一種穀物成熟種子的樹脂切片製作方法

2023-05-02 23:14:01

一種穀物成熟種子的樹脂切片製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種穀物成熟種子的樹脂切片製作方法，包括取材、固定、漂洗、脫水、樹脂滲透、包埋、聚合、修塊、半薄切片和染色等步驟，其特點是：①採用了4%多聚甲醛--2.5%戊二醛固定液二次固定技術；②使用了粘度很低、滲透能力很強的倫敦白膠（LRWhite）樹脂作為包埋劑；③建立了一種成熟種子的幹切技術；④建立了一種45℃--60℃二級展片法。本發明克服了常規方法製作的成熟種子切片嚴重捲曲、無法展片、容易破碎以及無法進行碘染色的缺點，能夠獲得組織、細胞結構完整、清晰，反差明顯的穀物成熟種子樹脂切片，從而為研究成熟種子的結構和功能提供了準確的技術支持。
【專利說明】一種穀物成熟種子的樹脂切片製作方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及顯微組織切片【技術領域】，特別是涉及一種穀物成熟種子的樹脂切片製作方法。

【背景技術】
[0002]穀物包括水稻、小麥、玉米等禾本科植物，它們的種子是糧食、飼料和工業原料的主要來源。在穀物中，胚乳是種子的重要組成部分，它的主要貯藏物質為澱粉和蛋白。澱粉在澱粉體中積累，貯藏蛋白在蛋白體中積累。穀物種子中澱粉、蛋白的含量和比例決定了穀物的營養價值，對穀物的加工和利用具有重要影響，因此研究種子胚乳中的澱粉和蛋白對提高種子的品質和產量具有重要的意義。
[0003]在食品、飼料和工業領域大量使用的是穀物成熟種子，而目前對穀物種子形態結構的研究主要集中在種子的發育階段，對成熟種子的研究還鮮有報導，主要由於:①隨著種子的發育和灌漿充實，澱粉含量逐漸逐漸升高，種子逐漸變硬，包埋劑很難滲透，導致切片容易破碎；②傳統的切片方法需要製作水槽進行展片和撈片，而成熟種子由於內部較緻密，切片會嚴重捲曲，在水槽裡無法展開；③傳統的切片方法無法切下完整的成熟種子斷面，只能切下零碎的區域，對研究種子內各成分的區域分布帶來了困難。因此亟需對現有的切片製作方法進行改良和優化，發明一種穀物成熟種子的切片製作方法。


【發明內容】

[0004]為了克服上述現有切片製作方法的不足，本發明提供了一種穀物成熟種子的樹脂切片製作方法。
[0005]本發明所採用的技術方案如下:
[0006](I)取材:選取粒形正常的穀物成熟種子，小心剝去穎殼，取出完整穎果備用；
[0007](2)固定:
[0008]①配製4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液:100mL 0.2mol/L磷酸緩衝液(p H7.4)+80mL10%多聚甲醛水溶液+20mL 25%戊二醛水溶液；
[0009]②將所取穎果浸泡在固定液中，固定液的用量為樣品體積的40倍,放於4°C冰箱中固定12h，使穎果軟化和初步固定；
[0010]③再用鋒利的刀片將軟化的穎果從中部橫斷開，切取穎果中部Imm厚的組織塊，再次浸泡於固定液中，放於4°C冰箱中固定48h,使組織和細胞充分固定。
[0011](3)漂洗:吸去固定液，用0.1M磷酸緩衝液漂洗固定後的穎果，共漂洗5次，每次30min,充分洗去固定液。
[0012](4)脫水:配製濃度為30 %,50 %,70 %和90 %的乙醇水溶液，按照30% -50% -70% -90% -100% -100%的梯度對穎果逐級脫水，每級15min。
[0013](5)樹脂滲透:
[0014]①配製倫敦白膠(LRW hite)樹脂:40mL樹脂+0.8g催化劑(Benzoyl Peroxide),磁力攪拌使充分溶解，放於4°C冰箱24h後使用；
[0015]②配製濃度為25%、50%和75%的樹脂乙醇溶液:樹脂和無水乙醇按照1:3、1:1和3:1的比例混配而成；
[0016]③按照25% -50% -75% -100% -100%的梯度對穎果逐級滲透，每級12h。
[0017](6)包埋:將滲透完的穎果橫斷面朝下放於包埋模具內，緩慢注入純樹脂浸沒穎果，避免出現氣泡。
[0018](7)聚合:將包埋模具放在烘箱內，60°C聚合1-2天(時間必須控制在2天之內，防止引起樹脂皺縮，導致切片困難)，使樹脂硬化。
[0019]⑶修塊:
[0020]①先用銼刀將樣品表面包埋劑磨去，露出穎果。
[0021]②然後將包埋塊夾在切片機的樣品夾上，頂端露出2_，在體視顯微鏡下用鋒利的刀片在穎果的四周以和水平面成45°的角削去包埋劑，其側面修成錐形體，樣品的正面修成上下邊平行的多邊形。
[0022](9)半薄切片:
[0023]①安裝玻璃刀，放在刀夾中夾緊；
[0024]②調整好包埋塊和玻璃刀的位置，在體視鏡下對刀，使刀鋒和樣品面對齊:
[0025]a)打開底部的背光燈，關閉其他照明燈，進刀使樣品面與刀鋒靠近，可以看見樣品面上出現一個亮條，利用這個亮條判斷樣品與刀是否對齊；
[0026]b)先調整樣品面上下兩條邊與刀鋒平行:觀察亮條的上下兩條邊是否平行，若不平行，則調整樣品夾旋轉旋鈕，使其平行。
[0027]c)再調整樣品面的左右與刀鋒平行:觀察亮條的左右兩條邊是否等長，若不等長，則調整刀鋒旋轉旋鈕，使其相等。
[0028]d)最後調整樣品面的上下與刀鋒平行:上下移動樣品面，觀察亮條左右兩條邊的長度是否變化，若有變化，則調整樣品面旋轉旋鈕，使其長度不變；
[0029]③對刀完成後，進刀使刀鋒與樣品接近，樣品面下緣與刀鋒等高，轉動樣品臂升降鈕使樣品臂上下運動，使刀鋒剛好切到組織為止。
[0030]④切片厚度設為2微米，進行手動切片:右手緩慢轉動樣品臂升降鈕開始切片，在切片的整個過程中，左手拿睫毛筆輕輕放在切片前端邊緣的正上方，防止其捲曲。此過程最為關鍵，左手要始終保持穩定，防止睫毛碰到刀鋒或戳破切片；
[0031]⑤取乾淨的載玻片，滴加蒸餾水，用鑷子小心夾住切片邊緣，將切片以和水平面成45 °角輕輕放在水滴上,45 V加熱板上乾燥,使切片展平。
[0032]⑥將切片放於烘箱中，60°C 12h，防止染色過程中脫片。
[0033](10)染色:
[0034]①碘液配製:5g碘+1g碘化鉀+85mL蒸餾水，完全溶解後用50%甘油稀釋80倍作為染液。
[0035]②番紅-甲基紫染液配製:a)番紅染液:lg番紅+1mL 95%乙醇溶解，再定容至10mL ；b)甲基紫染液:0.5g甲基紫+10mL蒸餾水。
[0036]③考馬斯亮藍R250染液配製:lg考馬斯亮藍R250+7%醋酸水溶液，60°C溶解。
[0037]④碘染色(染澱粉，呈藍紫色):滴加碘液後避光靜置lOmin，用蓋玻片封片後顯微鏡下觀察；
[0038]⑤番紅-甲基紫染色(染結構):
[0039]a)切片放於加熱板上加熱至55°C ；
[0040]b)滴加番紅染液染色12min ；
[0041]c)水洗5min，加熱板上烘乾；
[0042]d)滴加甲基紫染液染色5min ；
[0043]e)水洗5min，加熱板上烘乾後顯微鏡下觀察。
[0044]⑥考馬斯亮藍R250染色(染蛋白，呈深藍色):
[0045]a)切片放於加熱板上加熱至55°C ；
[0046]b)滴加7%醋酸處理5min ；
[0047]c)滴加考馬斯亮藍R250染液染色1min ；
[0048]d)滴加7%醋酸,分色2min ；
[0049]e)水洗5min，加熱板上烘乾後顯微鏡下觀察。
[0050]切片經碘液、番紅-甲基紫染液或考馬斯亮藍R250染液染色後，在光學顯微鏡下觀察，可獲得解析度高、反差適中的圖像。
[0051]與現有切片製作方法相比，本發明的優勢在於:
[0052](I)建立了適用於多種穀物成熟種子的樹脂切片製作方法。
[0053](2)採用了 4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液二次固定技術，先對整個種子進行軟化和預固定，再將種子切薄後進行再次固定，這樣可以完好地保存成熟種子的細胞結構。
[0054](3)使用了粘度很低、滲透能力很強，並且親水性也很強的樹脂倫敦白膠(LR White)作為包埋劑，它可以用於體積很大、內部很緻密的成熟種子包埋，並且方便各種水性染料進入，染色效果極佳，使用非常方便。
[0055](4)建立了一種成熟種子幹切技術，在切片過程中無需製作水槽，可以直接對包埋塊進行幹切，簡化了步驟。
[0056](5)可以完整地切下穎果的整個斷面，克服了常規方法會使切片嚴重捲曲、無法展片以及容易破碎的缺點。
[0057](6)建立了 45°C -60°C二級展片法，成熟種子切片與載玻片粘合牢固，在染色過程中不會脫片。
[0058](7)該方法製成的切片可以用碘液對澱粉粒進行特異性染色，而Epon812、Spurr』 s樹脂製成的切片無法用碘液進行染色，只能用PAS (高碘酸-希夫試劑)法對澱粉粒進行染色。PAS法染色的澱粉粒容易變形，並且清晰度和反差都很低，不利於澱粉粒結構的觀察，而碘染色的澱粉粒結構清晰，反差明顯，更利於觀察。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0059]圖1為水稻種子包埋塊修塊後表面的形狀；
[0060]圖2為切片過程關鍵步驟的示意圖，其中，A:睫毛；B:切片前端；C:玻璃刀鋒；D:包埋塊正面；
[0061]圖3為碘染色成熟水稻種子切片的顯微照片，其中，1:澱粉體；2:澱粉粒；
[0062]圖4為番紅-甲基紫染色成熟水稻種子切片的顯微照片，其中，1:澱粉體；2:澱粉粒;3:細胞壁；
[0063]圖5為考馬斯亮藍R250染色成熟水稻種子切片的顯微照片，其中，4:蛋白體。

【具體實施方式】
[0064]下面結合附圖對本發明作進一步說明。
[0065]實施例1:
[0066](I)取材:從稻穗上取下水稻成熟種子，用解剖針小心剝去穎殼，取出完整穎果，挑選10粒粒形正常的穎果放於青黴素瓶中備用；
[0067](2)固定:
[0068]①配製0.2mol/L磷酸緩衝液(P H 7.4):
[0069]a)母液A (0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液):稱取71.64g Na2HP04.12H20，用蒸餾水定容至100mL ；
[0070]b)母液B (0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液):稱取31.21g Na H2P04.2H20，用蒸餾水定容至100mL ；
[0071]c)按照A液:B液=81:19的比例混合，調節p H至7.4。
[0072]②配製10%多聚甲醛水溶液:
[0073]a)稱取20g多聚甲醒於250mL三角錐形瓶中，加入200mL蒸懼水,放入25*9mm規格的磁力攪拌子；
[0074]c)配製0.lmol/L氫氧化鈉水溶液:稱取40mg氫氧化鈉於1mL離心管中，加入1mL蒸餾水，混合均勻；
[0075]d)向錐形瓶中逐滴滴加0.lmol/L氫氧化鈉水溶液至多聚甲醛水溶液恰好澄清；
[0076]e)冷卻至室溫,調節P H至7.4。
[0077]③配製4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液:100mL 0.2mol/L磷酸緩衝液(p H7.4)+80mL10%多聚甲醛水溶液+20mL 25%戊二醛水溶液充分混勻，調節p H至7.4。
[0078]④往青黴素瓶中加入1mL 4%多聚甲醛-2.5 %戊二醛固定液，使穎果浸泡在固定液中，放於4°C冰箱中固定12h，使穎果軟化和初步固定；
[0079]⑤用鑷子取出穎果，用鋒利的刀片將軟化的穎果從中部橫斷開，切取穎果中部1_厚的組織塊，再次浸泡於青黴素瓶中的固定液中，放於4°C冰箱中固定48h，使組織和細胞充分固定。
[0080](3)漂洗:
[0081]①配製0.lmol/L磷酸緩衝液(p H 7.4): 10mL 0.2mol/L磷酸緩衝液+10mL蒸餾水，充分混勻。
[0082]②用乾淨的吸管小心吸去固定液，不要碰到穎果斷面，再用0.lmol/L磷酸緩衝液漂洗固定後的穎果，共漂洗5次,每次30min,充分洗去固定液。
[0083](4)脫水:配製濃度為30 %,50 %,70 %和90 %的乙醇水溶液，按照30% -50% -70% -90% -100% -100%的梯度對穎果逐級脫水:每級 1mLjj^K 15min。
[0084](5)樹脂滲透:
[0085]①配製倫敦白膠(LR W hite)樹脂:量取40mL樹脂於50mL離心管中，稱取0.8g催化劑(Benzoyl Peroxide)倒入離心管中,磁力攪拌20min使充分溶解,放於4°C冰箱24h後使用；
[0086]②配製濃度為25%、50%和75%的樹脂乙醇溶液:樹脂和無水乙醇按照1:3、1:1和3:1的比例混配而成；
[0087]③按照25% -50% -75% -100% -100 %的梯度對穎果逐級滲透:每級5mL，放於4°C冰箱，滲透12h。
[0088](6)包埋:用鑷子輕輕夾住穎果側面，將橫斷面朝下放於包埋模具內，用200mL移液槍緩慢注入純樹脂浸沒穎果，避免出現氣泡。
[0089](7)聚合:將包埋模具放在烘箱內，60°C聚合1-2天(時間必須控制在2天之內，防止引起樹脂皺縮，導致切片困難)，使樹脂硬化。
[0090](8)修塊:
[0091]①先用銼刀將樣品表面包埋劑磨去，露出穎果。
[0092]②然後將包埋塊夾在切片機的樣品夾上，頂端露出2mm，在體視顯微鏡下用鋒利的刀片在穎果的四周以和水平面成45°的角削去包埋劑，其側面修成錐形體，樣品的正面修成上下邊平行的六邊形，如圖1所示。
[0093](9)半薄切片:
[0094]①安裝玻璃刀，放在刀夾中夾緊；
[0095]②調整好包埋塊和玻璃刀的位置，在體視鏡下對刀，使刀鋒和樣品面對齊:
[0096]a)打開底部的背光燈，關閉其他照明燈，進刀使樣品面與刀鋒靠近，可以看見樣品面上出現一個亮條，利用這個亮條判斷樣品與刀是否對齊；
[0097]b)先調整樣品面上下兩條邊與刀鋒平行:觀察亮條的上下兩條邊是否平行，若不平行，則調整樣品夾旋轉旋鈕，使其平行；
[0098]c)再調整樣品面的左右與刀鋒平行:觀察亮條的左右兩條邊是否等長，若不等長，則調整刀鋒旋轉旋鈕，使其相等；
[0099]d)最後調整樣品面的上下與刀鋒平彳丁:上下移動樣品面，觀察売條左右兩條邊的長度是否變化，若有變化，則調整樣品面旋轉旋鈕，使其長度不變；
[0100]③對刀完成後，進刀使刀鋒與樣品接近，樣品面下緣與刀鋒等高，轉動樣品臂升降鈕使樣品臂上下運動，使刀鋒剛好切到組織為止。
[0101]④切片厚度設為2微米，進行手動切片:右手緩慢轉動樣品臂升降鈕開始切片，在切片的整個過程中，如圖2所示，包埋塊的正面D勻速、緩慢地下移，玻璃刀鋒C逐漸切下切片，左手拿睫毛筆輕輕放在切片前端B邊緣的正上方，防止其捲曲。此過程最為關鍵，左手要始終保持穩定，防止睫毛A碰到刀鋒或戳破切片；
[0102]⑤取乾淨的載玻片，滴加蒸餾水，用鑷子小心夾住切片邊緣，將切片以和水平面成45 °角輕輕放在水滴上,45 V加熱板上乾燥,使切片展平。
[0103]⑥將切片放於烘箱中，60°C烘12h，防止染色過程中脫片。
[0104](10)染色:
[0105]①碘液配製:5g碘+1g碘化鉀+85mL蒸餾水，完全溶解後用50%甘油稀釋80倍作為染液。
[0106]②番紅-甲基紫染液配製:
[0107]a)番紅染液:Ig番紅+1mL 95%乙醇溶解，再定容至10mL ；
[0108]b)甲基紫染液:0.5g甲基紫+10mL蒸餾水。
[0109]③考馬斯亮藍R250染液配製:lg考馬斯亮藍R250+7%醋酸水溶液，60°C溶解。
[0110]④碘染色(染澱粉，呈藍紫色):滴加碘液後避光靜置lOmin，用蓋玻片封片後顯微鏡下觀察；
[0111]⑤番紅-甲基紫染色(染結構):
[0112]a)切片放於加熱板上加熱至55°C ；
[0113]b)滴加番紅染液染色12min ；
[0114]c)水洗5min，加熱板上烘乾；
[0115]d)滴加甲基紫染液染色5min ；
[0116]e)水洗5min，加熱板上烘乾後顯微鏡下觀察。
[0117]⑥考馬斯亮藍R250染色(染蛋白，呈深藍色):
[0118]a)切片放於加熱板上加熱至55°C ；
[0119]b)滴加7%醋酸處理5min ；
[0120]c)滴加考馬斯亮藍R250染液染色1min ；
[0121]d)滴加7%醋酸,分色2min ;
[0122]e)水洗5min，加熱板上烘乾後顯微鏡下觀察。
[0123]切片經碘液、番紅-甲基紫染液或考馬斯亮藍R250染液染色後，在光學顯微鏡下觀察，可獲得解析度高、反差適中的圖像，如圖3、圖4和圖5。圖3為切片經碘液染色，顯示出水稻胚乳細胞內完整和清晰的澱粉粒2，多個多角形澱粉粒2排列組成澱粉體I。圖4為切片經番紅-甲基紫染液染色，顯示清晰的細胞壁3、澱粉體I和澱粉粒2，圖5為切片經考馬斯亮藍R250染液染色，顯示胚乳細胞內完整和清晰的蛋白體4。
【權利要求】
1.一種穀物成熟種子的樹脂切片製作方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)取材:穀物成熟種子，剝去穎殼，取完整穎果； (2)固定:將所取穎果浸泡在4%多聚甲醛一2.5%戊二醛固定液中24 h，使穎果軟化；將軟化的穎果橫斷開，切取穎果中部I mm厚的組織塊，再次浸泡於4%多聚甲醛一2.5%戊二醛固定液中48 h，使組織和細胞充分固定； (3)漂洗:用0.1 M磷酸緩衝液漂洗固定後的穎果，充分洗去固定液； (4)脫水:用30%-50%-70%-90%-100%-100%乙醇對穎果逐級脫水，每級15min ； (5)樹脂滲透:用25%-50%-75%-100%-100%倫敦白膠樹脂對穎果逐級滲透，每級12h ； (6)包埋:將滲透完的穎果放於包埋模具內，注入純樹脂； (7)聚合:將包埋模具放在烘箱內，60°C聚合1-2天，使樹脂硬化； (8)修塊:對包埋塊進行手工修塊，將穎果周圍多餘樹脂削去； (9)半薄切片:用超薄切片機切厚度為2微米切片，將切片轉移到載玻片上的水滴上，將載玻片放在45°C加熱板上乾燥，使切片展平； (10)染色:展平的切片經碘液、番紅-甲基紫染液或考馬斯亮藍R250染液染色，在光學顯微鏡下觀察，可獲得解析度高、反差適中的圖像。
2.根據權利要求1所述的切片製作方法，其特徵在於，步驟(2)中，所述固定液的配方為:100 mL 0.2mol/L pH 7.4磷酸緩衝液、80 mL 10%多聚甲醛水溶液和20 mL 25%戊二醛水溶液。
3.根據權利要求1所述的切片製作方法，其特徵在於，步驟(2)中，所述固定液的用量為樣品體積的40倍，固定的溫度為4°C。
4.根據權利要求1所述的切片製作方法，其特徵在於，步驟(5)中，所述25%-50%-75%樹脂為100%倫敦白膠樹脂與100%乙醇分別按1:3、1:1和3:1的體積比混配而成。
5.根據權利要求1所述的切片製作方法，其特徵在於，步驟(6)中，所述穎果包埋時必須保持斷面朝下，加入純樹脂時必須緩慢加入，防止產生氣泡。
6.根據權利要求1所述的切片製作方法，其特徵在於，步驟(8)中，所述修塊的具體過程為: ①先用銼刀將樣品表面包埋劑磨去，露出穎果； ②然後將包埋塊夾在切片機的樣品夾上，頂端露出2mm，在體視顯微鏡下用鋒利的刀片在穎果的四周以和水平面成45--的角削去包埋劑，其側面修成錐形體，樣品的正面修成上下邊平行的多邊形。
7.根據權利要求1所述的切片製作方法，其特徵在於，步驟(9)中，所述半薄切片的切片方法中，直接對包埋塊進行幹切，完整地切下穎果的整個斷面。
8.根據權利要求1所述的切片製作方法，其特徵在於，步驟(9)中，所述半薄切片的切片方法為: ①安裝玻璃刀，放在刀夾中夾緊； ②調整好包埋塊和玻璃刀的位置，在體視鏡下對刀，使刀鋒和樣品面對齊: a)打開底部的背光燈，關閉其他照明燈，進刀使樣品面與刀鋒靠近，可以看見樣品面上出現一個亮條，利用這個亮條判斷樣品與刀是否對齊； b)先調整樣品面上下兩條邊與刀鋒平行:觀察亮條的上下兩條邊是否平行，若不平行，則調整樣品夾旋轉旋鈕，使其平行； C)再調整樣品面的左右與刀鋒平行:觀察亮條的左右兩條邊是否等長，若不等長，則調整刀鋒旋轉旋鈕，使其相等； d)最後調整樣品面的上下與刀鋒平行:上下移動樣品面，觀察亮條左右兩條邊的長度是否變化，若有變化，則調整樣品面旋轉旋鈕，使其長度不變； ③對刀完成後，進刀使刀鋒與樣品接近，樣品面下緣與刀鋒等高，轉動樣品臂升降鈕使樣品臂上下運動，使刀鋒剛好切到組織為止； ④切片厚度設為2微米，進行手動切片:右手緩慢轉動樣品臂升降鈕開始切片，在切片的整個過程中，左手拿睫毛筆輕輕放在切片前端邊緣的正上方，防止其捲曲； 此過程最為關鍵，左手要始終保持穩定，防止睫毛碰到刀鋒或戳破切片； ⑤取乾淨的載玻片，滴加蒸餾水，用鑷子小心夾住切片邊緣，將切片以和水平面成45--角輕輕放在水滴上，45°C加熱板上乾燥,使切片展平； ⑥將切片放於烘箱中，60°C12h，防止染色過程中脫片。
9.根據權利要求1所述的切片製作方法，其特徵在於，步驟(10)中，所述染液的配方為: ①碘液:5g碘+1g碘化鉀+85mL蒸餾水，完全溶解後用50%甘油稀釋80倍作為染液； ②番紅-甲基紫染液: a)番紅染液:lg番紅+10mL 95%乙醇溶解，再定容至100 mL ； b)甲基紫染液:0.5g甲基紫+100 mL蒸餾水； ③考馬斯亮藍R250染液:lg考馬斯亮藍R250+7%醋酸水溶液，60°C溶解。
10.根據權利要求1所述的切片製作方法，其特徵在於，步驟(10)中，所述染色方法為:①碘染色:滴加碘液後避光靜置10min，用蓋玻片封片後顯微鏡下觀察；澱粉呈藍紫色； ②番紅-甲基紫染色: a)切片放於加熱板上加熱至55°C； b)滴加番紅染液染色12min ； c)水洗5min,加熱板上烘乾； d)滴加甲基紫染液染色5min ; e)水洗5min，加熱板上烘乾後顯微鏡下觀察； ③考馬斯亮藍R250染色: a)切片放於加熱板上加熱至55°C； b)滴加7%醋酸處理5min ； c)滴加考馬斯亮藍R250染液染色10min ；d)滴加7%醋酸，分色2 min ； e)水洗5 min，加熱板上烘乾後顯微鏡下觀察，蛋白呈深藍色。
【文檔編號】G01N1/30GK104374601SQ201410743579
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年12月8日 優先權日:2014年12月8日
【發明者】韋存虛, 蔡燦輝, 趙凌霄 申請人:揚州大學