肝功能改善劑的製作方法
2023-05-02 22:26:26 1
專利名稱：肝功能改善劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種含有乳鐵蛋白作為有效成分的肝功能改善劑。更具體地說，本發明涉及含有金屬非飽和乳鐵蛋白、金屬飽和乳鐵蛋白或阿樸乳鐵蛋白(下文將這些化合物統稱為乳鐵蛋白類)和/或乳鐵蛋白類的水解產物作為有效成分的肝功能改善劑。
背景技術：
有各種不同的原因會導致肝功能降低，在某些情況下還可能導致死亡。肝功能的檢查通常是通過測定血漿中下述各種項目來實施，這些項目包括穀草轉氨酶(glutamate oxaloacetate transaminase，下文簡稱為GOT)、谷丙轉氨酶(glutamate pyruvate transaminase，下文簡稱為GPT)、鹼性磷酸酶(下文簡稱為ALP)、總膽紅素、白蛋白、總膽固醇。過去，作為針對肝功能低下的治療藥劑，只不過是使用小柴胡湯、Stronger Neo-Minophagen C(下文簡稱SNMC)、熊去氧膽酸等。在這些治療藥劑中，每一種藥劑的有效性都較低，並有腹瀉、噁心、嘔吐等副作用，難以維持長期用藥。
直至最近，作為肝病治療劑，已知的有高支鏈胺基酸製劑(渡邊明治、衝田美佐子著《肝病與治療營養》，第一版，1992年)、低聚半乳糖與食物纖維(特開平3-151854號公報)、乳果糖及乳糖醇(日本臨床，第52卷，第1期，第100～118頁，1994年；臨床醫藥，第11卷，第7期，第1439～1473頁，1995年)、棉子糖(特開平10-179087號公報)、應力蛋白質(Stress protein)的抗體(特許第2775576號)等。
另一方面，乳鐵蛋白是一種在淚液、唾液、末梢血、乳汁等中含有的無害而且是天然的鐵結合蛋白質(每一分子可以結合兩個鐵離子)，其中，牛乳鐵蛋白的分子量為86,000，人乳鐵蛋白的分子量為88,000(今堀和友、山川民夫監編，《生化學辭典》，第2版，第1390頁，東京化學同人，1990年)。
已知乳鐵蛋白對大腸菌、念珠菌屬、梭菌屬等的有害微生物具有抗菌作用[兒科學雜誌(Journal of Pediatrics)，第94卷，第1頁，1997年]。另外還已知，乳鐵蛋白能有效地使乾燥雙叉乳桿菌、乳酸菌等有用細菌定居於人和動物的腸內(特許第2532911號)，並且它是乾燥雙叉乳桿菌的增殖因子(特開平2-225419號公報)。另外，文獻還公開了乳鐵蛋白具有如下所述各種各樣的用途。
(1)抗菌劑、抗病毒劑、抗寄生蟲劑特開昭61-83131號公報、特開昭62-249931號公報、特開昭63-56273號公報、特開昭63-284133號公報、特開平1-44273號公報、特開平1-221319號公報、特開平1-233226號公報、特開平2-48534號公報、特開平2-191205號公報、特開平2-233619號公報、特開平3-181421號公報、特開平3-193708號公報、特開平3-220130號公報、特開平6-48956號公報、特開平6-199698號公報、特開平6-256211號公報、特開平6-316529號公報、特開平7-206701號公報、特開平7-316069號公報、特開平9-2970號公報、特開平9-40578號公報、特開平9-165342號公報和特開平10-59865號公報。
(2)造血劑特開昭62-125398號公報、特開昭63-22525號公報、特開平2-6408號公報、特開平3-130060號公報、特開平4-8269號公報、特開平4-141067號公報和特開平4-95100號公報。
(3)皮膚、外用劑特開平1-135726號公報、特開平7-196529號公報、特開平8-59450號公報、特開平8-231462號公報和特開平8-333260號公報。
(4)口腔、牙科劑特開平5-279266號公報、特表平8-506098號公報和特開平8-217693號公報。
(5)眼科用劑WO 92/08477號公報、特開平8-301785號公報和特開平9-30966號公報。
(6)免疫賦活劑、免疫促進劑特開平5-178759號公報、特開平6-32743號公報、特開平6-145068號公報和特表平7-507763號公報。
除此之外，已知的還有抗腫瘤劑(特開昭63-51337號公報)、胃腸管生長促進劑(特開平1-93534號公報)、細菌毒素中和劑(特開平2-207089號公報和特表平5-501416號公報)、抗衰老劑(特開平4-58871號公報和特開平5-124980號公報)、降壓劑(特開平4-316598號公報)、抗風溼病藥(特開平5-186368號公報)、神經生長因子產生促進劑(特開平5-32557號公報)、消化管細胞賦活化劑(特開平6-48955號公報)、腦保健藥(特開平6-172200號公報)、動脈硬化預防劑(特開平6-234655號公報)、粘蛋白產生促進劑(特開平9-12473號公報)、血管新生病治療藥(特開平9-194388號公報)、抗異常腺窩劑(特開平10-25249號公報)、經口癌轉移抑制劑(特開平10-59864號公報)、內毒素誘發性疾病治療藥(特開平10-114675號公報)、胃腸障礙預防和/或治療藥(特開平10-130164號公報)等。
然而，乳鐵蛋白對肝功能的改善有效這一事過去並未被人們所知，在文獻上也沒有記載。
發明內容
本發明的目的是提供一種幾乎沒有副作用的肝功能改善劑。
本發明是一種含有乳鐵蛋白和/或乳鐵蛋白的水解產物作為有效成分的肝功能改善劑。
本發明的肝功能改善劑的優選方案是其中的乳鐵蛋白是選自金屬非飽和乳鐵蛋白、金屬飽和乳鐵蛋白和阿樸乳鐵蛋白中的1種或2種以上的混合物。
本發明者們對迄今為止尚未被人們所知的乳鐵蛋白的新用途進行了深入的研究，在研究的過程中發現，通過投與乳鐵蛋白，可以使已降低了的肝功能獲得改善。本發明者們對這一結果進行了動物實驗，以科學的方法證明了乳鐵蛋白能有效地改善肝功能，至此便完成了本發明。
本發明的肝功能改善劑是一種能夠顯著改善肝功能的藥物，作為其有效成分的乳鐵蛋白存在於牛奶等食物中，是一種被人們日常攝取的蛋白質或其水解產物，因此即使長期連續攝取也幾乎沒有副作用。另外，本發明的肝功能改善劑通過與其他肝病治療藥(例如幹擾素、SNMC等)合併使用，還可以減少這些治療藥的投藥量。
用於實施發明的最佳方案作為本發明的有效成分使用的乳鐵蛋白可以是市售品，也可以是按下述方法獲得的製品，例如，用離子交換色譜法等常規方法從哺乳類(例如人、牛、水牛、馬、山羊、綿羊等)的初乳、過渡期乳、常乳、末期乳等、這些處理物的脫脂乳、乳清等乳品中分離獲得的乳鐵蛋白、按常規方法從乳鐵蛋白中除去鐵後的阿樸乳鐵蛋白、將阿樸乳鐵蛋白中的鐵、銅、鋅、錳等金屬元素螯合一部分或全部後獲得的金屬非飽和乳鐵蛋白或金屬飽和乳鐵蛋白。
雖然不能大量地製造天然的人乳鐵蛋白，但是利用按DNA重組技術獲得的重組真菌、重組乳牛(轉基因牛)等來生產的人乳鐵蛋白也適用於本發明。
作為本發明有效成分使用的乳鐵蛋白類的水解產物可以通過將上述乳鐵蛋白類用酸或酶促使其進行水解反應來製造。具體的方法如下。
利用酸的水解方法是，首先將乳鐵蛋白類按0.1～20％(如無特別註明，皆是指重量％)，優選5～15％的濃度溶解於水、蒸餾水等中，向所獲的溶液中添加酸(例如鹽酸、磷酸等無機酸，檸檬酸等有機酸)，將溶液的pH值調節至1～4，然後在預定溫度下保持預定的時間以使其進行水解反應。更具體地說，在pH調節至1～2的情況下，在80～130℃，優選在90～120℃的溫度下保持1～120分鐘，另外，在pH調節至2～4的情況下，在80～130℃，優選在100～120℃的溫度下保持1～120分鐘，以使其進行水解反應。然後將反應液冷卻，也可以根據需要，對其進行中和、脫鹽和脫色處理。
利用酶的水解方法是，將乳鐵蛋白類按0.5～20％，優選5～15％的濃度溶解於無菌水、蒸餾水等中，將該水溶液的酸度調節至適合於水解用的酶起作用的pH值，然後向其中添加酶，將溫度保持在適合於酶起作用的溫度以進行水解反應。對所用的酶沒有特別限制，可以直接使用市售品，例如耐酸性蛋白酶(商標，盛進位藥社制，適宜pH2.5～3.0)、豬胃蛋白酶(和光純藥工業社制，適宜pH2～3)、SMITIMAP(商標，新日本化學社制，適宜pH3.0)、AMANOM(商標，天野製藥社制，適宜pH7.0)、胰蛋白酶(NOBO社制，適宜pH8.0)等內肽酶，可以將它們單獨使用或按任意組合使用。
另外，也可以將這些酶與從例如按特公昭48-43878號公報記載的方法製得的乳酸菌中提取的外肽酶或含有肽酶的市售松木油酶(田邊製藥社制)組合使用。這些酶相對於基質的使用量在0.1～5.0％的範圍內，特別優選在0.5～30％的範圍內。
利用酶的水解反應在15～55℃，優選在30～50℃的溫度下進行，保持時間為30～600分鐘，優選60～300分鐘。然後將該反應液直接地或者在將其中和後，按常規方法將酶加熱失活，根據需要進行脫色處理，從而獲得水解產物。
以上述乳鐵蛋白和/或其水解產物作為有效成分的本發明的肝功能改善劑可以用公知的方法製成各種形式的製劑，作為經口的藥物。作為具體的劑型，可以舉出片劑(包括糖衣片、包衣片、含片)、散劑、膠囊劑(包括軟膠囊)、顆粒劑(包括帶包衣的顆粒)、丸劑、錠劑、液劑或者它們在製劑學上允許的緩釋製劑等。
上述的製劑可以按公知的製劑學的製法與藥理學上允許用於製劑的載體、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑等一起作為醫藥組合物製成製劑。作為適用於這些製劑中的載體及賦形劑，可以作為例子舉出乳糖、葡萄糖、白糖、甘露糖醇、馬鈴薯澱粉、玉米澱粉、碳酸鈣、磷酸鈣、硫酸鈣、結晶纖維素、甘草粉、龍膽粉等。作為粘合劑，可以作為例子舉出澱粉、明膠、糖漿、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯基吡咯烷酮、羥丙基纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素等。
作為崩解劑，可以作為例子舉出澱粉、瓊脂、明膠粉、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣、結晶纖維素、碳酸鈣、碳酸氫鈉、藻酸鈉等。
作為潤滑劑，可以作為例子舉出硬脂酸鎂、加氫植物油、聚乙二醇等。作為著色劑，例如有允許向醫藥品中添加的紅色2號、黃色2號、藍色1號等。
片劑和顆粒劑可以根據需要使用下述物質進行包衣白糖、羥丙基纖維素、精製蟲膠、明膠、山梨糖醇、甘油、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、苯二甲酸纖維素乙酸酯、羥丙基甲基纖維素苯二甲酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸聚合物等。
本發明的肝功能改善劑在每1g藥劑中至少含有1mg作為有效成分的乳鐵蛋白或其分解物，投藥量應根據年齡、症狀等的不同而異，但是對於人，應按每1Kg體重至少1mg的比例經口投藥，優選按每天20mg～15g的用量投藥。
另外，本發明的肝功能改善劑由於其有效成分來自乳類，因此其安全性好，並且通過與其他肝病治療藥例如幹擾素，SNMC等合用而能減少這些藥物的服用量，並能期望獲得改善肝功能的協同效果。
下面舉出試驗體來詳細地說明本發明。
試驗例1該試驗例的目的是調查乳鐵蛋白及其水解產物的肝功能改善效果。
1．試驗動物和試驗樣品1.1 動物將30隻體重約200g的Wistar系雄性大鼠(從日本チャ-ルスリバ-購得)隨機地分成5組，每組6隻，讓其自由採食固體飼料(船橋農場制)和水，如此飼養一周時間。
1.2 試驗樣品的製備作為乳鐵蛋白，直接使用市售品(森永乳業社制)；作為乳鐵蛋白的水解產物，使用按照與參考例1同樣的方法製得的產物。
2．試驗方法2.1 對照組從上述5組大鼠中隨機地選擇一組，根據玉田等人的方法(《肝臟》，第28卷，第7期，第39頁，1987年)按如下步驟製備出慢性肝障礙模型大鼠。將四氯化碳(和光純藥工業社制)按50％的濃度溶解於橄欖油(日本藥典)中，將此溶液按每1Kg動物體重1.0ml溶液(四氯化碳佔0.5ml)的比例每周進行2次皮下注射，連續進行9周的試驗。
2.2 試驗組以其餘4組大鼠作為對照組，對其進行同樣的處理，但是從開始投與四氯化碳溶液後的第6周開始，按表1所示的投藥量(500mg/Kg/天或250mg/Kg/天)向大鼠經口投與乳鐵蛋白或其水解產物溶解於蒸餾水中製得的溶液，在3周內連續每天投藥。
2.3 肝功能試驗在結束投與試驗樣品4天之後，在乙醚麻醉下從腹部大靜脈採血，用自動化學分析裝置(東芝MEDICAL社制，TBA-380)測定血清中的GOT、GPT和ALP，求出各組的平均值。
3．試驗結果表1中示出了乳鐵蛋白對四氯化碳誘發慢性肝障礙模型的效果。與對照組相比，乳鐵蛋白投與組的GOT、GPT和ALP顯示出低的數值，因此可以認為它具有高的肝功能改善效果。另外，乳鐵蛋白水解產物的效果雖然比乳鐵蛋白略差，但仍可以看出明顯的肝功能改善效果。
另外，還通過改變乳鐵蛋白及其水解產物的種類進行了試驗，結果獲得了幾乎相同的結果。
表1
(注)LF表示乳鐵蛋白。
試驗例2
該試驗的目的是調查乳鐵蛋白及其水解產物對急性肝障礙的治療效果。
1．試驗動物及試驗樣品使用與試驗例1同樣的各組試驗動物和試驗樣品。
2．試驗方法將四氯化碳(和光純藥工業社制)按20％(體積)的比例溶解於橄欖油(日本藥典)中，將此溶液按每1Kg動物體重1.5ml溶液(四氯化碳佔0.3ml)的比例一次注射入大鼠的腹腔內，然後，在投與四氯化碳之後第2天起連續5天每天按照表2所示用量(600mg/Kg/天或350mg/Kg/天)的乳鐵蛋白或其水解產物向大鼠經口投藥，除此之外，其餘按照與試驗例1同樣的方法進行試驗。
3．試驗結果表2示出了乳鐵蛋白及其水解產物對四氯化碳誘發的急性肝障礙模型所起的效果。與對照組相比，乳鐵蛋白投與組的GOT、GPT和ALP顯示出低的數值，因此可以認為它具有高的肝功能改善效果。另外還可看出，乳鐵蛋白水解產物的效果也幾乎與乳鐵蛋白相同。
另外，還通過改變乳鐵蛋白及其水解產物的種類進行了試驗，獲得了幾乎相同的結果。
表2
(注)LF表示乳鐵蛋白。
參考例1按照特許第2130919號的公告公報(特公平6-13560號)記載的如下方法由人乳製造人乳鐵蛋白。
將CM-交聯葡聚糖凝膠-50(Pharmacia社制)10g用水浸泡以使其溶脹，如此配製成Na型離子交換體200ml，將其與脫脂人乳(pH6.7)10升混合，在4℃下攪拌16小時，然後將其過濾以分離出離子交換體。用1.6％的氯化鈉溶液2升洗滌分離出的離子交換體以除去其中的雜質，然後添加5.0％的氯化鈉溶液1升洗脫被離子交換體吸附的成分，獲得回收液1.1升。
將所獲的回收液進行透析以除去其中的氯化鈉，凍結乾燥，獲得了人乳鐵蛋白粉末約12g。所獲的人乳鐵蛋白的組成為水分2.8％、乳鐵蛋白96.3％、灰分0.5％。
參考例2將市售的牛乳鐵蛋白(森永乳業社制)500g溶解於蒸餾水9升中，用0.1當量的鹽酸將其pH值調節至2.5，向其中添加市售的豬胃蛋白酶(Sigma社制)10g，在37℃下進行水解反應6小時。然後用0.1當量的氫氧化鈉水溶液將其pH調節至7.0，在75℃下加熱處理10分鐘以使酶失活，然後將其冷卻至室溫，按15,000rpm的轉速離心分離30分鐘，將所獲的上清液按常規方法進行凍結乾燥，獲得了牛乳鐵蛋白水解產物420g。
下面示出實施例以更詳細地說明本發明，但本發明不受以下實施例的限定。
實施例1配合有牛乳鐵蛋白的片劑的製備按照下述方法製造具有下述組成的片劑形式的肝功能改善劑。
成分 含量(％)牛乳鐵蛋白(森永乳業社制) 18.0乳糖(森永乳業社制) 18.5玉米澱粉(日清制粉社制) 52.7硬脂酸鎂(太平化學產業社制) 1.4羧甲基纖維素鈣(五德藥品社制) 9.4向牛乳鐵蛋白、乳糖、玉米澱粉和羧甲基纖維素鈣的混合物中一邊添加適量水，一邊混煉均勻，在50℃下乾燥3小時，然後向所獲的乾燥物中添加硬脂酸鎂，混合均勻，按常規方法壓片，獲得所需的片劑。
實施例2配合有牛乳鐵蛋白的糖漿劑的製備成分 含量(％)牛乳鐵蛋白(MIRAI社制) 8.0果糖葡萄糖糖漿(參松工業社制)12.4檸檬酸(上野製藥社制)0.2檸檬酸鈉(丸善製藥社制) 0.2羧甲基纖維素鈣(五德藥品社制)0.2蒸餾水(大塚製藥社制)79.0將各成分混合，按常規方法製造糖漿劑。
實施例3牛乳鐵蛋白膠囊劑的製備將乳糖(和光純藥工業社制)600g、玉米澱粉(日清制粉社制)400g、結晶纖維素(和光純藥工業社制)400g和牛乳鐵蛋白(MIRAI社制)600g用50目的篩子(大和科學社制)過篩，將篩下物裝入一個厚度0.5mm的聚乙烯袋中，將袋子來回翻轉以使物料混合均勻，用一臺全自動膠囊填充機(Cesere Pedini公司制，加壓式)將上述粉末按每個膠囊275mg內容物的比例填充入膠囊(日本ELANCO社制，1號膠囊，殼體顏色OP.黃6號，空殼重75mg)中，獲得了每個膠囊含乳鐵蛋白82mg的膠囊劑7,000個。
實施例4人乳鐵蛋白散劑的製備把預先通過了6號篩(井內盛榮堂社制)的人乳鐵蛋白粉末(按照與參考例1相同的方法製造)10g和乳糖(森永乳業社制)50g在乳罐中混勻，然後向其中加入預先通過了5號篩(井內盛榮堂社制)的乳糖(森永乳業社制)40g，混合均勻，將其全量再次通過5號篩，用分包機(東京商會，OMP-90A)按照每包5g的比例分裝，獲得了10％人乳鐵蛋白散劑20包。
實施例5配合有牛乳鐵蛋白水解產物的片劑的製備成分 含量(％)牛乳鐵蛋白水解產物 16.5(按照與參考例2相同的方法製造)
乳糖(森永乳業社制) 18.5馬鈴薯澱粉(關東化學社制)54.2硬脂酸鎂(日本油脂社制) 1.4羧甲基纖維素鈣(五德藥品社制)9.4向牛乳鐵蛋白、乳糖、馬鈴薯澱粉和羧甲基纖維素鈣的混合物中一邊添加適量滅菌蒸餾水，一邊混煉均勻，在55℃下乾燥2小時，向所獲的乾燥物中添加硬脂酸鎂，混合均勻，按常規方法壓片，獲得了片劑。
實施例6配合有牛乳鐵蛋白水解產物的糖漿劑的製備成分 含量(％)牛乳鐵蛋白水解產物6.5(按照與參考例2相同的方法製造)果糖葡萄糖糖漿(參松工業社制) 14.0檸檬酸(田邊製藥社制) 0.2檸檬酸鈉(巖城製藥社制)0.2羧甲基纖維素鈣(五德藥品社制) 0.2蒸餾水(扶桑藥品工業社制) 78.9將各成分混合均勻，按常規方法製成糖漿劑。
工業實用性本發明的肝功能改善劑可作為用於改善肝功能障礙患者的肝功能的藥劑使用。另外，通過將本發明的肝功能改善劑與幹擾素、SNMC等肝病治療劑並用，可以減少這些治療劑的投藥量。
權利要求
1．一種肝功能改善劑，它含有乳鐵蛋白和/或乳鐵蛋白的水解產物作為有效成分。
2．如權利要求1所述的肝功能改善劑，其中所說的乳鐵蛋白是選自金屬非飽和乳鐵蛋白、金屬飽和乳鐵蛋白和阿樸乳鐵蛋白中的1種或2種以上的混合物。
全文摘要
含有乳鐵蛋白和/或其水解產物作為有效成分的沒有副作用的肝功能改善劑。
文檔編號A61K38/40GK1316909SQ99810639
公開日2001年10月10日 申請日期1999年7月27日 優先權日1998年7月30日
發明者富田守, 島村誠一, 樋田知宏 申請人:森永乳業株式會社