S100a4蛋白的純化與鑑定的製作方法

2023-05-02 18:55:21

專利名稱：S100a4蛋白的純化與鑑定的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白分子的純化與鑑定。具體的說，本發明涉及一種具有高效 表達活性的S100A4蛋白分子的純化與鑑定。
背景技術：
S100A4蛋白是以非共價鍵結合二聚體存在於細胞內，而以共價結合二聚體分泌 到細胞外。推測Ca2+結合後可導致S100A4蛋白構型改變，在表面暴露出新的結合位點， 從而可與一系列靶標結合。胞外基質中的S100A4蛋白是一種單體和二聚體共存的狀態， 其比例受Ca2+結合程度的影響；胞內S100A4蛋白的同源二聚體和異源二聚體形式也是同 時存在。因此，從S100A4蛋白可形成同源二聚體、異源二聚體、寡聚體的多種形式來 看，其結構具有很強的可變性，這可能也是它在體內具有多種生物學功能的結構基礎。S100A4蛋白與腫瘤的發生、轉移及預後密切相關，參與血管生成、細胞外基質 重建等生命過程。因此，構建S100A4蛋白載體、表達並純化S100A4蛋白，可以用於與 P53等靶分子相互作用的基礎研究，以揭示其作用機制。

發明內容
本發明提供了一種純化與鑑定S100A4蛋白的方法。該方法包括如下步驟(1)S100A4蛋白的純化①將層析柱連接AKTA FPLC蛋白純化儀，並以約5倍體積的1 Xbinding buffer
平衡至基線。②平衡以後，將破碎上清以1 X binding buffer稀釋3_5倍以0.45 y m的除菌濾器 過濾除菌後以3mL/min的流速上樣，收集穿透液。③以1 X binding buffer平衡至基線，用elution buffer (洗脫緩衝液)進行線性梯度
洗脫，以3mL/管收集蛋白峰，進行SDS-PAGE鑑定和純度鑑定。(2)S100A4蛋白的脫鹽為了加快純化速度，防止蛋白在純化過程中降解，採用GE Health HiTrap
Desalting柱進行脫鹽處理，程序參照該層析柱說明書，簡言之，緩衝液為生理鹽水緩衝 液，平衡柱子3-5個柱床體積後，用注射器手推上樣，上樣過程中棄去所有的流出液， 上樣完畢後，將層析柱連接FPLC系統，監測紫外和電導，收集相應紫外峰，所需蛋白先 洗脫，鹽類等小分子後洗脫，收集蛋白峰，進行SDS-PAGE分析(3)蛋白鑑定a SDS-PAGE 鑑定①將上一步驟中收集的破碎後上清液吸取25 iU，再加入25iU的2XSDS上樣緩 衝液，混合均勻；②取破碎後的沉澱少許，加入25iU的PBS後，再加入25iU的2XSDS上樣緩 衝液，混合均勻；
③將上述兩者100°C煮沸5min，並短暫離心，進行SDS_PAGE電泳，鑑定其表 達形式。b Western-Blot 鑑定①處理好蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳，記錄加樣順序。②電泳完畢後，取下凝膠，標記方向，切取所需大小的膠。③量取一張與膠塊大小相同的硝酸纖維素膜；6張濾紙，大小同凝膠。④將濾紙用轉移buffer溼潤，取3張疊放於半乾轉移儀上，將硝酸纖維素膜疊放 上去後，把大小相同的凝膠疊放上去，再將轉移buffer溼潤的濾紙3張疊放上去。⑤檢查氣泡，接通半乾轉移儀，以lmA/cm2的電量，開始轉移lh_1.5h。⑥轉移完畢後，取下硝酸纖維素膜，放入平皿，加入15 20mL的B液，封閉 過夜(輕搖)⑦封閉結束後，用D液洗膜3次，2min/次，加入15 20mL的用C液稀釋好 的一抗(兔抗S100A4)，輕搖lh。⑧再用D液洗膜3次，2min/次，加入15_20mL的用C液稀釋好的酶標二抗(羊 抗兔IgG-HRP)，輕搖lh。⑨再用D液洗膜3次，2min/次，加入A液配製好的DAB (0.35g/L) 10mL，再 加入H20230iiL觀察特異性反應，2-3min後，用2mol/L的硫酸終止反應，用蒸餾水衝洗
膜


圖1為S100A4的SDS-PAGE電泳分析圖2為純化後S100A4的SDS-PAGE電泳分析圖3 為 S100A4 的 Western blot 鑑定結果
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明(1)S100A4蛋白的純化①將層析柱連接AKTA FPLC蛋白純化儀，並以約5倍體積的1 Xbinding buffer
平衡至基線。②平衡以後，將破碎上清以1 X binding buffer稀釋3_5倍以0.45 y m的除菌濾器 過濾除菌後以3mL/min的流速上樣，收集穿透液。③以1 X binding buffer平衡至基線，用elution buffer (洗脫緩衝液)進行線性梯度
洗脫，以3mL/管收集蛋白峰，進行SDS-PAGE鑑定和純度鑑定。(2)S100A4蛋白的脫鹽為了加快純化速度，防止蛋白在純化過程中降解，採用GE Health HiTrap
Desalting柱進行脫鹽處理，程序參照該層析柱說明書，簡言之，緩衝液為生理鹽水緩衝 液，平衡柱子3-5個柱床體積後，用注射器手推上樣，上樣過程中棄去所有的流出液， 上樣完畢後，將層析柱連接FPLC系統，監測紫外和電導，收集相應紫外峰，所需蛋白先 洗脫，鹽類等小分子後洗脫，收集蛋白峰，進行SDS-PAGE分析
(3)蛋白鑑定a SDS-PAGE 鑑定①將上一步驟中收集的破碎後上清液吸取25 iU，再加入25iU的2XSDS上樣緩 衝液，混合均勻；②取破碎後的沉澱少許，加入25iU的PBS後，再加入25iU的2XSDS上樣緩 衝液，混合均勻；③將上述兩者100°C煮沸5min，並短暫離心，進行SDS_PAGE電泳，鑑定其表 達形式。 b Western-Blot 鑑定①處理好蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳，記錄加樣順序。②電泳完畢後，取下凝膠，標記方向，切取所需大小的膠。③量取一張與膠塊大小相同的硝酸纖維素膜；6張濾紙，大小同凝膠。④將濾紙用轉移buffer溼潤，取3張疊放於半乾轉移儀上，將硝酸纖維素膜疊放 上去後，把大小相同的凝膠疊放上去，再將轉移buffer溼潤的濾紙3張疊放上去。⑤檢查氣泡，接通半乾轉移儀，以lmA/cm2的電量，開始轉移lh_1.5h。⑥轉移完畢後，取下硝酸纖維素膜，放入平皿，加入15 20mL的B液，封閉 過夜(輕搖)⑦封閉結束後，用D液洗膜3次，2min/次，加入15 20mL的用C液稀釋好 的一抗(兔抗S100A4)，輕搖lh。⑧再用D液洗膜3次，2min/次，加入15_20mL的用C液稀釋好的酶標二抗(羊 抗兔IgG-HRP)，輕搖lh。⑨再用D液洗膜3次，2min/次，加入A液配製好的DAB (0.35g/L) 10mL，再 加入 H20230 u L觀察特異性反應，2-3min後，用2mol/L的硫酸終止反應，用蒸餾水衝洗膜2.結 果2.1重組蛋白的純化菌體經超聲破碎後顯示，S100A4以上清形式存在。融合蛋白C端表達6XHis Tag便於純化。6XHis Tag的加入並不影響其可溶性表達[32-34]。對將破碎後的菌液上 清用Amersham公司生產的全自動快速液相色譜系統(FPLC)過Ni柱，純化過程見圖，當 洗脫劑咪唑濃度為lOmmol/L時有很多雜蛋白被洗下，隨即採用咪唑的線形洗脫，當咪唑 濃度到達100mmol/L時目的蛋白開始被洗下，咪唑濃度達到100mmol/L時目的蛋白達到 最大值。2.2重組蛋白的脫鹽將純化後的蛋白通過脫鹽柱進行脫鹽，每5mL層析柱上樣1.5mL，手推上樣後 連接FPLC系統，流速3mL/min，紫外值迅速上升，目的蛋白很快洗下，但此時溶液電 導尚未上升，紫外吸收峰快下降至底端時，電導迅速開始上升，此時蛋白收集完畢，同 時，由於金屬螯合層析的緩衝液中咪唑的作用，紫外吸收值又開始上升，出現另一個小 的紫外吸收峰，待電導與紫外值都下降至基線後即可進行下一次脫鹽2.3 重組 S100A4 蛋白的 Western-blot 分析
以pBV220空菌為對照，上樣量15iiL，對稱上樣，進行SDS-PAGE電泳，電泳
完畢後去掉積層膠，把分離膠中間切開，一半用考馬斯亮藍染色，一半進行Western-blot 分析，以小鼠抗組氨酸標籤抗體作為一抗，以HRP-羊抗小鼠IgG作為二抗，DAB顯 色，可以看到，在llkD處，pBV220空菌為對照未見顯色條帶，純化後的S100A4製品 與pBV220-S100A4誘導表達產物均有特異條帶，表明S100A4獲得了表達並進行了有效 純化。在蛋白電泳圖上約44kD處未見明顯條帶，但在Western-blot圖上有明顯條帶，推 測可能是S100A4形成的聚體。(圖3)
權利要求
1.權利要求1所述的S100A4蛋白的純化與鑑定，其特徵在於包括如下步驟(1)S100A4蛋白的純化①將金屬鰲合層析柱(GEHealth)連接AKTA FPLC蛋白純化儀，並以約5倍體積的 結合緩衝液平衡至基線。②平衡以後，將破碎上清以結合緩衝液稀釋3-5倍以0.45μ m的除菌濾器過濾除菌後 以3mL/min的流速上樣，收集穿透液。③以結合緩衝液平衡至基線，用洗脫緩衝液進行線性梯度洗脫，以3mL/管收集 A280峰，進行SDS-PAGE鑑定和純度鑑定。(2)S100A4蛋白的脫鹽採用GE Health HiTrap Desalting柱進行脫鹽處理，程序參照該層析柱說明書，簡言之，緩衝液為生理鹽水緩衝液，平衡柱子3-5個柱床體積後，用注射器手推上樣，上樣 過程中棄去所有的流出液，上樣完畢後，將層析柱連接FPLC系統，監測A280值與電 導，進行SDS-PAGE分析(3)蛋白鑑定a SDS-PAGE 鑑定①將上一步驟中收集的破碎後上清液吸取25μ 1，再加入25μ 1的2 X SDS上樣緩衝 液，混勻；②取破碎後的沉澱少許，加入25μ 1的PBS重懸後，再加入25 μ 1的2 X SDS上樣緩 衝液，混勻；③將上述兩者100°C煮沸5min，並短暫離心，進行SDS-PAGE電泳，鑑定其表達形 式。b Western-Blot 鑑定按照常規Western-Blot法操作規程操作，以兔抗S100A4 (來源Santa clouse公司)為一抗，進行鑑定所表達的S100A4蛋白。
全文摘要
本發明公開了一種S100A4蛋白的純化與鑑定方法。本發明採用金屬螯合層析法對表達載體pBV220-S100A4的表達產物純化後，進行SDS-PAGE鑑定和Western-Blot鑑定。為了加快純化速度，防止蛋白在純化過程中降解，採用GE Health HiTrap Desalting柱進行脫鹽處理。
文檔編號G01N33/548GK102020708SQ200910070460
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月17日 優先權日2009年9月17日
發明者佘曉俊, 劉子泉, 劉洪濤, 崔博, 張娜, 徐傳香, 王天輝, 陳學偉, 馬強 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所