華中五味子提取物在製備治療撲熱息痛所致肝損傷藥物中的應用的製作方法
2023-05-02 13:55:01 1
華中五味子提取物在製備治療撲熱息痛所致肝損傷藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開華中五味子提取物在製備治療撲熱息痛(APAP)所致肝損傷藥物中的應用,所述華中五味子提取物的主要成分為五味子酯甲和五味子甲素。通過實驗發現華中五味子提取物可顯著抵抗因APAP所致肝損傷引起的血清ALT及AST水平升高和肝細胞壞死,抑制肝細胞中還原性穀胱甘肽的消耗,從而減輕APAP所致的肝損傷程度,機制涉及激活Nrf2-ARE信號通路,表現為上調Nrf2的mRNA表達、促進Nrf2核轉位、啟動下遊藥物代謝酶及抗氧化基因的轉錄。實驗結果表明華中五味子提取物對APAP造成的肝損傷有治療效果,為臨床防治APAP所致肝損傷提供了新的方法和手段。
【專利說明】華中五味子提取物在製備治療撲熱息痛所致肝損傷藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於醫藥【技術領域】,具體涉及華中五味子提取物在製備治療撲熱息痛所致肝損傷藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]撲熱息痛(Acetaminophen, APAP),又名對乙醯氨基酚,是目前世界範圍內應用最廣泛的0TC類解熱鎮痛藥。當前,上市的感冒藥和鎮痛藥中,含有APAP的已超過100種,僅以國內常見的藥物為例,泰諾、百服寧、白加黑、感康、快克、999感冒靈、必理通、康必得、速效傷風膠囊、泰諾林、瑞迪菲、維C銀翹片等均含有該成分。
[0003]APAP在治療劑量時用藥安全、療效確切,但服用過量可引起肝損傷、急性肝衰竭(Acute liver failure, ALF)甚至死亡。在美國、英國、澳大利亞及其它歐美國家,APAP過量是藥物性肝損傷和ALF最常見的原因。因此,APAP的肝毒性一直受到廣泛關注和重視。APAP過量服用時,大量的APAP由CYP450酶氧化形成N-乙醯對苯醌亞胺(NAPQI)。NAPQI導致穀胱甘肽(GSH)耗竭,並與細胞內蛋白特別是線粒體蛋白共價結合,引發線粒體氧化應激。通過氧化應激反應和活性氧簇R0S的生成,可激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化和核轉位,進一步促進和放大線粒體氧化應激,引發線粒體膜流動性降低、線粒體通透性轉換孔(MPT)的開放,誘發線粒體功能異常,最終導致肝細胞的損傷、凋亡和壞死。
[0004]N-乙醯半胱氨酸(NAC)是目前臨床上用於治療APAP急性中毒的經典藥物,但該藥物的局限之處在於其治療窗較窄,對APAP中毒急性後期的治療無效,且長期給予高劑量NAC可幹擾正常肝細胞線粒體代謝過程,阻斷NF-kB信號通路從而抑制APAP肝損傷後的肝再生。因此,尋找新的有效治療APAP肝毒性的藥物具有重要意義。
[0005]華中五味子ScAj'sanc/ra sphenanthera Rehd.et ffils.為民間常用中藥,具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效,主要用於久嗽虛喘、遺夢滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗、盜汗、津傷口渴、氣短脈虛、內熱消渴及心悸失眠等症。現代藥理研究表明,華中五味子具有擴張血管、鎮靜、祛痰、止咳、抗衰老、提高免疫力等作用,特別是保護肝臟的作用。但目前未見華中五味子提取物在治療APAP所致肝損傷方面的相關報導。
【發明內容】
[0006]本發明的發明目的在於提供華中五味子提取物在製備治療撲熱息痛所致肝損傷藥物中的應用。 [0007]本發明的上述目的通過如下技術方案予以實現:
華中五味子提取物在製備治療撲熱息痛所致肝損傷藥物中的應用,所述華中五味子提取物中五味子酯甲和五味子甲素的質量分數均不少於2.5%。
[0008]所述華中五味子提取物的製備方法為:取華中五味子100 g加8倍量水煎煮1 h,過濾去除濾液,藥渣烘乾後粉碎,用8倍量70%乙醇回流提取2次,每次1.5 h,過濾,合併濾液,濃縮,即得華中五味子提取物浸膏。
[0009]本發明所述藥物還包括醫藥領域常規的藥物載體,如填充劑、黏合劑、溼潤劑、崩解劑、潤滑劑、矯味劑、防腐劑等。
[0010]所述填充劑為澱粉、糊精、糖粉、甘露醇、乳糖或磷酸氫鈣。
[0011]所述黏合劑為纖維素衍生物、明膠、澱粉漿或聚維酮。
[0012]所述溼潤劑為水或乙醇。
[0013]所述崩解劑為乾燥澱粉、羧甲基澱粉鈉、碳酸鈣或碳酸氫鈉。
[0014]所述潤滑劑為滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、聚乙二醇或十二烷基硫酸鎂。
[0015]所述矯味劑為糖精鈉、蔗糖或甜蜜素。
[0016]所述防腐劑為苯甲酸、山梨酸或尼泊金。
[0017]本發明所述藥物可以為醫藥領域常規劑型,包括膠囊劑、顆粒劑、片劑、散劑、溶液劑、乳劑、混懸劑等。
[0018]根據實際需要,所述藥物的劑型還可以是緩釋劑或控釋劑。
[0019]現有技術中,雖然已有五味子果仁乙醇提取物(五仁醇)及其有效成分之一五味子醇乙預先24小時給藥能顯著降低大劑量撲熱息痛肝中毒所致的小鼠死亡率,但是中藥提取物的化學成分及藥效作用往往因藥材種類、藥用部位、所採用的提取方法的不同而存在明顯的差異,而本發明運用指紋圖譜技術對華中`五味子果實的乙醇提取物中化學成分進行了表徵,其主要成分為五味子酯甲和五味子甲素。
[0020]本發明所述華中五味子提取物治療撲熱息痛所致的肝損傷是激活Nrf2_ARE信號通路,表現為上調Nrf2的mRNA表達、促進Nrf2核轉位、啟動下遊藥物代謝酶及抗氧化基因的轉錄,從而減輕肝細胞壞死。
[0021]本發明具有如下有益效果:
本發明實驗以一次性過量給予APAP致小鼠急性肝損傷為模型,這種模型所造成的肝臟損傷主要以肝細胞壞死為主,血清中ALT及AST酶活性快速升高。急性肝損傷形成後給予華中五味子提取物,可顯著抵抗因APAP所致肝損傷引起的血清ALT及AST水平升高和肝細胞壞死,抑制肝細胞中還原性穀胱甘肽的消耗,激活Nrf2-ARE信號通路,從而減輕APAP所致的肝損傷程度,實驗結果表明本發明華中五味子提取物對APAP造成的肝損傷有治療效果,為臨床防治APAP所致肝損傷提供了新的方法和手段。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1為華中五味子提取物化學指紋圖譜;其中A為6種木脂素成分對照品的色譜圖出為華中五味子提取物的化學指紋圖譜,其中峰1為五味子醇甲,峰2為五味子醇乙,峰3為五味子酯甲,峰4為五味子甲素,峰5為五味子乙素,峰6為五味子丙素;
圖2為華中五味子提取物對APAP誘導小鼠急性肝損傷模型血清中ALT、AST酶活性的影響結果圖;
圖3為華中五味子提取物對APAP誘導小鼠急性肝損傷模型肝細胞壞死程度的影響結果圖(HE染色的肝臟病理切片);
圖4為華中五味子提取物對APAP誘導小鼠急性肝損傷的肝臟線粒體內GSH水平的影響結果圖;圖5為華中五味子提取物對APAP誘導小鼠急性肝損傷的肝臟Nrf2 mRNA及核內蛋白表達的影響結果圖;
圖6為華中五味子提取物對APAP誘導小鼠急性肝損傷的肝臟Nrf2下遊靶基因mRNA表達的影響結果圖。
[0023]其中A為空白對照組,B為華中五味子提取物組,C為APAP組,D為APAP/NAC組,E為APAP/華中五味子提取物組。
【具體實施方式】
[0024]下面結合具體實施例對本發明作進一步的解釋說明,但具體實施例並不對本發明作任何限定。除非特別說明,實施例中所涉及的試劑、方法均為本領域常用的試劑和方法。
[0025]實施例1華中五味子提取物指紋圖譜的建立
採用高相液相色譜法建立華中五味子提取物的化學指紋圖譜,並對主要成分進行含量測定,用於下文動物試驗計算華中五味子的給藥劑量。
[0026](1)華中五味子提取物的製備:
取華中五味子100 g,加8倍量水煎煮1 h,濾過,棄去濾液,藥渣烘乾後粉碎,用8倍量70%乙醇回流提取2次,每次1.5 h,濾過,合併濾液,濃縮,即得華中五味子提取物浸膏。
[0027](2)指 紋圖譜分析樣本的製備:
取華中五味子提取物浸膏0.5 g,精密稱定,用乙醇溶解,超聲60min,加乙醇定容至10ml,經0.22 Mm微孔濾膜過濾,濾液用於指紋圖譜的分析。
[0028](3)色譜條件:
SHIMADZU高相液相色譜儀,包括LC-20AD 二元高壓泵,SIL-20A自動進樣器,CT0-20A柱溫箱,Sro-M20A 二極體陣列檢測器,D⑶-20A3脫氣機,CBM-20A控制器,LCsolution工作站。Hypersil BDS C18色譜柱(150 mm X 4.6 mm 1.d., 5 Mm);流動相:水(A)_ 乙腈(B);梯度洗脫程序:40 ~50% B (0 ~10 min),50% B (10 ~20 min),50 ~80% B (20 ~40min), 80 ~90% B (40 ~41 min), 90 ~100% B (41 ~50 min), 100 ~40% B (50 ~51min), 40% B (51 ~60 min);柱溫:35 V ;流速:1 ml/min ;檢測波長:230 nm ;進樣量:5μ?。
[0029]從圖1可以看出,華中五味子提取物中主要成分為五味子酯甲和五味子甲素,質量分數均大於2.5% (依次為2.6%, 2.9%),其他木脂素成分如五味子醇甲、五味子醇乙、五味子乙素、五味子丙素等含量低,質量分數均小於0.1%(依次為0.06%, 0.07%, 0.07%, 0.09%)。
[0030]實施例2華中五味子提取物治療撲熱息痛所致肝損傷的試驗
(1)動物模型
雄性C57BL/6小鼠,6-8周齡,有中山大學實驗動物中心提供(動物合格證號SCXK(粵)2011-0029)。在標準實驗條件下飼養:溫度(23±2 V ),溼度(55±10%),12小時光照-12小時黑暗循環,自由攝取水和食物。小鼠隨機分成5組,分別為空白對照組(生理鹽水),華中五味子提取物組(以五味子酯甲計,9.2 mg/kg, p.0.), APAP組(400 mg/kg,
1.p.), APAP與華中五味子提取物合用組(APAP預處理,4 h後給予含9.2 mg/kg五味子酯甲的華中五味子提取物,Ρ.ο.),APAP與NAC合用組(APAP預處理,4 h後給予200 mg/kgNAC, p.0.)。小鼠分別於華中五味子提取物給予後12、24 h處死;採集的血液進行血液生化指標分析,採集的肝臟進行組織病理學檢查及分子機制研究。
[0031](2)血清ALT、AST酶活性的測定
按照ALT及AST檢測試劑盒說明操作,採用Beckman CX5全自動生化分析儀測定血清ALT、AST酶活性。結果如圖2所示。
[0032](3)肝臟組織學分析
肝組織依次經過10%中性福爾馬中林固定、組織修切、石蠟包埋、常規切片、HE染色、乙醇剃度脫水、透明、封片進行光學顯微鏡觀察肝細胞的壞死情況。結果如圖3所示。
[0033]從圖2和圖3可以看出,APAP建模16 h後(即華中五味子提取物給予12 h),相比於空白對照組,APAP組小鼠血清ALT、AST酶活性顯著升高;相比於APAP組,華中五味子提取物治療給藥組的小鼠血清ALT、AST酶活性的顯著下降。此外,華中五味子提取物給予24h後,APAP組小鼠肝小葉中央靜脈周圍出現大面積的肝細胞壞死,APAP/NAC組肝臟壞死灶內有較多的出血灶,而APAP/華中五味子提取物組小鼠肝小葉中央靜脈區域肝細胞損傷程度明顯減輕。以上結果提示了華中五味子提取物對APAP所致小鼠肝損傷具有確切的治療作用。
[0034](4)肝臟線粒體中GSH的測定
肝組織用4 °C預冷的生理鹽水洗滌,加入肝重9倍量的生理鹽水並在玻璃勻漿器內研磨,於4 °C >2500 rpm離心10 min;取上清液,於4 °C > 10000 rpm離心15 min,棄上清液,所得沉澱即為純化的線粒體。加入0.2 ml預冷的生理鹽水,超聲破碎30 s,於4 °C、4000rpm離心10 min。按照GSH檢測試劑盒說明書操作步驟,取上清液用酶標儀檢測405 nm處的吸收度值。結果如圖4所示。
[0035]從圖4可以看出,華中五味子提取物可明顯增加肝臟線粒體內GSH含量,抑制APAP所致GSH耗竭。`
[0036](5)qRT_PCR 檢測
按照Trizol試劑的說明書抽提小鼠肝臟總RNA,按照RT試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA,按照qRT-PCR試劑盒說明書檢測特定基因的mRNA表達量。實驗涉及的引物序列如表1所述。
[0037]表1.引物序列
【權利要求】
1.華中五味子提取物在製備治療撲熱息痛所致肝損傷藥物中的應用,其特徵在於,所述華中五味子提取物中五味子酯甲和五味子甲素的質量分數均不少於2.5%。
2.根據權利要求1所述應用,其特徵在於,所述華中五味子提取物的製備方法為:取華中五味子100 g加8倍量水煎煮1 h,過濾去除濾液,藥渣烘乾後粉碎,用8倍量70%乙醇回流提取2次,每次1.5 h,過濾,合併濾液,濃縮,即得華中五味子提取物浸膏。
3.根據權利要求1所述的應用,其特徵在於,所述的治療撲熱息痛所致肝損傷的機制涉及激活Nrf2-ARE信號通路,表現為上調Nrf2的mRNA表達、促進Nrf2核轉位、啟動下遊藥物代謝酶及抗氧化相關基因的轉錄,從而減輕肝細胞壞死。
4.根據權利要求1所述應用,其特徵在於,所述藥物還包括藥物載體。
5.根據權利要求4所述應用,其特徵在於,所述藥物載體為填充劑、黏合劑、溼潤劑、崩解劑、潤滑劑、矯味劑或防腐劑中的一種或多種。
6.根據權利要求5所述應用,其特徵在於,所述填充劑為澱粉、糊精、糖粉、甘露醇、乳糖或磷酸氫鈣;所述黏合劑為纖維素衍生物、明膠、澱粉漿或聚維酮。
7.根據權利要求5所述應用,其特徵在於,所述溼潤劑為水或乙醇;崩解劑為乾燥澱粉、羧甲基澱粉鈉、碳酸鈣或碳酸氫鈉。
8.根據權利要求5所述 應用,其特徵在於,所述潤滑劑為滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、聚乙二醇或十二烷基硫酸鎂;所述矯味劑為糖精鈉、蔗糖或甜蜜素;所述防腐劑為苯甲酸、山梨酸或尼泊金。
9.根據權利要求1-8中任一項所述應用,其特徵在於,所述藥物的劑型包括膠囊劑、顆粒劑、片劑、散劑、溶液劑、乳劑、混懸劑。
10.根據權利要求1-8中任一項所述應用,其特徵在於,所述藥物的劑型包括緩釋劑或控釋劑。
【文檔編號】A61P1/16GK103638109SQ201310692090
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月12日 優先權日:2013年12月12日
【發明者】畢惠嫦, 黃民, 範曉梅, 姜伊鳴, 王瑩, 陳攀 申請人:中山大學