一種檢測生物膜纖維素酶活性的分析方法

2023-05-02 21:36:01 1

專利名稱：一種檢測生物膜纖維素酶活性的分析方法
技術領域：
本發明涉及纖維素酶活性的測定，具體地說是一種檢測生物膜纖維素酶活性的分 析方法。
背景技術：
生物膜法作為處理廢水的方法已經發展得相當成熟，並得到廣泛的應用。這種方 法是依靠微生物產生的酶來催化降解汙染物的，使水質達到淨化的效果。在工業廢水處理 過程中，微生物產生的纖維素酶直接關係到廢水中纖維素、半纖維素、木素等大分子有機物 的降解速率，纖維素酶活性成為評價處理設施運行效果的一個重要參數，因此，建立一種相 對快速準確的生物膜纖維素酶活性的檢測方法具有很重要的意義。有關纖維素酶活性的測定基本都是參照T. K. GHOSE在1987年發表的Measurement of cellulase activities中的方法。文中測定總酶活性採用的底物是濾紙，濾紙本身 不易在溶液中分散，該法測定結果的可靠性受幾個因素的影響，例如單位面積尺寸(每條 l*6cm)的底物重量的變化、濾紙的切割方式等，人為很難保證每次操作的一致性，影響實驗 的對比性。更為關鍵的是，該法主要是針對纖維素酶製劑的活性測定，沒有提到其他生物樣 品的預處理方法。因此，很多研究都對其進行改良。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的缺陷，提供一種檢驗生物膜中纖維素酶活性的 分析方法。該方法是在借鑑前人測定方法的原理基礎上，提出生物膜樣品的預處理方法，並 對纖維素酶活性的測定步驟進行了改進，使得反應時間更短，分析結果更加準確可靠。本發明目的通過技術方案為一種檢測生物膜纖維素酶活性的分析方法，包括以下步驟(1)以已知濃度的葡萄糖溶液為標準溶液，用分光光度計檢測其吸光度，以葡萄糖 濃度C和吸光度值A製作標準曲線，並得到關係式A = a · C+b ；(2)將完成培養的生物膜，破碎後得到菌懸液，測得MLSS，MLSS為菌懸液的生物膜 濃度，單位:g/ml ；(3)將菌懸液離心，取1. Oml上清液於25ml比色管，並加入1. Oml磷酸緩衝液和 10. Omg底物微晶纖維素，在50°C反應30分鐘後，立即加入DNS試劑，沸水浴中加熱5min，取 出並定容至25ml，測定其吸光度，同樣的方法做空白實驗；(4)根據關係式A = a *C+b，計算所測酶液的葡萄糖濃度C和空白實驗的葡萄糖濃 度Ctl，C= (A-b)/a,C0= (AtTb)/a，再計算出樣品的纖維素酶活性，計算公式為x = (C-C0)/ (MLSS · Τ)，式中X為纖維素酶活性，單位mg葡萄糖· g—1 · h—1 ；C和Ctl為葡萄糖濃度，單 位mg/ml ；MLSS為步驟(2)得到的菌懸液的生物膜濃度，T為反應時間，單位h。所述MLSS的測定方法是取菌懸液的IOOml過濾後，在103 105°C將濾紙烘乾、冷 卻並稱重，重量為Hi1,則MLSS = (Hi1-Hici)A). 1，單位是g/ml，m0為過濾前乾燥至恆重的濾紙
3重量。所述破碎是用超聲波細胞破碎儀，頻率為20KC，破碎5 10分鐘。所述標準曲線的製作過程如下，①配製5mg/mL葡萄糖標準儲備液；②用葡萄糖標 準儲備液配製濃度為0,0. 10,0. 20,0. 30,0. 40,0. 60,0. 80mg/ml的葡萄糖標準溶液，需當 日配製；③往1. Oml此系列標準溶液中加入1. Oml磷酸緩衝液和3. Oml DNS試劑，置於沸水 浴中加熱5min，取出並定容至25ml，搖勻，用分光光度計測定其吸光度，波長為520nm，此系 列標準溶液含有葡萄糖0,0. 10,0. 20,0. 30,0. 40,0. 60,0. 80mg ；④根據已知的葡萄糖濃度 和測得的吸光度值得到標準曲線。所述離心是將剩餘的菌懸液在4000r/min下離心20min。所述DNS試劑是將10. 6g 3，5_ 二硝基水楊酸和19. 8g NaOH溶解於1416ml蒸餾 水中，再加306g酒石酸鉀鈉、7. 6ml苯酚和8. 3g偏亞硫酸氫鈉，貯存於棕色試劑瓶中，於暗 處放置7d後使用。本發明方法改進的依據酶活性均是用底物的減少量和產物的生成量進行表徵，傳統的FPA法是使用濾紙 作為測定底物，反應後的產物葡萄糖顯色，通過分光光度計測出其吸光度。此方法所需反應 時間(l.Oh)長，底物本身不易在溶液中分散，測定結果的可靠性受幾個因素的影響，例如 單位面積尺寸(每條l*6cm)的底物重量的變化、濾紙的切割方式等，人為很難保證每次操 作的一致性，影響實驗的對比性。而本改進方法是使用微晶纖維素作為測定底物，跟濾紙相 比，反應時間(30min)縮短，底物可以迅速分散在溶液中，具有更強的底物專一性，而且從 纖維素酶作用的可及性和聚合度方面考慮，它的特性更加接近於那些預處理過的木質纖維 素，因此，以微晶纖維素作為底物的測定方法更能準確地反映纖維素酶複合體系水解木質 纖維素的能力。傳統的方法主要是針對纖維素酶製劑的活性測定，沒有提到其他生物樣品的預處 理方法。本發明提出生物膜樣品的預處理方法，纖維素酶由胞內酶和胞外酶組成，它們都參 與纖維素的分解轉化過程，通過超聲波細胞破碎將胞內酶釋放到溶液中，再通過離心取得 上清液，測定其酶活。傳統方法是取0. 5ml經過稀釋的酶液進行測定，相比於酶製劑，生物 膜(或者微生物)直接產生的酶活較小，一般不需要稀釋，因此，本改進方法是取1.0ml不 經稀釋的酶液來測定，計算酶活時不存在稀釋倍數和酶液體積的問題，簡化了計算過程。相對於現有技術，本發明的優點主要有1)與傳統的以濾紙作為底物的FPA測定方法相比，以微晶纖維素作為底物的測定 方法更能準確地反映纖維素酶複合體系水解木質纖維素的能力；2)縮短了反應時間；3)方法簡單，易操作，簡化了計算過程。
具體實施例方式試劑配製1. 0. lmol/L pH6. 0的磷酸緩衝液分別稱取一水磷酸二氫鈉121. Og和二水磷酸 氫二鈉21. 89g，將其溶解在IOL去離子水中。調節溶液的pH到(6.0士0.05)備用。溶液在
室溫下可保存一個月。
4
2. DNS試劑將10. 6g 3，5_ 二硝基水楊酸和19. 8g NaOH溶解於1416ml蒸餾水中， 再加306g酒石酸鉀鈉、7. 6ml苯酚(熔於50°C )、8. 3g偏亞硫酸氫鈉，貯存於棕色試劑瓶中， 於暗處放置7d後使用。3、所述標準曲線的製作過程如下，①配製5mg/mL葡萄糖標準儲備液；②用葡萄糖 標準儲備液配製濃度為0,0. 10,0. 20,0. 30,0. 40,0. 60,0. 80mg/ml的葡萄糖標準溶液，需 當日配製；③往1. Oml此系列標準溶液中加入1. Oml磷酸緩衝液和3. Oml DNS試劑，置於沸 水浴中加熱5min，取出並定容至25ml，搖勻，用分光光度計測定其吸光度，波長為520nm，此 系列標準溶液含有葡萄糖0,0. 10,0. 20,0. 30,0. 40,0. 60,0. 80mg ；④根據已知的葡萄糖濃 度和測得的吸光度值得到標準曲線A = O. 0347+0. 70118 · C。實施例1本實施例採用的樣品是在以纖維二糖為碳源的好氧生物反應器中培養96h的生 物膜，以微晶纖維素為底物，用上述方法檢測不同反應時間下的纖維素酶活性，驗證該方法 選取0. 5h作為反應時間是否合理。第1 步以已知濃度的葡萄糖溶液為標準溶液，用分光光度計檢測其吸光度，以 標準溶液的葡萄糖濃度C和測定的吸光度值A製作標準曲線，並得到關係式A =
0.0347+0.70118 · C；第2步取生物膜置於燒杯中，用超聲波細胞破碎儀進行破碎，頻率20KC，破碎5分鐘，取 其中的IOOml菌懸液用乾燥至恆重的濾紙(重量為mQ)過濾，放入103°C的烘箱中烘乾取出 在乾燥器中冷卻後稱重(重量為Hi1)，反覆乾燥至恆重，MLSS = (m「m0)/0· 1 = 0. 00146g/ ml ；第3 步將剩餘的菌懸液在4000r/min下離心20min，分別取1. Oml上清液置於4支25ml 比色管中，分別加入1.0ml磷酸緩衝液和10. Omg微晶纖維素，50°C條件下分別反應0. 5h、
1.OhU. 5h、2. Oh0反應結束後，立即3.0ml DNS試劑終止反應，放入沸水浴中加熱5min，取出定容， 搖勻，在520nm處測定其吸光度，同時做空白實驗(空白實驗不加底物微晶纖維素，其他步 驟不變)。第4 步根據關係式A = 0. 0347+0. 70118 · C，計算所測酶液的葡萄糖濃度C和空白實驗 的葡萄糖濃度Ctl，C0 = 0. 2015mg/ml，再根據葡萄糖濃度計算出樣品的纖維素酶活性，計算 公式為x = (C-C0) / (MLSS · Τ)，式中X為纖維素酶活性，單位mg葡萄糖· g—1 · IT1 ；C和C。 為葡萄糖濃度，單位mg/ml ；MLSS為步驟(2)獲得的菌懸液的生物膜濃度，單位g/ml ；T為 反應時間，單位h。計算出纖維素酶活性。實驗結果如下表 1 由表1不同反應時間下纖維素酶活性對比中數據可以看出，生物膜纖維素酶活性 隨著反應時間的延長是逐漸變小的，反應0. 5h的酶活性最大，因此，該方法選取0. 5h作為 反應時間是合理的。實施例2本實施例採用的樣品是在以纖維二糖為碳源的好養生物反應器中培養96h的生 物膜，分別以濾紙和微晶纖維素為底物，用對應的FPA法和上述方法檢測同一樣品的纖維 素酶活性。第1 步以已知濃度的葡萄糖溶液為標準溶液，用分光光度計檢測其吸光度，以 標準溶液的葡萄糖濃度C和測定的吸光度值A製作標準曲線，並得到關係式A = 0.0347+0. 70118 · C；第2 步取生物膜置於燒杯中，用超聲波細胞破碎儀進行破碎，頻率20KC，破碎10分鐘，取 其中的IOOml菌懸液用乾燥至恆重的濾紙(重量為mQ)過濾，放入105°C的烘箱中烘乾取出 在乾燥器中冷卻後稱重(重量為Hi1)，反覆乾燥至恆重，MLSS = (m「m0)/0· 1 = 0. 00146g/ ml ；第3 步將剩餘的菌懸液在4000r/min下離心20min，分別取1. Oml上清液置於2支25ml 比色管中，加入1. Oml磷酸緩衝液，其中1支比色管中加入濾紙，另1支加入10. Omg微晶纖 維素，50°C條件下，前者反應1. Oh,後者反應0. 5h。反應結束後，立即3.0ml DNS試劑終止反應，放入沸水浴中加熱5min，取出定容 25ml，搖勻，在520nm處測定其吸光度，同時做空白實驗(空白實驗不加底物，其他步驟不 變)。第4步根據關係式A = O. 0347+0. 70118 · C，計算所測酶液的葡萄糖濃度C和空白實驗 的葡萄糖濃度Ctl，C0 = 0. 2015mg/ml，再根據葡萄糖濃度計算出樣品的纖維素酶活性，計算 公式為x = (C-C0) / (MLSS · Τ)，式中X為纖維素酶活性，單位mg葡萄糖· g—1 · IT1 ；C和C。 為葡萄糖濃度，單位mg/ml ；MLSS為步驟(2)獲得的菌懸液的生物膜濃度，單位g/ml ；T為 反應時間，單位h。計算出纖維素酶活性。實驗結果如下表2 由表2不同測定底物下的纖維素酶活性對比中數據可以看出，同一個樣品，以微 晶纖維素為底物測定的結果比以濾紙為底物大得多，而且從纖維素酶作用的可及性和聚合 度方面考慮，微晶纖維素的特性更加接近於那些預處理過的木質纖維素，因此，以微晶纖維 素作為底物的測定方法更能準確地反映纖維素酶複合體系水解木質纖維素的能力。
權利要求
一種檢測生物膜纖維素酶活性的分析方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)以已知濃度的葡萄糖溶液為標準溶液，用分光光度計檢測其吸光度，以葡萄糖濃度C和吸光度值A製作標準曲線，並得到關係式A＝a·C+b；(2)將完成培養的生物膜，破碎後得到菌懸液，測得MLSS，MLSS為菌懸液的生物膜濃度，單位g/ml；(3)將菌懸液離心，取1.0ml上清液於25ml比色管，並加入1.0ml磷酸緩衝液和10.0mg底物微晶纖維素，在50℃反應30分鐘後，立即加入DNS試劑，沸水浴中加熱5min，取出並定容至25ml，測定其吸光度，同樣的方法做空白實驗；(4)根據關係式A＝a·C+b，計算所測酶液的葡萄糖濃度C和空白實驗的葡萄糖濃度C0，C＝(A b)/a，C0＝(A0 b)/a，再計算出樣品的纖維素酶活性，計算公式為x＝(C C0)/(MLSS·T)，式中x為纖維素酶活性，單位mg葡萄糖·g 1·h 1；C和C0為葡萄糖濃度，單位mg/ml；MLSS為步驟(2)得到的菌懸液的生物膜濃度，T為反應時間，單位h。
2.根據權利要求1所述的分析方法，其特徵在於，所述MLSS的測定方法是取菌懸液的 IOOml過濾後，在103 105°C將濾紙烘乾、冷卻並稱重，重量為Hi1，則MLSS = (In1-Iii0) /0. 1， 單位是g/ml，m0為過濾前乾燥至恆重的濾紙重量。
3.根據權利要求1所述的分析方法，其特徵在於，所述破碎是用超聲波細胞破碎儀，頻 率為20KC，破碎5 10分鐘。
4.根據權利要求1所述的分析方法，其特徵在於，所述標準曲線的製作過程如下，① 配製5mg/mL葡萄糖標準儲備液；②用葡萄糖標準儲備液配製濃度為0、0. 10,0. 20,0. 30、0.40,0. 60,0. 80mg/ml的葡萄糖標準溶液，需當日配製；③往1. Oml此系列標準溶液中加入1.Oml磷酸緩衝液和3. Oml DNS試劑，置於沸水浴中加熱5min，取出並定容至25ml，搖勻，用 分光光度計測定其吸光度，波長為520nm，此系列標準溶液含有葡萄糖0、0. 10,0. 20,0. 30、 0. 40,0. 60,0. SOmg ；④根據已知的葡萄糖濃度和測得的吸光度值得到標準曲線。
5.根據權利要求1-4之一所述的分析方法，其特徵在於，所述離心是將剩餘的菌懸液 在 4000r/min 下離心 20min。
6.根據權利要求1-4之一所述的分析方法，其特徵在於，所述DNS試劑是將10.6g3， 5- 二硝基水楊酸和19. 8g NaOH溶解於1416ml蒸餾水中，再加306g酒石酸鉀鈉、7. 6ml苯 酚和8. 3g偏亞硫酸氫鈉，貯存於棕色試劑瓶中，於暗處放置7d後使用。
全文摘要
本發明公開了一種生物膜纖維素酶活的分析方法。具體包括以下步驟(1)取適量完成培養的生物膜置於燒杯中，用超聲波細胞破碎儀進行破碎，頻率20KC，破碎5～10分鐘，取其中的100ml菌懸液測定MLSS；(2)將剩餘的菌懸液離心，取上清液，加入磷酸緩衝液和底物微晶纖維素，恆溫條件下反應30分鐘；(3)反應結束後，立即加入DNS試劑終止反應，放入沸水浴中加熱5min，取出定容，搖勻，用分光光度計測定吸光度，同時做空白實驗；(4)計算纖維素酶活性。本發明發法縮短了反應時間；方法簡單，易操作，簡化了計算過程。
文檔編號C12Q1/34GK101906463SQ20101022354
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月9日 優先權日2010年7月9日
發明者萬金泉, 王豔, 郭文杰, 馬邕文, 黃蓉姿 申請人:華南理工大學