肌肉生長抑制素(Myostatin)(⑶F_8)、神經生長因子(NGF)和其它神經營養因子、血小板衍生生長因子(TOGF)、血小板生成素(ΤΡ0)、轉化生長因子α、轉化生長因子β (TGF-β)、血管內皮生長因子(VEGF)、胎盤生長因子(placental growth factor) (PlGF)和胎牛生長激素(FoetalBovine Somatotrophin) (FBS)。
[0197]作為生長激素抑制劑的治療劑的實例是奧曲肽和生長抑素。
[0198]作為激素的治療劑的實例包括脂聯素、促腎上腺皮質激素(或促皮質素)、醛固酮、雄烯二酮、血管緊張素原和血管緊張素、抗利尿激素(或加壓素)、精氨酸升壓素、抗苗勒管激素(Antimullerian hormone)(或副中腎管抑制因子或激素)、心房鈉尿肽(或心房肽)、腦利鈉肽、骨化二醇(25-羥基維生素D3)、降鈣素、骨化三醇、膽囊收縮素、促腎上腺皮質素釋放激素、氫化可的松、脫氫表雄酮、雙氫睪酮、多巴胺(或催乳素抑制激素)、內皮縮血管肽、腦啡肽、腎上腺素(或腎上腺素)、促紅細胞生成素、雌二醇、雌三醇、雌酮、濾泡刺激激素、胃泌素、胃促生長素、高血糖素、促性腺激素釋放激素、生長激素釋放激素、組胺、人絨毛膜促性腺激素、人生長激素、人胎盤泌乳素、抑制素、胰島素、胰島素樣生長因子(或促生長因子)、瘦素、白三烯、促脂解素、促黃體激素、黑素細胞刺激素、褪黑激素、神經肽Y、去甲腎上腺素(或去甲腎上腺素)、阿立新、縮宮素、胰多肽、甲狀旁腺激素、黃體酮、催乳素、催乳素釋放激素、依前列醇、前列腺素、鬆弛素、腎素、胰泌素、5-羥色胺、生長抑素、睪酮、血小板生成素、血栓素、促甲狀腺激素(或促甲狀腺素)、促甲狀腺素釋放激素、甲狀腺素、三碘甲狀腺原氨酸。
[0199]作為止痛劑的治療劑的實例包括芬太尼、丁丙諾啡、硫酸可待因、左啡諾和鹽酸嗎啡。
[0200]作為抗病毒藥的治療劑的實例包括阿巴卡韋、無環鳥苷(Aciclovir)、阿昔洛韋(Acyclovir)、阿德福韋、金剛烷胺、氨普那韋、聚肌胞、阿比朵爾、阿扎那韋、依法韋恩茨(Atripla)、波普瑞韋、西多福韋、雙汰芝、達蘆那韋、地拉韋啶、去羥肌苷、二十二醇、依度尿昔、依非韋倫、恩曲他濱、恩夫韋妝、恩替卡韋、泛昔洛韋、福米韋生、咲山那韋、勝甲酸、勝乙酸、更昔洛韋、伊巴他濱、肌酐普拉諾貝(Imunovir)、碘苷、咪喹莫德、茚地那韋、肌苷、III型幹擾素、II型幹擾素、I型幹擾素、幹擾素、拉米夫定、洛匹那韋、洛韋胺、馬拉韋羅、嗎啉胍、奈非那韋、奈韋拉平、Nexavir、依他米韋、培幹擾素a-2a、噴昔洛韋、培拉米韋、普來可那立、鬼臼毒素、拉替拉韋、逆轉錄酶抑制劑、利巴韋林、金剛乙胺、利託那韋、Pyramidine、沙奎那韋、司他夫定、茶樹油、替諾福韋、延胡索酸泰諾福韋酯(Tenofovir disoproxil)、替拉那韋、曲氟尿苷、三協唯(Trizivir)、曲金剛胺、特魯瓦達(Truvada)、伐昔洛韋、纈更昔洛韋、維立韋羅、阿糖腺苷、Viramidine、扎西他濱、扎那米韋、齊多夫定。
[0201]作為用於治療糖尿病或其副作用的藥物的治療劑的實例包括胰島素(天然的或重組的；單體、六聚體或其混合物)、低精蛋白鋅胰島素(insulin isophane)、賴脯胰島素、甘精胰島素、甲苯磺丁脲、醋酸己脲、妥拉磺脲、氯磺丙脲、格列吡嗪、格列本脲、格列美脲、格列齊特、瑞格列奈、那格列奈、二甲雙胍、苯乙雙胍、丁福明(buformin)、羅格列酮、吡格列酮、曲格列酮、米格列醇、阿卡波糖、胰高血糖素樣肽1、艾塞那肽(Exanatide)、利拉糖肽、他泊魯肽(Taspoglutide)、利司那肽、阿比魯肽、維格列汀、西格列汀、沙格列汀、普蘭林肽、莫格列他、替格列扎、阿格 列扎。
[0202]作為用於治療CNS障礙的藥物的治療劑的實例包括鹽酸美金剛、鹽酸多奈哌齊、酒石酸利伐斯的明、鹽酸加蘭他敏、鹽酸他克林。
[0203]作為用於治療前列腺癌的藥物的治療劑的實例包括度他雄胺、比卡魯胺、環丙沙星、紅黴素、坦索羅辛、氧氟沙星、特拉唑嗪、亮丙瑞林、尼魯米特、非那雄胺、戈舍瑞林。
[0204]作為用於治療卵巢癌的藥物的治療劑的實例包括順鉬、卡鉬、紫杉醇、美法侖、多柔比星、六甲蜜胺、託泊替康(Toptecan)、異環磷醯胺、依託泊苷、5_氟尿喃
[0205]作為用於治療結直腸癌的藥物的治療劑的實例包括氟尿嘧啶、貝伐珠單抗、伊立替康、奧沙利鉬、西妥昔單抗、帕木單抗、甲醯四氫葉酸、卡培他濱。
[0206]作為用於治療肺癌的藥物的治療劑的實例包括卡鉬、順鉬、多西他賽、厄洛替尼、依託泊苷、吉西他濱、吉非替尼.伊立替康、紫杉醇、培美曲塞、託泊替康、長春瑞濱、吉非替尼、伐珠單抗。
[0207]作為用於治療黑色素瘤的藥物的治療劑的實例包括達卡巴嗪、幹擾素a -2b、阿地白介素、acarbazine。
[0208]作為用於治療多發性硬化的藥物的治療劑的實例包括幹擾素β la、醋酸格拉默(Glatiramer Acetate)、米託蒽醌、硫唑嘌呤、環磷醯胺、環孢素、甲氨蝶呤、克拉立濱、甲潑尼龍、潑尼松、潑尼松龍、地塞米松、促皮質素、卡馬西平、加巴噴丁、託吡酯、唑尼沙胺、苯妥英、地昔帕明、阿米替林、丙米嗪。
[0209]作為用於治療阿爾茨海默病的藥物的治療劑的實例包括多奈哌齊、加蘭他敏、卡巴拉汀、美金剛。
[0210]作為用於治療關節炎的藥物的治療劑的實例包括依那西普、英利昔單抗、阿達木單抗、塞來昔布、利妥昔單抗、阿巴西普、依託考昔、戈利木單抗、奧法木單抗、培化舍珠單抗。
[0211]作為用於治療血液缺乏的藥物的治療劑的實例包括培非司亭(pegfiIgrastim)、GCSF、PEG_GCSF、達貝泊汀α、促紅素α、肝素(包括低分子量衍生物)、華法林。
[0212]作為用於治療黏膜炎的藥物的治療劑的實例包括帕利夫明。
[0213]蛋白質治療劑的實例還是單克隆抗體、多克隆抗體、人源化抗體、抗體片段和免疫球蛋白。
[0214]對RNA幹擾有益的治療劑的實例包括但不限於siRNA、dsDNA、miRNA和反義RNA。
[0215]作為抗體或其片段的治療劑的實例包括阿昔單抗、阿達木單抗、阿侖珠單抗、巴利昔單抗、貝伐珠單抗、西妥昔單抗、賽妥珠單抗(Certolizumab)、達克珠單抗、依庫珠單抗、依法珠單抗、吉妥珠單抗、替伊莫單抗(Ibritumomab tiuxetan)、英利昔單抗、莫羅單抗-CD3、那他珠單抗、奧馬珠單抗、帕利珠單抗、帕木單抗、雷珠單抗、利妥昔單抗、託西莫單抗、曲妥珠單抗。
[0216]作為PEG化藥物的治療劑的實例包括培幹擾素a _2a、幹擾素a _2b、培門冬酶和
培非司亭。
[0217]作為小分子的治療劑的實例包括託伐他汀、Clopidrogel、阿立哌唑、埃索美拉唑、奧氮平、喹硫平、瑞舒伐他汀、孟魯司特、文拉法新(Venlafaxine)、依諾肝素(Enoxaparin)和吡格列酮。
[0218]組合物和製劑
[0219]在另一個方面，本技術提供了組合物，所述組合物包含本技術的納米顆粒和載體、稀釋劑或賦形劑，或基本由其組成。在另一個實施方案中，載體、稀釋劑或賦形劑是藥學上可接受的。多種載體、稀釋劑或賦形劑(藥學上可接受的或不可接受的)對於本領域普通技術人員來說是公知的。
[0220]納米顆粒可包含反過來是本技術的化合物或其同分異構體、前體藥物、互變異構體或藥學上可接受的鹽的試劑，所述試劑本身可配製於藥學上可接受的組合物中，或以水合物、溶劑化物、N-氧化物或藥學上可接受的鹽的形式存在，如本文中所描述的。通常，此類鹽在水溶液中比對應的游離酸和鹼更加易溶，但也可形成具有比對應的游離酸和鹼更低的溶解度的鹽。本技術在其範圍內包括化合物的溶劑化物和其鹽，例如水合物。
[0221]在一個實施方案中，本技術提供了包含藥學上可接受的納米顆粒和至少一種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑、防腐劑、穩定劑或其混合物的組合物(製劑)。
[0222]在一個實施方案中，可如用於治療本文中描述的病況的治療法一樣實踐方法。因此，在具體實施方案中，本技術的化合物可用於治療動物受試者包括人的本文中描述的病況。方法通常包括給受試者施用對於治療病況是有效的本技術的納米顆粒或其鹽、前體藥物、水合物或N-氧化物。如本文中所用，本技術的化合物的前體藥物是在體內或體外被轉化成本教導的化合物的化合物。水解、氧化和/或還原是一些將前體藥物轉化成本技術的化合物的方法。
[0223]在一些實施方案中，受試者是非人哺乳動物包括但不限於牛、馬、貓科動物、犬科動物、嚙齒類動物或靈長類動物。在另一個實施方案中，受試者是人。
[0224]本技術的納米顆粒可提供多種製劑和劑量。應當理解本技術的化合物或製劑的論述中的「活性劑」適當時(如對於本領域普通技術人員來說是已知的)，也意欲包括化合物的鹽和前體藥物的製劑。
[0225]包含本文中描述的納米顆粒(或其鹽或前體藥物)的藥學上可接受的組合物可通過常規混合、溶解、粒化、錠劑形成(dragee-making)、磨細(levigating)、乳化、封裝、捕獲或冷凍乾燥法來製造。組合物可使用一種或多種有利於活性化合物加工成可在藥用使用的製劑的生理上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或助劑以常規方式進行配製。
[0226]本技術的納米顆粒可通過口服、胃腸外(例如，肌內、腹膜內、ICV、腦池內注射或輸注、皮下注射或植入)，通過吸入噴霧、經鼻、經陰道、經直腸、舌下、經尿道(例如，尿道栓劑)或局部施用途徑(例如，凝膠，軟膏劑，乳膏，氣霧劑等)施用，可單獨地或以適當的劑量單位製劑一起配製，所述劑量單位製劑包含對於每一條施用途徑是適合的常規無毒藥學上可接受的載體、佐劑、賦形劑和媒介物。
[0227]用於化合物的施用的藥學上可接受的組合物可以以單位劑型方便地提供，並且可利用本領域公知的任何方法來製備。藥學上可接受的組合物可以例如將活性成分與液體載體、精細的固體載體或兩者均勻緻密地結合在一起來製備，隨後，需要時將產物塑形成期望的製劑。在藥物組合物中，以足以產生期望的療效的量包含活性目標化合物。例如，本技術的藥學上可接受的組合物可採用適合於實際上任何施用模式(包括例如局部、經眼、口服、含服、全身性、經鼻、注射、透皮、經直腸和經陰道施用)的形式，或適合於通過吸入或吹入的施用的形式。
[0228]為了進行局部施用，可將化合物、鹽或前體藥物配製為溶液、凝膠、軟膏、乳膏劑、懸浮劑等，這在本領域是已知的。
[0229]全身性藥學上可接受的組合物包括被設計來用於通過注射施用的組合物(例如，皮下、靜脈內、肌內、硬膜內或腹膜內注射)以及被設計來用於透皮、經黏膜、口吸取或經肺施用的組合物。
[0230]有用的可注射的藥學上可接受的組合物包括活性化合物於水性或油性媒介物中無菌懸浮液、溶液或乳液。藥學上可接受的組合物還可包含配製試劑例如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。用於注射的製劑可以以單位劑型(例如於安瓿中或於多劑量容器中)提供，和可包含添加的防腐劑。
[0231]或者，可以以粉劑形式(在使用前用適當的媒介物，包括但不限於無菌無熱原水、緩衝液和葡萄糖溶液重建)提供可注射的藥學上可接受的組合物。為此目的，可通過任何本領域已知的技術例如冷凍乾燥對活性化合物進行乾燥，在使用之前重建。
[0232]為了經黏膜施用，適合於待穿過的屏障的滲透劑(penetrant)用於藥學上可接受的組合物。此類滲透劑在本領域是已知的。
[0233]為了口服施用，藥學上可接受的組合物採用例如利用藥學上可接受的賦形劑通過常規方法製備的錠劑、片劑或膠囊劑，所述賦形劑是例如粘合劑(例如，預膠化玉米澱粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石或矽土)；崩解劑(例如，馬鈴薯澱粉或澱粉羥乙酸鈉)；或溼潤劑(例如，十二烷基硫酸鈉)。片劑可利用例如糖、薄膜或腸溶衣通過本領域公知的方法來包被。此外，以適合於口服使用的形式存在的包含本技術的化合物或其前體藥物的藥學上可接受的組合物還可包括例如糖錠(troche)、錠劑、水性或油性懸浮液、飛散性散劑或粒劑、乳劑、硬或軟膠囊或糖漿劑或酏劑。
[0234]期望用於口服使用的藥學上可接受的組合物可按照本領域已知的用於製造藥學上可接受的組合物的任何方法來製備，此類組合物可包含一種或多種選自甜味劑、調味劑、著色劑和防腐劑的試劑，以提供藥用優美且適口的製劑。片劑包含與適合用於製造片劑的無毒藥學上可接受的賦形劑混合的活性成分(包括藥物和/或前體藥物)。這類賦形劑可以是例如惰性稀釋劑例如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；粒化和崩解劑(例如，玉米澱粉或海藻酸)；粘合劑(例如澱粉、明膠或阿拉伯膠)；和潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石)。片劑可不被包被或它們可通過已知的技術包被以在胃腸道中延遲崩解和吸收，從而在更長時間內提供持續作用。例如，可使用時間延遲材料例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它們還可通過美國專利N0.4，256，108 ;4，166，452和4，265，874中描述的技術來包被，以形成用於控制釋放的滲透性治療片劑。本技術的藥學上可接受的組合物還可以以水包油乳劑的形式存在。[0235]用於口服施用的液體藥學上可接受的組合物(或液體製劑)可採用例如酏劑、溶液、糖漿劑或懸浮劑的形式存在，或它們可作為無水產品(使用前用水或適當的媒介物重建)來提供。此類液體製劑可利用藥學上可接受的添加劑例如懸浮劑(例如，山梨醇糖漿齊?、纖維素衍生物或氫化食用脂)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯膠)；非水媒介物(例如，杏仁油、油酯、乙醇、cremophore?或分級分離的植物油)；和防腐劑(例如，甲基或丙基羥基苯甲酸鹽或山梨酸)通過常規方法來製備。適當時，製劑還可包含緩衝鹽、防腐劑、調味劑、著色劑和甜味劑。
[0236]用於口服施用的製劑可被適當地配製來提供活性化合物的受控釋放或持續釋放，這是公知的。本技術的持續釋放製劑(或持續釋放藥學上可接受的組合物)優選以壓縮片的形式存在，其包含本技術的化合物與部分中和的PH-依賴性粘合劑的均勻混合物，所述粘合劑控制化合物在跨胃中(通常大致約2)和腸中(通常大致約5.5)的pH範圍的含水介質中的溶解速率。
[0237]為了提供本技術的化合物的持續釋放，可選擇一種或多種pH依賴性粘合劑來控制持續釋放藥學上可接受的組合物的溶解特徵譜，以便此類藥學上可接受的組合物隨著藥學上可接受的組合物通過胃和胃腸道而緩慢且連續地釋放化合物。因此，適用於本技術的PH依賴性粘合劑是在其在胃(其中pH低於約4.5)中駐留過程中抑制藥物從片劑快速釋放，和在下胃腸道(其中PH通常大於約4.5)中促進治療劑量的本技術的化合物從劑型釋放的粘合劑。製藥領域內稱為「腸」粘合劑和包衣試劑的許多材料具有期望的PH溶解性質。實例包括苯二甲酸衍生物例如乙烯聚合物和共聚物的苯二甲酸衍生物，羥基烷基纖維素、烷基纖維素、醋酸纖維素、羥基烷基醋酸纖維素、纖維素醚類、烷基醋酸纖維素及其部分酯，和低級烷基丙烯酸與低級烷基丙烯酸鹽的聚合物和共聚物及其部分酯。存在於本技術的持續釋放製劑中的一種或多種pH依賴性粘合劑以在約I至約30wt%、約5至12wt%的範圍內的量和約10wt%的量存在。[0238]一種或多種不依賴於pH的粘合劑可用於口服本技術的持續釋放藥學上可接受的組合物。不依賴於pH的粘合劑可以以在約I至約10wt%、約I至約3wt%的範圍內的量和約2wt%的量存在於本技術的藥學上可接受的組合物中。
[0239]本技術的持續釋放藥學上可接受的組合物還可包含與化合物和pH依賴性粘合劑均勻混合的藥學上可接受的賦形劑。藥學上可接受的賦形劑可包括例如不依賴於pH的粘合劑或膜形成試劑例如羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、中性聚(甲基)丙烯酸甲酯、澱粉、明膠、糖、羧甲基纖維素等。其它有用的藥用賦形劑包括稀釋劑例如乳糖、甘露醇、乾燥澱粉、微晶纖維素等；表面活性劑例如聚氧化乙烯山梨坦酯、山梨坦酯等；和著色劑和調味劑。潤滑劑(例如滑石和硬脂酸鎂)，以及還可任選地存在其它壓片劑。
[0240]本技術的持續釋放藥學上可接受的組合物具有在按重量計約50%至約95%，按重量計約70%至約90%的範圍內的本技術的化合物；5%至40%，5%至25%以及5%至15%的pH依賴性粘合劑含量；劑型的其餘部分包含不依賴於pH的粘合劑、填充劑和其它任選的賦形劑。
[0241]為了頰部施用，藥學上可接受的組合物可以採用以常規方式配製的片劑或錠劑的形式。
[0242]為了通過直腸和陰道途徑施用，可將活性化合物配製為溶液(用於保留灌腸)、栓劑或軟膏劑(包含常規栓劑基質例如可可脂或其它甘油酯)。
[0243]為了口服施用或通過吸入或吹入施用，可通過使用適當的噴射劑(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氟碳化合物、二氧化碳或其它適當的氣體)，將活性化合物或前體藥物以氣霧噴霧劑的形式從加壓包裝(pressurized pack)或噴霧器方便地遞送。在加壓氣霧劑的情況下，劑量單位可通過提供閥門以遞送已計量的量來確定。可配製包含化合物和適當的粉末基質例如乳糖或澱粉的粉末混合的用於吸入器或吹入器的膠囊和藥筒(例如，由明膠組成的膠囊`和藥筒)。
[0244]藥學上可接受的組合物可以以無菌可注射水性或油性懸浮液的形式存在。該懸浮液可使用那些適當的分散劑或溼潤劑和上文中已提及的懸浮劑按照已知的技術來進行配製。無菌可注射製劑也可以是無毒胃腸外可接受稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液。可使用的可接受的媒介物和溶劑當中有水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。化合物還可以以用於藥物的直腸或尿道施用的栓劑形式施用。
[0245]為了局部施用，可使用包含本技術的納米顆粒的乳膏、軟膏劑、凝膠劑、凝膠、溶液、懸浮液等。在一些實施方案中，本技術的化合物可利用聚乙二醇(PEG)配製來用於局部施用。此類製劑可任選地包含另外的藥學上可接受的成分例如稀釋劑、穩定劑和/或佐劑。
[0246]可用於施用本技術的納米顆粒的裝置包括本領域公知的那些裝置，例如定量霧化吸入器、液體噴霧器、乾粉吸入器、噴霧器、熱蒸發器等。用於施用本技術的特定納米顆粒的其它適當的技術包括水電動力氣霧器。如本領域普通技術人員將承認的，納米顆粒的製劑、遞送的製劑的量和單個劑量的施用持續時間取決於使用的吸入裝置的類型以及其它因素。對於一些氣霧劑遞送系統例如噴霧器，施用頻率和系統被活化所需時間長度將主要取決於納米顆粒在氣霧劑中的濃度。例如，可以於噴霧溶液中以更高的納米顆粒濃度使用更短的施用期。裝置例如定量霧化吸入器可產生更高的噴霧劑濃度並且可在一些實施方案中操作更短的時期以遞送期望量的納米顆粒。裝置例如乾粉吸入器遞送活性劑直至給定量的試劑被排出裝置。在該類型的吸入器中，給定量的粉劑中的納米顆粒的量決定單次施用中遞送的劑量。
[0247]用於從乾粉吸入器施用的本技術的納米顆粒的藥學上可接受的組合物通常可包括含有納米顆粒的精細乾粉，但粉劑還可包括填充劑、緩衝劑、載體、賦形劑、另一種添加劑等。可將添加劑包含在這樣的本技術的納米顆粒的乾粉組合物中，例如以按需稀釋粉劑以從特定乾粉吸入器遞送，促進位劑的加工，給製劑提供有利的粉劑性質，促進粉劑從吸入裝置擴散，穩定製劑(例如，抗氧化劑或緩衝劑)，給製劑提供味道等。常見添加劑包括單糖、二糖和多糖；糖醇和其它多元醇例如乳糖、葡萄糖、棉子糖、松三糖、拉克替糖、麥芽糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露醇、澱粉或其組合；表面活性劑，例如山梨醇、二磷脂醯膽鹼或卵磷脂等。
[0248]為了延長遞送，可將本技術的納米顆粒或前體藥物配製為用於通過植入或肌內注射施用的長效製劑(depot preparation)。可用適當的聚合物或疏水材料(例如，如在可接受的油中的乳劑)或離子交換樹脂，或作為略溶的衍生物(例如，作為略溶的鹽)來製備活性成分。或者，可使用製造為粘著盤或貼片的透皮遞送系統，所述系統緩慢地釋放活性納米顆粒以進行透皮吸收。為此目的，可使用滲透促進劑促進活性納米顆粒的透皮滲透。適當的皮膚貼片描述於例如美國專利N0.5，407，713 ;美國專利N0.5，352，456 ;美國專利N0.5，332，213 ;美國專利N0.5，336，168 ;美國專利N0.5，290，561 ;美國專利N0.5，254，346 ；美國專利N0.5，164，189 ;美國專利N0.5，163，899 ;美國專利N0.5，088，977 ;美國專利N0.5，087，240 ;美國專利 N0.5，008，110 ;和美國專利 N0.4，921，475 中。
[0249]或者，可使用其它藥物遞送系統。脂質體和乳劑是可用於遞送活性納米顆粒或前體藥物的遞送媒介物的公知實例。還可使用某些有機溶劑例如二甲基亞碸(DMSO)，例如用於局部施用，儘管通常以更大的毒性為代價。
[0250]必要時，可在一個包裝的分配器裝置中提供藥物組合物，所述裝置可包含一個或多個含有活性納米顆粒的單位劑型。包裝可以例如包含金屬或塑料箔材，例如泡罩包裝(blister pack)。包裝或分配器裝置可附有施用說明書。
[0251]本文中描述的納米顆粒或其組合物通常以有效地獲得期望的結果的量，例如以有效地治療或預防待治療的特定病況的量使用。可治療性施用納米顆粒以實現治療益處或預防地實現預防益處。治療益處意指待治療的基礎障礙的根除或好轉和/或與基礎障礙相關的症狀的一個或多個的根除或好轉，以便患者報告感染或病況的改善，雖然患者可能仍然遭受基礎障礙的痛苦。治療益處還包括停止或減慢疾病的進展，無論改善是否得以實現。
[0252]施用的納米顆粒的量將取決於多個因素，包括例如待治療的具體病況、施用模式、待治療的病況的嚴重度、患者的年齡和體重、具體活性納米顆粒的生物利用度。有效劑量的確定完全在本領域普通技術人員的能力之內。如本領域普通技術人員已知的，本技術的納米顆粒的優選劑量還將取決於待治療的個體的年齡、體重、一般健康和病況的嚴重度。還可能需要針對個體的性別和/或個體的肺容量(當通過吸入施用時)來確定劑量。納米顆粒或其前體藥物的施用劑量和頻率還將取決於納米顆粒是配製用於治療病況的急性發作還是用於障礙的預防性治療。本領域普通技術人員將能夠確定用於特定個體的最佳劑量。
[0253]為了預防性施用，可將納米顆粒給處於發展前述病況之一的風險中的患者施用。或者，可應用預防性施用來避免 經診斷患有基礎障礙的患者的症狀發生。[0254]有效劑量可最初從體外測定來估計。例如，用於動物的初始劑量可被配製來達到為特定納米顆粒IC5tl或高於IC5tl (如在體外測定中測定的)的活性納米顆粒的循環血液或血清濃度。通過考慮特定納米顆粒的生物利用度，計算實現這樣的循環血液或血清濃度完全在本領域普通技術人員的能力之內。關於指導，讀者參考Fingl&Woodbury, 「GeneralPrinciples, 」 GOODMAN AND GILMAN，S THE PHARMACEUTICAL BASIS OF THERAPEUTICS,第I章，pp.1-46，最新版本，Pergamon Press,以及本文中引用的參考資料。
[0255]還可從體內數據例如動物模型來估計初始劑量。用於測試納米顆粒治療或預防上述各種疾病的功效的某些動物模型在本領域是公知的。本領域普通技術人員可常規地利用這樣的信息來確定適合於人施用的劑量。
[0256]劑量的量通常在約0.0001或約0.001或約0.01mg/kg/天至約100mg/kg/天的範圍內，但可以更高或更低，這取決於，納米顆粒的活性、其生物利用度、施用模式和上述各種因素，和其它因素。可按個體調整劑量的量和間隔以在納米顆粒的目標器官系統中提供足以維持治療或預防效應的水平。例如，納米顆粒可每周施用一次，每周施用數次(例如，每隔一天)，每天一次，或每天多次，這取決於，施用模式、待治療的具體適應症和開處方醫生的判斷，和其它事物。在局部施用或選擇性吸收例如局部外用給藥(local topicaladministration)的情況下,活性納米顆粒的有效局部濃度可能與血楽;濃度無關。本領域普通技術人員能夠最優化有效局部劑量而無需過度實驗。
[0257]用於本技術的治療方法的納米顆粒將提供治療或預防益處而不引起顯著的毒性。納米顆粒的毒性可使用標準製藥規程來測定。毒性效應與治療(或預防)效應之間的劑量比率是治療指數。在某些實施方案中，納米顆粒顯示與治療的疾病相關的高治療指數。
[0258]關於對本技術的納米顆粒的劑量需要的上述公開內容與對於前體藥物所需的劑量相關，關於其實現，對於本領域普通技術人員來說顯然的是施用的前體藥物的量也取決於多個因素，包括，例如，具體前體藥物的生物利用度和在選擇的施用途徑下至活性藥物納米顆粒的轉化率和效率。用於具 體用途的前體藥物的有效劑量和施用模式的確定完全在本領域普通技術人員的能力之內。
[0259]試劑盒
[0260]還提供了用於施用本技術的納米顆粒或包含納米顆粒的藥物製劑的試劑盒，所述試劑盒可包括一個劑量的量的至少一種納米顆粒或包含至少一種納米顆粒的組合物，如本文中公開的。試劑盒還可包括用於使用納米顆粒的適當包裝和/或說明書。試劑盒還可包括用於遞送至少一種納米顆粒或包含至少一種本技術的納米顆粒的組合物的工具，例如吸入器、噴霧分配器(例如，鼻腔噴霧)、用於注射的注射器或用於膠囊、片劑、栓劑的壓力包裝或本文中描述的其它裝置。
[0261 ] 其它類型的試劑盒提供了納米顆粒和試劑以製備用於施用的本技術的組合物。組合物可以以無水或凍幹形式存在，或存在於溶液特別地無菌溶液中。當組合物以無水形式存在時，試劑可包含藥學上可接受的稀釋劑以製備液體製劑。試劑盒可包括用於施用或用於分配組合物的裝置，包括但不限於注射器、移液器、透皮膚貼劑或吸入劑。
[0262]試劑盒可包括與本文中描述的本技術的納米顆粒結合使用的其它治療性納米顆粒或治療試劑。這類納米顆粒可以以分開的形式提供或與本技術的納米顆粒混合。試劑盒包括關於組合物的製備和施用、組合物的副作用和任何其它相關信息的適當說明書。說明書可以以任何適當形式(包括但不限於印刷器、錄像帶、計算機可讀磁碟或光碟)存在。
[0263]在一個實施方案中，本技術提供了包括本文中描述的納米顆粒、膠束或脂質體、包裝和使用說明書的試劑盒。
[0264]在另一個實施方案中，本技術提供了試劑盒，其包括藥學上可接受的組合物(包含本文中描述的納米顆粒、膠束或脂質體和至少一種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑、防腐劑、穩定劑或其混合物)、包裝和使用說明書。在另一個實施方案中，提供了用於治療患有本文中描述的病況或對所述病況易感的個體的試劑盒，其包括裝有一個劑量的量(a dosageamount of)的本技術的納米顆粒、膠束、脂質體或組合物(如本文中公開的)的容器和使用說明書。容器可以是本領域已知的並且適合於貯存和遞送口服、靜脈內、局部、直腸、尿道或吸入製劑的那些容器的任何容器。
[0265]還提供了試劑盒，所述試劑盒包含充足劑量的納米顆粒或組合物以為個體提供有效治療，持續延長的時期，例如I周、2周、3周、4周、6周或8周或更長時間。
[0266]舉例說明已在概述和詳述中描述的技術，所述技術不限於下面的實施例。
[0267]實驗實施例
[0268]實施例1 -葡聚糖琥珀酸酯(DS)的合成
[0269]將70kDa葡聚糖(IOg)於無水二甲基亞碸(IOOmL)和吡唳(15mL)中攪拌。添加琥珀酐(1.54g)，將在I小時後變成均勻溶液的混合物在氬氣氛下於室溫攪拌16小時。將溶液傾倒進攪拌的乙酸乙酸(400mL)，隨後添加丙酮(400mL)，持續攪拌16小時，在該過程中，糊狀沉澱物最終變成顆粒狀。過濾沉澱，用乙酸乙酯洗滌，隨後在真空下乾燥以提供白色固體，將該固體溶解於水(250mL)中。將`水溶液用稀HCl酸化至pH2，使用0.1m2的具有5kDaMWCO膜的TFF (切向流過濾)模塊用水滲濾5次。隨後利用TFF將溶液濃縮至~50mL，凍幹以提供作為白色固體的右旋糖酐20%琥珀酸鹽(10.2g)。1H NMR分析確認產物包含0.2當量的琥珀酸鹽/脫水葡萄糖單位(20%琥珀醯化)。
[0270]實施例2_70kDa VB12-葡聚糖琥珀酸酯綴合物的合成
[0271]將實施例1的70kDa葡聚糖琥拍酸鹽(200mg)和氨基己基VB12 (20mg ；JF McEwan等人，Biocon jugate Chem.1999, 10, 1131-1136)溶解於水(8mL)中。添加 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺氫氯化物(200mg)和N羥基琥珀醯亞胺(200mg)，將溶液(pH5.5)攪拌16小時。將混合物在5kDa Ami con 15離心過濾機中以3800rpm離心45分鐘。將水(15mL)添加至滲餘物中，離心；隨後再次重複15mL洗滌。將洗滌的滲餘物凍幹以提供淡紅色固體的Cob-DS (223mg)。UV-VIS分光光度分析顯示產品包含3.25%w/w的VB12，其對應於~0.5當量的AH-VB12每100個脫水葡萄糖單位(0.5mol%VB12)。
[0272]實施例3_70kDa羧甲基葡聚糖的合成
[0273]將11%氫氧化鈉(20mL)中的70kDa葡聚糖(4.0g)的溶液添加至氯醋酸(2.3g)的叔丁醇(40mL)中的溶液，在60°C劇烈地攪拌雙相混合物3小時。在冷卻至室溫後，將混合物傾倒進攪拌的丙酮(400mL)中，通過傾析分離所得的糊狀沉澱。將糊溶解在水(25mL)中，隨後傾倒進攪拌的甲醇(300mL)中，過濾所得的白色沉澱，用甲醇洗滌，在真空下乾燥。將粗製產物溶解在水中，使用0.1m2的具有5kDa MWCO膜的TFF (切向流過濾)模塊用水滲濾5次。隨後用TFF濃縮溶液，冷凍乾燥以提供白色固體(4.6g)。IH NMR分析顯示產物包含0.2羧基-甲基當量/脫水葡萄糖單位(20%羧甲基化)。[0274]實施例4_2000kDa羧甲基葡聚糖的合成
[0275]向2000kDa葡聚糖(2.0g ;以與實施例1中描述的方式相似的方式製備的)和氫氧化鈉(1.7g)的水溶液(20mL)中添加氯醋酸(2.3g)的叔丁醇(40mL)溶液，在60°C劇烈地攪拌雙相混合物6小時。在冷卻至室溫後，利用HCl將混合物調整至pH5，隨後傾倒進攪拌的甲醇(200mL)中，通過離心分離所得的白色沉澱。通過離心用甲醇(2x200mL)洗滌沉澱2次，在真空下乾燥過夜以提供白色固體(2.5g)。IH NMR分析顯示產物包含0.26羧甲基當量/脫水葡萄糖單位(26%羧甲基化)。
[0276]實施例5_70kDa VB12-氨基乙基氨_羧甲基葡聚糖綴合物的合成
[0277]20%羧甲基70kDa葡聚糖(200mg)和氨基己基-VB12 (75mg)溶解於水(IOmL)中。添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺氫氯化物(EDAC ；60mg)和N羥基琥珀醯亞胺(NHS ;15mg)，將溶液在ρΗ5.3-5.7攪拌4小時。添加二鹽酸乙二胺(164mg)和另外部分的EDAC(176mg)，將pH調整至ρΗ5.6，攪拌反應過夜。將混合物在5kDa Ami con 15離心過濾器中以3800rpm離心混合物30分鐘。將水(15mL)添加至滲餘物，離心，隨後再重複15mL水洗滌2次。將滲餘物冷凍乾燥以提供作為淡紅色固體的Cob-EDCMD70 (170mg)。UV-VIS分光光度計測量分析顯示產物包含6.5%w/w的VB12，這對應於0.9當量的VB12/100脫水葡萄糖單位(0.9mol%VB12)。
[0278]實施例6_2000kDa VB12-羧甲基葡聚糖綴合物的合成
[0279]將26%羧甲基2000kDa葡聚糖(200mg)和氨基己基-VB12 (IOOmg)溶解於水(IOmL)中。添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺氫氯化物(EDAC ；30mg)和N羥基琥珀醯亞胺(NHS ；15mg)，將溶液 在pH4.9-5.6攪拌50小時。將混合物在5kDa Ami con 15離心過濾器中以3800rpm離心30分鐘。將水(15mL)添加至滲餘物，離心，隨後再重複15mL水洗滌6次。將滲餘物冷凍乾燥以提供作為淡紅色固體的Cob-CMD2K(198mg)。UV-VIS分光光度計測量分析顯示產物包含17.5%w/w的VB12，這對應於~2.7當量的VB12/100脫水葡萄糖單位(2.7mol%VB12)。
[0280]實施例7_2000kDa VB12-氨基六甲基氨基_羧甲基葡聚糖綴合物的合成
[0281]將26%羧甲基2000kDa葡聚糖(200mg)和氨基己基-VB12 (50mg)溶解於水(IOmL)中。添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺氫氯化物(EDAC ；30mg)和N羥基琥珀醯亞胺(NHS ;15mg)，將溶液在ρΗ5.0-5.7攪拌5小時。添加己二胺二鹽酸鹽(210mg)和另外部分的EDAC(173mg)，將pH調整至pH5.2，將反應攪拌過夜。將混合物在5kDa Ami con 15離心過濾器中以3800rpm離心30分鐘。將水(15mL)添加至滲餘物並離心，隨後重複15mL水洗滌直至濾液無色。冷凍乾燥滲餘物以提供作為淡紅色固體的Cob-AHCMD2K(156mg)。UV-VIS分光光度分析顯示產物包含2.3%w/w的VB12，其對應於~0.3當量的VB12/100脫水葡萄糖單位(0.3mol%VB12)。
[0282]實施例8-VB12_Abraxane綴合物的合成
[0283]用水(50mL)振蕩Abraxane (900mg),將乳白色懸浮液的pH調整至pH6.0。添加氨基己基-VB12 (200mg)和N羥基琥珀醯亞胺(NHS ；43mg)，將pH調整至ρΗ5.3。添加1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺氫氯化物(EDAC ;71mg)，將懸浮液於pH5.3-5.6攪拌 15 小時。使用 Millipore Pellicon XL5kDa Biomax50cm2 過濾盒(filter cassette)用水滲濾混合物10次，隨後濃縮至~15mL。將滲餘物冷凍乾燥以提供作為淡紅色固體的Cob-Abraxane (883mg)。利用ICP的鈷分析顯示產物包含678ppm的鈷，這對應於1.56%w/w的 VB12。
[0284]實施例9-胰島素納米顆粒的製備[0285]將實施例5的VB12衍生物(47.5mg)添加至牛胰島素的稀鹽酸溶液(5.0mg/mL ；
0.5mL)，在室溫下輕輕攪拌I小時，隨後冷凍乾燥以提供作為淡紅色固體的胰島素納米顆粒。於水中重建納米顆粒(14.4mg/mL)提供了 20IU/mL的胰島素劑量。
[0286]實施例10 -利用胰島素納米顆粒進行的糖尿病大鼠的血糖降低
[0287]以12h的光/暗周期在室溫籠養雌性Wistar大鼠(200g)。除另外指明外，所有動物可隨意獲得標準飼料和水。使大鼠在新環境中適應7天的時間，隨後開始實驗。在隨機分組(每組4隻動物)後，標記每一隻大鼠，單個地經歷整個研究。將所有大鼠禁食I小時。以55-65mg/kg (於0.1M檸檬酸鹽緩衝液(pH4.5)中)的劑量通過IV注射施用獲自Sigma的鏈脲黴素(98%hplc)，隨後再禁食I小時。每天從尾部採集血液,使用Accu-Chek?(Compact Plus-Roche)血糖監測儀測量血糖水平。當組中的所有動物已達到大於250mg/dl(5天)的血糖水平時，開始胰島素代謝期。將所有動物禁食I小時，測量血糖(T=O)。通過口服管飼法用0.5mL的實施例9的胰島素納米顆粒的含水製劑(包含20IU/mL的胰島素)，或0.5mL的牛胰島素水溶液(20IU/mL)給成組的小鼠給藥。隨後使動物再禁食I小時，在給藥後1、4、8和24小時測量血糖水平。胰島素納米顆粒製劑的施用導致在第8小時28%的血糖水平的降低(相較於T=O)，在第24小時12%的血糖水平降低，然而普通胰島素製劑(plain insulin formulation)導致第8小時1%和第24小時21%的血糖水平的升高。結果顯示，與未配製的胰島素的口服施用相比，胰島素納米顆粒導致血糖的顯著降低。
[0288]實施例11 - Abraxane或Cobrazane綴合物對腫瘤生長的抑制
[0289]用人白血病K562細胞植入無胸腺裸鼠，使異種移植物生長直至尺寸為150-200mm3ο將動物隨機分組(每組7隻)，用鹽水對照、Abraxane (200mg/kg紫杉醇)或Cobraxane (100或200mg/kg紫杉醇)通過腹膜內注射給藥，每周測量腫瘤尺寸約3次。圖3中的曲線顯示所有3個活性組的腫瘤生長的抑制(相對於鹽水對照)。50%的紫杉醇劑量的Cobraxane優於Abraxane,等劑量的Cobraxane實際減小腫瘤尺寸。
[0290]實施例12 - VB12-三甲基殼聚糖(VB12-TMC)的合成
[0291]將殼聚糖(Aldrich Low MW;10g)懸浮於水(180mL)中，添加甲醛(40mL)和甲酸(30mL) ο在70°C加熱混合物24小時，產生大量氣體(CO2)。添加另外部分的甲醛(40mL)和甲酸(30mL)，將混合物在70°C再加熱另外24小時，此時氣體產生已完全停止。添加水(200mL)，將溶液通過硅藻土過濾，隨後經歷利用5kDa MWCO膜的切向流過濾，利用TFF濃縮，冷凍乾燥以提供作為白色固體的N，N-二甲基殼聚糖(9.lg)。1H NMR分析顯示殼聚糖的所有非乙醯化胺基已轉化成二甲基胺基。將N，N-二甲基殼聚糖^.2g)懸浮於N-甲基吡咯烷酮(200mL)，將混合物在70°C加熱I小時，隨後冷卻。添加碘代甲烷(IOmL)，將混合物在40°C加熱4小時，添加更多的碘代甲烷(IOmL)，將混合物在40°C維持24小時。添加更多碘代甲烷(5mL)，將混合物在40°C再維持另外24小時。將反應物緩慢地添加至乙酸乙酯^OOmL),過濾所得的固體，用乙酸乙酯洗滌，乾燥以提供作為褐色固體的TMC碘化物(8.5g)。將氫化鈉60%懸浮液(318mg)添加至無水DMSO (75mL)，將混合物於70°C加熱I小時。冷卻後，添加粗製三甲基殼聚糖碘化物(2g)，將混合物在室溫下攪拌3小時。添加氯醋酸(250mg)，將反應物攪拌50小時，隨後傾倒進攪拌的丙酮(400mL)。通過離心分離所得的沉澱，用丙酮洗滌，乾燥以提供白色固體(~2g)。將固體溶解於0.1M HCl (IOOmL)中的IMNaCl中，過濾，經歷利用5kDa MWCO膜的切向流過濾，通過TFF濃縮，冷凍乾燥以提供作為白色固體的O-羧甲基N，N，N-三甲基殼聚糖(CMTMC) (1.17g)。13C NMR分析確認了羧甲基基團的存在。將O-羧甲基N，N，N-三甲基殼聚糖(500mg)溶解於水(40mL)中，將溶液調整至pH5.3。添加氨基己基_VB12(40mg)、EDAC (19mg)和NHS (12mg)，將溶液攪拌2.5小時。添加更多EDAC(20mg)，將混合物攪拌16小時。將溶液經歷利用5kDa MWCO膜的切向流過濾，通過TFF濃縮，冷凍乾燥以提供VB12-羧甲基-三甲基殼聚糖；VB12-TMC(413mg)為淡紅色固體。[0292]實施例13 - VB12-PLGA的合成
[0293]向聚乳酸-羥基乙酸共聚物的懸浮液(PLGA RG502H ;IOOmg)和二氯甲烷(IOmL)中的NHS(60mg)添加EDAC(IOOmg)，將混合物在室溫攪拌18小時。蒸發溶液至~3mL，隨後添加至二乙醚(10mL)。用醚洗滌所得固體，真空乾燥以提供作為白色固體的PLGA NHS醚(209mg)。向DMF (2mL)中的氨基己基-VB12 (40mg)溶液添加三乙胺(6滴)，隨後添加DMF (5mL)中的PLGA NHS醚(209mg)溶液。將溶液攪拌16小時，隨後添加至冷的醚(40mL)中，將所得沉澱離心，用醚(2x20mL)洗滌，在高真空下乾燥以提供作為紅色固體的PLGA-氨基己基-VB12(VB12-PLGA) (112mg)。利用ICP的鈷分析顯示產物包含6352ppm的鈷，這對應於 14.6%w/w 的 VB12。
[0294]實施例14 -含胰島素的VB12-PLGA納米顆粒的合成
[0295]將人重組胰島素(2.0mg)、RG502H PLGA (37.5mg)和 VB12-PLGA (1.5mg)裝入 7mL小瓶。隨後添加2.3mL丙酮和0.4mL10mM HCl的混合溶劑系統並且快速振蕩20分鐘。將該溶液添加至攪拌的30mL體積的10mg/mL PVA溶液(Mowiol4_88),從而形成淡粉紅色懸浮液，攪拌lh。隨後以10，500rpm將混合物離心30分鐘，輕輕倒出上清液，用去離子水(2xl5mL)洗滌粉色沉澱，冷凍乾燥以產生30.9mg的粉紅色納米顆粒'1-平均值=273nm，PDI=0.266 ；ζ 電位=-28.1mV。
[0296]實施例15 -含胰島素的VB12-PLGA-HP55納米顆粒的合成
[0297]將500 μ L的3mg/mL的丙酮中的VB12-PLGA溶液添加至1.2mL的也在丙酮中的25mg/mL RG502H PLGA溶液。將該混合物振蕩5分鐘，添加1.2mL的丙酮中的12.5mg/mL羥丙甲纖維素鄰苯二甲酸鹽(HP-55)溶液，振蕩另外5分鐘。隨後添加400 μ L的IOmM HCL中的5mg/mL重組人胰島素溶液以形成澄清的粉紅色溶液，將其振蕩10分鐘。將該混合物添加至快速攪拌的30mL體積的10mg/mL PVA溶液(Mowiol4-88)，以產生混濁的粉紅色懸浮液，隨後將其攪拌I小時。將其以10，500rpm離心20分鐘，輕輕倒出上清液，用去離子水(2xl5mL)洗滌粉紅色沉澱，冷凍乾燥以產生29.6mg粉紅色納米顆粒；Z-平均值=294nm，PDI=0.114 ；ζ 電位=-55.0mV。
[0298]實施例16 -含胰島素的VB12-PLGA-HP55納米顆粒的合成
[0299]用人重組胰島素(2.0mg)、RG502H PLGA (37.5mg)、VB12-PLGA (1.5mg)和HP-55 (7.5mg)裝入7mL小瓶。隨後添加2.6mL丙酮和0.4mL10mM HCl的混合溶劑系統並且快速振蕩20分鐘以產生澄清的粉紅色溶液。將該溶液添加至攪拌的30mL體積的10mg/mLPVA溶液(MoWiol4-88)，從而形成淡粉紅色懸浮液，攪拌lh。隨後以10，500rpm將混合物離心30分鐘，輕輕倒出上清液，用去離子水(2xl5mL)洗滌粉色沉澱，冷凍乾燥以產生32.1mg的粉紅色納米顆粒；Z-平均值=245nm，PDI=0.076 ； ζ電位=-52.9mV。
[0300]實施例17 -含siRNA的VB12-TMC-PLGA納米顆粒的合成
[0301]將100 μ L 的 10mg/mL siRNA 溶液添加至 200 μ L 的 10mg/mL VB12-TMC 溶液，振蕩5分鐘以產生混池懸浮液。將其添加至750 μ L的二氯甲燒中的40mg/mL ResomerRG502H PLGA溶液，將混合物超聲處理I分鐘。向該粉紅色乳液添加2mL的20mg/mL PVA (~10，OOOMW, 80%水解的)溶液，再超聲處理I分鐘。隨後將混合物添加至12mL的20mg/mLPVA溶液，快速攪拌(不加蓋)90分鐘。隨後將其以10，500rpm在4°C離心20分鐘，輕輕倒出上清液。用去離子水(2x5mL)洗滌溶液，隨後冷凍以產生21.1mg粉紅色納米顆粒；Z-平均值=270nm, PDI=0.268 ； ζ 電位=-38.4mV。
[0302]實施例18 - VB12-油醯胺的合成[0303]向二氯甲烷(40mL)的油酸(1.0g)和NHS(447mg)的懸浮液中添加EDAC(743mg)，將混合物在室溫下攪拌20小時。用冰冷的水(3x40mL)洗滌溶液，在Na2S04上乾燥，在真空下蒸發以提供作為白色固體的油酸NHS酯(1.13g)。向DMF(ImL)中的氨基己基-VB12 (IOOmg)溶液添加三乙胺(3滴)，隨後添加DMF(ImL)中的油酸NHS酯(35.3mg)溶液。將溶液攪拌4小時，隨後添加至乙酸乙酯(40mL)，將所得沉澱離心，用乙酸乙酯(2x20mL)洗滌，在真空下乾燥以提供作為紅色固體的油醯胺己基-VB12(VB12-油醯胺)(108mg)。
[0304]實施例19 - VB12-硬脂醯胺的合成
[0305]向二氯甲烷(50mL)中的硬脂酯(1.0g)和NHS (445mg)的懸浮液中添加EDAC (740mg)，將混合物在室溫攪拌24小時。用冰冷的水(3x50mL)洗滌溶液，在Na2S04上乾燥，在真空下蒸發以提供作為白色固體的硬脂酸NHS酯(1.2g)。向DMF(5mL)中的氨基己基-VB12 (IOOmg)溶液添加三乙胺(5滴)，隨後添加DMF (2mL)中的硬脂酸NHS酯(35.5mg)。將溶液攪拌5小時，隨後添加至乙酸乙酯(50mL)，將所得沉澱離心，用乙酸乙酯(2x25mL)洗滌，在高真空下乾燥以提供作為紅色固體的硬脂酸醯氨基己基-VB12(VB12-硬脂醯胺)(102mg)。
[0306]實施例20 -胰島素VB12-包被的PLGA納米顆粒的合成
[0307]將重組人胰島素(10.0mg)、PLGA (RG502H, 150mg)和丙酮(12.0mL)與 IOmMHCKl.85mL)的溶劑系統裝入20mL小瓶。將其在定軌振蕩器上混合40分鐘。將所得溶液迅速添加至快速攪拌的8.3mg/mL PVA溶液(Mowiol4-88，180mL)中，溶液立即變混濁。將白色懸浮液攪拌lh，隨後在4°C以10，500rpm離心20分鐘，輕輕倒出上清液。用去離子水(2x40mL)洗漆沉澱,隨後重懸浮於30mL去離子水中。向該攪拌的懸浮液中添加lmg/mLVB12-油醯胺溶液(250 μ L於EtOH中)，將混合物攪拌22h，隨後在4°C以10，500rpm離心20分鐘。輕輕倒出上清液，將沉澱冷凍乾燥以產生92.6mg的粉紅色納米顆粒；Z_平均值=219nm, PDI=0.058 ； ζ 電位=-34.2mV。
[0308]實施例21 -含胰島素的VB12-包被的PLGA-HP55納米顆粒的合成
[0309]將重組人胰島素(10.0mg)、PLGA (RG502H, 150mg)、HP-55 (75mg)和丙酮(12.0mL)與IOmM HCKl.85mL)的溶劑系統裝入20mL小瓶。將其在定軌振蕩器上混合40分鐘。將所得溶液迅速添加至快速攪拌的8.3mg/mL PVA溶液(Mowiol4-88，180mL)中，溶液立即變混濁。將白色懸浮液在4°C以10，500rpm離心20分鐘，輕輕倒出上清液。用去離子水(2x40mL)洗滌沉澱，隨後重懸浮於30mL去離子水中。向該攪拌的懸浮液中添加lmg/mL VB12-油醯胺溶液(250 μ L於EtOH中)，將混合物攪拌22h，隨後在4°C以10，500rpm離心20分鐘。輕輕倒出上清液，將沉澱冷凍乾燥以產生151mg的粉紅色納米顆粒；Z-平均值=292nm，PDI=0.063 ；ζ 電位=-55.8mV。
[0310]實施例22 -含胰島素的VB12-包被的PLGA-HP55納米顆粒的合成
[0311]將重組人胰島素(2.0mg)、RG502H PLGA (30.0mg)和 HP_55(15mg)裝入 7mL 小瓶。隨後添加2.4mL丙酮與0.4mL10mM HCl的混合溶劑系統，快速振蕩20分鐘以產生澄清溶液。將500 μ L的EtOH中的5.0mg/mL VB12-油醯胺溶液添加至30mL的10mg/mL PVA溶液(Mowiol4-88)中，將胰島素/PLGA/HP-55溶液在快速攪拌的條件下，在3分鐘的過程中逐滴添加至該溶液中，從而形成混濁的粉紅色懸浮液。將該懸浮液攪拌I小時，隨後在4°C以10500rpm離心20分鐘，輕輕倒出上清液。用去離子水(2xl5mL)洗滌沉澱，冷凍乾燥以產生31.2mg的粉紅色納米顆粒；Z-平均值=280nm, PDI=0.138 ； ζ電位=-44.9mV。
[0312]實施例23 -含siRNA的VB12/Pluronic_包被的PLGA納米顆粒的合成
[0313]將ΙΟΟμ L 的 ρΗ7.5ΤΕ (Tris-EDTA)緩衝液中的 10mg/mL siRNA 溶液與 200 μ L 的也在ρΗ7.5ΤΕ緩衝液中的20mg/mL乙醯化牛血清白蛋白溶液短暫組合。隨後添加750 μ L的二氯甲烷中的RG502H PLGA,將混合物超聲處理I分鐘。向所得白色乳劑中添加2mL的20mg/mLPVA溶液(10k MW, 80%水解的)，再進行超聲處理I分鐘。隨後將乳液添加至12mL的20mg/mL PVA溶液，將混合物在未蓋蓋的20mL小瓶中攪拌1.5h。隨後在4°C將其以10，500rpm離心20分鐘，輕輕倒出上清液。用去離子水(2x5mL)洗滌沉澱，隨後重懸浮於3mL去離子水中。向該懸浮液中添加100 μ L的EtOH中的lmg/mL VB12-硬脂醯胺溶液，將混合物振蕩5h。隨後添加300 μ L的10mg/mL Pluronic F68，振蕩16小時。再次將混合物在4°C以10，500rpm離心20分鐘，輕輕倒出上清液，用3mL去離子水洗滌沉澱，最後冷凍乾燥以產生
14.3mg的粉紅色納米顆粒；Z-平 均值=198nm, PDI=0.059 ； ζ電位=-39.2mV。
[0314]實施例24 -含siRNA的VB12-包被的PLGA-TMC納米顆粒的合成
[0315]將100 μ L的DMSO中的10mg/mL TMC六氟磷酸鹽溶液和750 μ L的二氯甲烷中的40mg/mL RG502H PLGA溶液短暫組合，添加 300 μ L 的 ρΗ7.5TE 緩衝液中的 3.33mg/mL siRNA溶液。將混合物超聲處理I分鐘，隨後將2mL的20mg/mL PVA溶液(IOk欄』 80%水解的)添加至乳液中，再進行超聲處理I分鐘。隨後將該乳液添加至12mL的20mg/mL PVA溶液，將混合物在未蓋蓋的20mL小瓶中混合1.5h。隨後將其在4°C以10，500rpm離心20分鐘，輕輕倒出上清液。用去離子水(2x5mL)洗滌沉澱，隨後冷凍乾燥以產生17.3mg的白色納米顆粒；Z-平均值=206nm, PDI=0.036 ； ζ電位=-34.1mV。用8.2mg乾燥納米顆粒裝入7mL小瓶，添加2mL去離子水，振蕩10分鐘。向所得的白色沉澱中添加100 μ L的EtOH中的Img/mL VB12-油醯胺溶液，將混合物振蕩3h，隨後以13，OOOrpm離心30分鐘。輕輕倒出上清液，冷凍乾燥沉澱以產生9.0mg的粉紅色納米顆粒；Z-平均值=193nm，PDI=0.057 ； ζ電位=-35.6mV0
[0316]實施例25 - VB12-TMC siRNA聚合電解質絡合物納米顆粒的合成
[0317]將1.0mL的1.5%右旋糖/pH4100mM醋酸鹽緩衝液中的1.0mg/mL siRNA溶液添加至1.0mL的1.5%右旋糖/pH4100mM醋酸鹽緩衝液中的1.5mg/mL VB12-TMC溶液，攪拌10分鐘以形成澄清粉紅色溶液；Z-平均值=126nm，PDI=0.181 ； ζ電位=22.8mV。
[0318]實施例26 -含亮丙瑞林的VB12-包被的PLGA納米顆粒的合成
[0319]將10(^1^的？!17.5TE緩衝液中的10mg/mL亮丙瑞林溶液與200 μ L的也在ρΗ7.5ΤΕ緩衝液中的20mg/mL乙醯化牛血清白蛋白溶液組合，振蕩3分鐘。隨後添加750 μ L的二氯甲烷中的RG502H PLGA，將混合物超聲處理I分鐘。向所得白色乳液中添加2mL的20mg/mLPVA溶液(10k MW, 80%水解的)，再進行超聲處理I分鐘。隨後將乳液添加至12mL的20mg/mL PVA溶液，將混合物於未蓋蓋的20mL小瓶中攪拌1.5h。隨後將其在4°C以10，500rpm離心20分鐘，輕輕倒出上清液。用去離子水(2x5mL)洗滌沉澱，冷凍乾燥以產生17.8mg的納米顆粒；Z-平均值=205nm, PDI=0.028 ; ζ電位=-36.2mV。用4.2mg的乾燥納米顆粒裝入7mL小瓶，添加ImL去離子水，振蕩15分鐘。向所得白色懸浮液中添加50 μ L的EtOH中的lmg/mL VB12-硬脂醯胺溶液，將混合物振蕩48h，隨後以13，OOOrpm離心30分鐘。輕輕倒出上清液，將沉澱冷凍乾燥以產生5.0mg的粉紅色納米顆粒；Z-平均值=204nm，PDI=0.021 ；ζ 電位=-35.0mV。
[0320]實施例27 -含艾塞那肽的VB12-包被的PLGA納米顆粒的合成
[0321]將10(^1^的？!17.5TE緩衝液中的10mg/mL艾塞那肽溶液與200 μ L的也在ρΗ7.5ΤΕ緩衝液中的20mg/mL乙醯化牛血清白蛋白溶液短暫組合。隨後添加750 μ L的二氯甲烷中的RG502H PLGA，將混合物超聲處理I分鐘。向所得白色乳液中添加2mL的20mg/mL PVA溶液(10k MW, 80%水解的)，再進行超聲處理I分鐘。隨後將該乳液添加至12mL的20mg/mLPVA溶液中，將混合物在未蓋蓋的20mL小瓶中攪拌1.5h。隨後將其在4°C以10，500rpm離心20分鐘,輕輕倒出上清液。用去離子水(2x5mL)洗漆沉澱,冷凍乾燥以產生16.3mg的納米顆粒；Z_平均值=210nm, PDI=0.092 ； ζ電位=-35.9mV。用9.0mg乾燥納米顆粒裝入7mL小瓶，添加2mL去離子水，振蕩15分鐘。向所得白色懸浮液中添加100 μ L的EtOH中的Img/mL VB12-硬脂醯胺溶液，將混合物振蕩48h，以13，OOOrpm離心30分鐘。輕輕倒出上清液，將沉澱冷凍乾燥以產生10.2mg的粉紅色納米顆粒；Z-平均值=266nm，PDI=0.196 ； ζ電位=-33.3mV0`
[0322]實施例28 - VB12-PEG-PLGA 的合成
[0323]在快速攪拌的條件下將維生素B12(l.65g)添加至無水DMSO (30mL)，攪拌深紫色溶液30分鐘。添加4A分子篩，繼續攪拌20分鐘。添加羰基-1，1-雙三唑(⑶T ；1.0g)，將混合物攪拌3小時，隨後傾倒進乙酸乙酯(150mL)。將沉澱離心，用乙酸乙酯洗滌，在高真空下乾燥以提供VB12-CT(2.06g)。將無水DMS0(4mL)中的單三苯甲基二氨基三甘醇(400mg)添加至無水DMSO (4mL)中的VB12-CT (600mg)溶液，將混合物攪拌20小時。添加三乙胺(0.1mL)，將混合物攪拌2小時，隨後傾倒進攪拌的乙酸乙酯(50mL)。將所得紅色懸浮液離心，隨後用乙酸乙酯(3x50mL)洗滌，在高真空下乾燥以提供作為暗紅色粉末的三苯甲基氨基三乙烯乙二醇胺-VB12(690mg)。將三苯甲基氨基三乙烯乙二醇胺-VB12 (660mg)緩慢地添加至三氟乙酸(5mL)和二氯甲烷(15mL)的混合物中，將混合物攪拌2小時，隨後添加至乙酸乙酯與庚烷的1:2混合物。將沉澱離心，用乙酸乙酯洗滌，在高真空下乾燥以提供作為暗紅色粉末的氨基三乙烯乙二醇胺-VB12(ATG-VB12 ；480mg)。
[0324]向二氯甲烷(20mL)中的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA RG502H ； IOOmg)和NHS (60mg)的溶液添加EDAC (IOOmg)，將混合物在室溫攪拌20分鐘。將溶液蒸發至~5mL，隨後添加至二乙醚(20mL)。用醚洗滌所得固體，真空乾燥以提供作為白色固體的PLGA NHS醚(180mg)。向二氯甲烷(5mL)中的PLGA NHS醚(170mg)溶液添加H2N-PEGlk-C02H(25mg)，隨後添加三乙胺(50 μ L)。將溶液攪拌18小時，蒸發溶劑，將殘留物溶解於二氯甲烷(IOmL)。用水(3xl0mL)洗滌溶液，蒸發溶劑，將產物在高真空下乾燥以提供 PLGA-PEGlkC02H(65mg)。將 PLGA_PEGlkC02H(65mg)溶解於 DMF(5mL)中，添加N, N，N' ,N'-四甲基-0-(1Η-苯並三唑-1-基)脲六氟磷酸鹽(HBTU ；5.7mg)和二異丙基乙胺(0.1mL)，將混合物攪拌5分鐘。添加DMF(2mL)中的氨基三乙烯乙二醇胺-VB12溶液(ATG-VB12 ；24mg)，將反應物攪拌16小時，隨後傾倒進二乙醚(35mL)。通過離心分離固體，將其溶解於二氯甲烷(30mL)，用水洗滌(3x30mL)，在Na2S04上乾燥。將溶劑蒸發至~2mL，添加至醚中。通過離心分離沉澱，在高真空下乾燥以提供作為淡紅色固體的PLGA-PEGlk-氨基三乙烯乙二醇胺-VB12(VB12-PEG-PLGA) (30mg)。利用ICP進行的鈷分析顯示產物包含8623.5ppm的鈷，這對應於19.8%w/w的VB12。
[0325]實施例29 - VB12-PEG-DSG 的合成
[0326]將二氯甲烷(15mL)中的1，2-0- 二硬脂醯-sn-甘油(DSG ；500mg)、N，N』 - 二琥珀醯亞胺基碳酸鹽(DSC ；322mg)和三乙胺(0.4mL)的混合物攪拌14小時。用水(3xl5mL)洗滌溶液，在Na2S04上乾燥，蒸發溶劑以提供DSG-CONHS (544mg)。向二氯甲烷(15mL)中的DSG-C0NHS (43Img)和H2N-PEG2k_C02H(900mg)冰冷溶液中添加吡啶(2mL)。將溶液在室溫攪拌24小時，隨後在真空下濃縮。將殘留物在矽土凝膠上經歷製備層析，用乙酸乙酯/己烷洗脫，隨後用Me0H/CH2C12洗脫，以提供作為白色固體的DSG_PEG2kC02H(941mg)。
[0327]向二氮甲烷(20mL)中的 DSG_PEG2kC02H(270mg)和 NHS(IOOmg)溶液中添加EDAC (33mg)，將混合物在室 溫攪拌過夜。添加另外部分的EDAC (128mg)，攪拌2小時，隨後添加另外部分的EDAC(50mg)和 NHS (50mg)，再攪拌過夜。用二氯甲烷(70mL)稀釋溶液，隨後用水和滷水(各自2x25mL)洗 滌，在Na2S04上乾燥，蒸發溶劑，在高真空下乾燥殘留物以提供 DSG-PEG2kC02H NHS 酯( 275mg)。
[0328]向DMF (5mL)中的氨基己基胺(amido) -VB12 (AH-VB12 ；175.4mg)和三乙胺(0.3mL)溶液添加DMF(5mL)中的DSG_PEG2kC02H NHS酯(270mg)溶液，將反應物攪拌17小時，隨後傾倒進乙酸乙酯(IOOmL)。通過離心分離固體，用醚洗滌，在高真空下乾燥以提供作為淡紅色固體的 DSG-C0-PEG2k-羧基氨基己胺-VB12 (VB12_PEG2k_DSG) (353mg)。
[0329]雖然本發明的幾個實施方案在本文中進行了詳細描述，但本領域普通技術人員應理解，可對其進行變化而不背離本發明的精神或所附權利要求的範圍。
[0330]在本文中舉例說明性的描述的本發明可適當地在任何元素、限制(未在本文中明確公開的)不存在的情況下進行實踐。因此，例如，術語「包含」、「包括」、「含有」等應當廣義地閱讀而無限制。此外，本文中使用的術語和表達已被用作描述而非限制的術語，這些術語和表達的使用無意排除顯示或描述的特徵的任何等同物或其部分，但應承認各種修飾可能在所述本發明的範圍內。
[0331]因此，應當理解，儘管本發明已明確地通過本文中體現的本發明的優選實施方案和任選的特徵、修飾、改進和變型公開，本文中的公開可求助於本領域普通技術人員，這些修飾、改進和變化被認為在本發明的範圍內。此處提供的材料、方法和實例代表優選實施方案，是示例性的，並且無意限制本發明的範圍。[0332]本發明已在本文中進行了廣泛和一般性描述。落在一般公開內容中的每一個更窄的種類和亞屬分類(subgeneric grouping)也形成本發明的部分。這包括具有條件或否定限制以除去來自屬的任何主題的本發明的一般性描述，無論切離的材料是否在本文中明確地記載。
[0333]此外，當本發明的特徵或方面以Markush組的方式描述時，本領域普通技術人員將承認本發明也以任何單個成員或Markush組的成員的亞組的方式進行描述。
[0334]本文中提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考資料明確地通過引用整體併入本文，達到就如同每一個個別地通過引用併入本文的相同程度。在矛盾的情況下，以本說明書(包括定義)為準。`
【權利要求】
1.一種納米顆粒，其包含被一種或多種聚合物封裝的治療劑，維生素B12或其衍生物通過接頭基團連接於所述至少一種或多種聚合物。
2.—種膠束，其包含被所述膠束封裝的治療劑和連接於所述膠束作為靶向試劑的維生素B12或其衍生物。
3.任一前述權利要求的納米顆粒或膠束，其中所述一種或多種聚合物選自合成聚合物、半合成聚合物、天然聚合物或能夠形成聚合電解質絡合物(PEC)的聚合物。
4.任一前述權利要求的納米顆粒或膠束，其中所述聚合物是如下聚合物的一種或多種:葡聚糖、羧甲基葡聚糖、殼聚糖、三甲基殼聚糖或聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PGLA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乙烯醇(PVA)、聚酐、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯酸酯、葡聚糖、殼聚糖、纖維素、羥丙甲纖維素、澱粉、樹狀聚合物、肽、蛋白質、聚乙二醇和聚(乙二醇-共-丙二醇)及上述聚合物的合成衍生物。
5.任一前述權利要求的納米顆粒或膠束，其中所述維生素B12或其衍生物是以下一種或多種:VB12-5』 -O-羧基三氮唑、VB12-5』 -O-羧基咪唑、VB12-5』 -O-羧醯氨-C2-C20-烷基胺、VB12-5』 -O-羧醯氨-寡聚乙烯氧基胺和上述化合物的二羧酸衍生物。
6.任一前述權利要求的納米顆粒或膠束，其中所述維生素B12或其衍生物連接於納米顆粒表面上的至少一種聚合物和/或包埋在所述納米顆粒或膠束中。
7.任一前述權利要求的納米顆粒或膠束，其中所述維生素B12或其衍生物共價地或物理地連接於一種或多種聚合物。
8.權利要求7的納米顆粒或膠束，其中所述物理連接包括VB12衍生物上的帶電荷的基團與納米顆粒或膠束的帶相反電 荷的區域之間的靜電結合相互作用、或VB12衍生物上的疏水基團與納米顆粒或膠束的疏水區域之間的疏水結合相互作用。
9.任一前述權利要求的納米顆粒或膠束，其中所述一種或多種聚合物包括可降解的聚合物或穩定的聚合物。
10.任一前述權利要求的納米顆粒或膠束，其中所述接頭是相同的或不同的，並且選自短肽鏈(H-[NHCHR-CO]n-OH)，其中η為1_20並且R對於η個胺基酸中的每一個胺基酸是相同的或不同的，並且是已知存在於天然胺基酸中的22個側基之一；短的烷基鏈(CH2)n，其中η=2-10，末端為兩個氨基或兩個羧基、或一個氨基和一個羧基；寡聚乙烯氧鏈(CH2CH2O)n，其中η=2-100，末端為兩個氨基或兩個羧基，或一個氨基和一個羧基；平均分子量為2kDa至70kDa的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)鏈，末端為兩個氨基或兩個羧基、或一個氨基和一個羧基；-C (O) NH (CH2)6NH- ；-C(0)NH (CH2) 6NHC (O) CH2- ； -C (O) N H (CH2CH2O) 2CH2CH2NH_ ；或-C (O) NH (CH2CH2O) 2CH2CH2NH C (O)CH2 [OCH2CH2J23NH-以及其任意組合。
11.任一前述權利要求的納米顆粒或膠束，其還包括包圍所述納米顆粒或膠束的聚合物包衣。
12.權利要求11的納米顆粒或膠束，其中包含一種或多種聚合物的所述聚合物包衣選自:合成聚合物、半合成聚合物、天然存在的聚合物或能夠形成聚合電解質絡合物(PEC)的聚合物。
13.權利要求12的納米顆粒或膠束，其中所述一種或多種聚合物包含葡聚糖、羧甲基葡聚糖、殼聚糖、三甲基殼聚糖或聚乳酸-羥基乙酸共聚物的一種或多種。
14.權利要求11至13的任一項的納米顆粒或膠束，其還包含通過接頭基團連接於所述包衣的一種或多種聚合物的維生素B12或其衍生物或其它靶向試劑。
15.權利要求11至14的任一項的納米顆粒或膠束，其中所述維生素B12或其衍生物是以下一種或多種:VB12-5』-0-羧基三氮唑、VB12-5』-0-羧基咪唑、VB12-5』-O-羧醯氨-C2-C20-烷基胺、VB12-5』 -O-羧醯氨-寡聚乙烯氧基胺和上述化合物的二羧酸衍生物。
16.權利要求14或15的納米顆粒或膠束，其中將所述維生素B12或其衍生物共價或物理地連接於所述一種或多種聚合物。
17.權利要求16的納米顆粒或膠束，其中所述物理連接包括VB12衍生物上的帶電荷的基團與納米顆粒或膠束的帶相反電荷的區域之間的靜電結合相互作用，或VB12衍生物上的疏水基團與納米顆粒或膠束的疏水區域之間的疏水結合相互作用。
18.權利要求11至17的任一項的納米顆粒或膠束，其中所述包衣的一種或多種聚合物包含可降解的聚合物或穩定的聚合物。
19.權利要求11至18的任一項的納米顆粒或膠束，其中所述接頭是相同的或不同的，選自短肽鏈(H-[NHCHR-CO]n-OH)，其中η為1_20並且R對於η個胺基酸中的每一個胺基酸是相同的或不同的，並且是已知存在於天然胺基酸中的22個側基之一；短的烷基鏈(CH2)n，其中η=2-10，末端為兩個氨基或兩個羧基、或一個氨基和一個羧基；寡聚乙烯氧鏈(CH2CH2O)n，其中η=2-100，末端為兩個氨基或兩個羧基、或一個氨基和一個羧基；平均分子量為2kDa至70kDa的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)鏈，末端為兩個氨基或兩個羧基、或一個氨基和一個羧基；-C (O) NH (CH2)6NH- ；-C(0)NH (CH2) 6NHC (O) CH2- ；-C (O) N H (CH2CH2O) 2CH2CH2NH- ；-C (O) NH (CH2CH2O) 2CH2CH2NHC (0)CH2 [OCH2CH2] 23NH-；以及其任意組合。
20.任一前述權利要求的納米顆粒或膠束，其還包含除維生素B12或其衍生物外的連接於所述納米顆粒、膠束或聚合物包衣的祀向試劑。
21.—種包含任一前述權利要求的膠束的脂質體。
22.權利要求21的脂質體，其還包含除維生素B12或其衍生物外的連接於脂質體的第二革巴向試劑。
23.任一前述權利要求的納米顆粒、膠束或脂質體，其中所述一種或多種聚合物是交聯的。
24.任一前述權利要求的納米顆粒、膠束或脂質體，其還包含聚乙二醇(PEG)和PEG嵌段共聚物物、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸和其它合成聚合物、澱粉、纖維素和其它多糖、脂肪酸和其它表面活性劑，以及金屬離子、二價和三價離子例如鋅、鎂和鈣。
25.任一前述權利要求的納米顆粒、膠束或脂質體，其中所述治療劑是以下一種或多種:小的或大的合成分子、蛋白質、肽、糖蛋白、核苷、核苷酸、人源化單克隆抗體、非人源化單克隆抗體、人源化和/或非人源化單克隆抗體的治療相關片段、和用於進行RNA幹擾(RNAi)的包含dsRNA、siRNA, miRNA或反義RNA的試劑。
26.任一前述權利要求的納米顆粒、膠束或脂質體，其中所述治療劑是以下治療劑的一種或多種:止痛劑、抗過敏藥、抗心絞痛藥、抗心律失常藥、抗生素類、抗凝血藥、抗痴呆藥、抗抑鬱藥、抗糖尿病藥、抗組胺藥、抗高血壓藥、消炎藥、抗腫瘤藥、抗寄生蟲藥、退燒藥、抗逆轉錄病毒藥物、抗消化性潰瘍藥、抗病毒藥、心血管藥物、降膽固醇藥、CNS活性藥物、激素、生長激素抑制劑、生長激素類、補血藥、止血藥、降血壓利尿藥、角質離解劑、骨質疏鬆症的治療劑、疫苗、血管收縮劑和血管擴張劑。
27.一種組合物，其包含載體和任一前述權利要求的納米顆粒、膠束或脂質體的一種或多種。
28.權利要求27的組合物，其中所述載體是藥學上可接受的載體。
29.權利要求28的組合物，其被配製用於口服施用。
30.一種包含任一前述權利要求的納米顆粒、膠束、脂質體或組合物的凍乾粉劑。
31.一種用於體內遞送治療劑的方法，包括向受試者施用有效量的任一前述權利要求的納米顆粒、膠束、脂質體或組合物，從而遞送所述治療劑。
32.一種用於製備納米顆粒組合物的方法，其包括將治療劑與至少一種聚合物於適當的溶劑中混合，維生素B12或其衍生物通過接頭基團連接於所述聚合物，以及任選地，其中所述聚合物對治療劑的比率在選自I至15%、I至40%、5至50%、5至40%、5至30%、10至35%或10至30%的範圍內。
33.權利要求32的方法，其還包括將除維生素B12或其衍生物外的第二靶向試劑在適當的溶劑中混合。
34.權利要求32或33的方法，其還包括將除維生素B12外的第二靶向試劑連接於所述至少一種聚合物。
35.權利要求32至34的任一項的方法，其還包括修飾所述納米顆粒以實現所述納米顆粒的組分的交聯，其中所述組分包括金屬離子、具有至少兩個帶正電荷的基團或兩個帶負電荷的基團的小分子、或反應以形成至少兩個共價鍵的小分子。
36.權利要求32至35的任一項的方法，其中所述溶劑為大於50%的水。
37.權利要求32至36的任一項的方法，其還包括從溶劑分離、純化和/或乾燥所述納米顆粒。
38.權利要求37的方法，其中通過一個或多個方法分離所述納米顆粒，所述方法包括溶劑蒸發、噴霧乾燥、冷凍乾燥、透析、切向流過濾、過濾或離心。
39.權利要求38的方法，其中通過添加共溶劑，隨後過濾或離心來分離所述納米顆粒。
40.權利要求32至39的任一項的方法，其還包括通過用適當的溶劑洗滌所述納米顆粒來純化所述納米顆粒。
41.一種利用權利要求32至40的任一項的方法製備的納米顆粒。
【文檔編號】A61K47/48GK103501821SQ201280021629
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2012年3月7日 優先權日:2011年3月8日
【發明者】D·P·諾沃特尼克, R·扎茨斯基, P·索德, N·R·尤麥尼尼 申請人:艾克塞斯製藥公司