腦膜炎球菌fHBP多肽的表達的製作方法

2023-07-06 00:55:41

專利名稱：腦膜炎球菌fHBP多肽的表達的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質表達領域，具體涉及奈瑟球菌H因子結合蛋白(fHBP)的表達。
背景技術：
腦膜炎奈瑟球菌是革蘭陰性的有莢膜細菌病原體。在開發對抗血清組B腦膜炎球菌的廣譜疫苗中一種感興趣的抗原是fHBP，也稱為蛋白質『741』 [I]、『NMB1870』、『GNA1870』 [2-4]、『P2086』、『LP2086』 或『0RF2086』 [5-7] 這種脂蛋白在所有腦膜炎球菌血清組中表達，並在多種菌株中發現。已將fHBP序列分為三個家族[2](在本文中稱為家族1、11和III)，又給定家族產生的血清對同一家族產生殺細菌活性，但對表達其它家族之一的菌株無活性，即存在家族內、而非家族間交叉保護。對於疫苗接種目的，fHBP蛋白已用作大腸桿菌(E. coll)中表達的重組蛋白[8]或已經在腦膜炎球菌中過度表達，以至於從過度表達菌株中純化的外膜囊泡將展示大量免疫原性fHBP[9]。然後，這些囊泡可用於疫苗，以提供強大的保護性抗-fHBP應答。本發明的ー個目的是提供提高腦膜炎球菌中fHBP表達的額外的改良方法。

發明內容
本發明人發現，fhbp基因由兩種差異調控的啟動子從兩種獨立轉錄物表達。在一個轉錄物中，它與相鄰上遊基因(nmbl869)由Pnmbl869啟動子共同表達。另ー轉錄物是單順反子，並由其自身專用啟動子Pfhbp表達，它由全局調控蛋白FNR(已知的厭氧激活物蛋白質、延胡索酸和硝酸還原酶調節物)因氧限制條件而激活。為了提高單順反子轉錄物的表達，採用FNR的突變形式。該突變形式是組成型活化的，甚至在有氧條件下也是如此，因此內源性Pfhbp啟動子組成型激活，導致fHBP過度表達。可採用相同方法過度表達任何其它具有FNR激活的啟動子的腦膜炎球菌基因，包括經工程改造處於這種啟動子控制下的基因。因此，本發明提供一種腦膜炎球菌，其(a)具有其轉錄處於FNR激活的啟動子控制下的基因，和(b)表達FNR的組成型活性形式。FNR的表達導致FNR活化基因的組成型表達。轉錄處於FNR激活的啟動子控制下的基因最好是fhbp基因。雖然不是必需，但腦膜炎球菌最好不表達FNR的非組成型活性形式。本發明也提供一種製備腦膜炎球菌突變體的方法，該方法包括修飾其內源性fnr基因的步驟，以使編碼的FNR蛋白組成型活化。本發明也提供一種製備腦膜炎球菌突變體的方法，該方法包括引入編碼FNR的組成型活性形式的基因的步驟。該方法也可包括修飾腦膜炎球菌中任何內源性fnr基因的步驟以抑制或防止其表達。因此，本發明還提供一種提高轉錄物表達的方法，該轉錄物在腦膜炎球菌中的轉、錄受FNR激活的啟動子控制，該方法包括為腦膜炎球菌提供FNR的組成型活性形式。然後，轉錄物表達增加可提高腦膜炎球菌中編碼蛋白的水平。因此，本發明還提供一種在腦膜炎球菌中提高轉錄物表達的方法，該轉錄物含有其表達受至少兩個不同啟動子控制的基因，這兩個啟動子中ー個是FNR激活的啟動子，另一個不是，所述方法包括向所述腦膜炎球菌提供FNR的組成型活性形式，從而提高該轉錄物的表達。在包含該基因的多種轉錄物中，相對於不同啟動子驅動的轉錄物，FNR活化啟動子驅動的轉錄物增加。本發明還提供一種製備脂蛋白體腦膜炎球菌囊泡的方法，該方法包括處理本發明腦膜炎球菌的步驟，以破壞其外膜，從而由其形成包含外膜的蛋白質組分(如fHBP)的囊泡。所述囊泡可用作免疫原性組合物中的免疫原性組分(例如，作為對抗腦膜炎球菌的疫苗)。該方法可包括從任何活的和/或完整的細菌分離囊泡的又ー步驟，例如，通過大小分離(如過濾，使用允許囊泡通過但不允許完整細菌通過的濾器)，或通過離心以使細胞相對於囊泡優先沉澱(例如低速離心)。
本發明還提供一種製備免疫原性組合物(如疫苗)的方法，該方法包括將由上述囊泡製備方法製備的囊泡與藥學上可接受的運載體(如緩衝液)和/或免疫佐劑和/或一種或多種其它免疫原性組分配製在一起的步驟。本發明還提供表達FNR的組成型活性形式的腦膜炎球菌。本發明還提供腦膜炎球菌FNR的組成型活性形式，此外還提供編碼這一 FNR的核酸。特別有用的FNR的組成型活性形式包含SEQ ID NO :5，與野生型FNR序列(來自菌株MC58的SEQ ID NO :4)相比該序列在Asp-148上有突變，如D148A，其中野生型Asp 148被Ala代替。與現有策略相比，本發明提供在腦膜炎球菌中過度表達外膜蛋白(如fHBP)的優勢。雖然已提示通過異源啟動子驅動表達以過度表達蛋白質，但這些策略只有在異源啟動子的基礎活性高於內源性啟動子時才導致過度表達。本文所述的策略通過增加或提高FNR活化基因的內源表達直接作用，在無需啟動子修飾的條件下實現過度表達。腦膜炎球菌本發明提供各種腦膜炎球菌，其表達組成型活性FNR。因此，與正常的野生型菌株不同，FNR活化基因可高水平表達，即使在不限制氧水平吋。這類基因包括fhbp基因，因此本發明腦膜炎球菌可在其外膜中過度表達fHBP蛋白。本發明的腦膜炎球菌可由野生型菌株通過定點誘變製備，或者通過隨機誘變後篩選所需修飾製備，或者通過敲除和敲入技術製備。例如，可利用定位誘變技術修飾編碼內源性FNR的基因，以引入提供組成型活性的突變。在其它實施方式中，可敲除內源性fnr基因(例如，通過缺失或用標記物替換)，並可引入新的fnr基因(例如位於與缺失相同的位點上、整合到染色體上但位於不同於缺失的位點上，或在質粒上)。在其它實施方式中，引入新的fnr基因而保持內源性fnr基因。實現這些和相似目標的各種方式是顯而易見的。基因NMB1428和NMB1429之間的整合是方便的。與正常野生型菌株相比，本發明腦膜炎球菌表達組成型活性FNR。除此種修飾之夕卜，腦膜炎球菌與野生型菌株相比還可具有至少ー種其它修飾，例如通過遺傳操作引入的修飾[10-13]。例如，可修飾腦膜炎球菌以提高免疫原性(例如，以高表達免疫原，包括FNR未激活的免疫原)，以降低毒性、抑制莢膜多糖合成、下調PorA表達等。本發明腦膜炎球菌可具有修飾的fur基因[14]。參考文獻21教導，應當通過伴隨的porA和cps的敲除上調nspA的表達,可以使用這些修飾。腦膜炎球菌可表達多種不同的PorA亞型[15]。本發明腦膜炎球菌可具有低內毒素水平，例如通過敲除參與LPS生物合成的酶實現[16，17]。這些或其它突變體均可以與本發明一起使用。本發明腦膜炎球菌可表達ー種以上PorA亞型。之前已構建出6價和9價PorA菌株。菌株可表達 2、3、4、5、6、7、8 或 9 種 PorA 亞型P1. 7,16 ；P1. 5-1,2-2 ；P1. 19,15-1 ；PL 5-2，10 ；P1. 12-1. 13 ；P1. 7-2,4 ；P1. 22，14 ；P1. 7-1,1 和/或 PL 18_1，3，6。在其它實施方式中，可以下調菌株中PorA的表達，例如，PorA的量相對於野生型水平(例如相對於H44/76菌株)減少了至少20% (例如，彡30%、彡40%、彡50%、彡60%、彡70%、彡80%、彡90%、彡95%等)，或甚至被敲除。本發明腦膜炎球菌可以高表達(相對於相應的野生型菌株)某些蛋白質。例如， 菌株可以高表達NspA、蛋白287 [18]、TbpA和/或TbpB[19]，銅、鋅超氧化物歧化酶[19]、HmbR 等。在一些實施方式中，腦膜炎球菌可以包括一個或多個參考文獻20-23描述的敲除和/或高表達突變。下調和/或敲除的優選基因包括(a) Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA, LbpB, LpxK、Opa, Opc, PilC、PorB, SiaA, SiaB, SiaC、SiaD, TbpA 和/ 或 TbpB [20] ； (b) CtrA、CtrB> CtrC、CtrD> FrpB> GalE、HtrB/MsbB> LbpA、LbpB> LpxK、Opa>Opc、PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA 和 / 或 TbpB[21] ； (c)ExbB,ExbD,rmpM、CtrA> CtrB> CtrD> GalE、LbpA> LpbB> Opa> Opc> PilC、PorB> SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA 和/或 TbpB[22];和(d)CtrA、CtrB, CtrD, FrpB, OpA、OpC, PilC、PorB, SiaD、SynA、SynB 和/或 SynC [23]。可敲除本發明腦膜炎球菌中的MltA(NMB0033) [24]，這會提高該菌株在正常生長過程中釋放的囊泡。這種「高出泡」菌株是免疫原性囊泡，例如含有高水平外膜蛋白的囊泡的有用來源，所述外膜蛋白來自過度表達的FNR-活化基因如fhbp。在一些實施方式中，本發明腦膜炎球菌可具有以下特徵中的ー種或多種或全部⑴LgtB和/或GalE下調或敲除，以截短腦膜炎球菌LOS ; (ii) TbpA上調；(iii) NhhA上調；(iv)0mp85 上調;(v) LbpA 上調；(vi)NspA 上調；(vii)PorA 敲除；(viii)FrpB 下調或敲除；(ix) Opa下調或敲除；(X) Opc下調或敲除；(xii) cps基因複合體缺失。截短的LOS可以不包括唾液酸-乳糖-N-新四糖表位，例如，其可以為半乳糖缺陷型L0S。所述LOS可以沒有α鏈。腦膜炎球菌可包含導致脂質A的毒性活性降低或檢測不到的遺傳修飾，特別是在它們用於製備脂蛋白體囊泡吋。已知用於降低毒性脂質A活性的各種修飾。例如，腦膜炎球菌中可能敲除了 IpxLl和/或lpxL2基因，例如得到四-或五-醯基化的脂質Α。脂質A4/ -激酶基因(IpxK)中的突變也降低了脂質A的毒性活性。優選LpxLl敲除菌株，特別是當fHBP表達上調時[25]。也可通過將突變引入參與多粘菌素B抗性的基因/基因座如pmrE和/或pmrF，改變LPS毒性活性。PhoP-PhoQ調節系統(磷酸-接替雙組分調節系統)中的突變也可產生刺激E選擇素表達和TNF分泌的能力降低的修飾脂質A。腦膜炎球菌可含有ー種以上fhbp基因。例如，它們可包括fHBP家族1、11和III中的ー個以上家族的fhbp基因。例如，參考文獻26公開了表達內源家族I和異源家族II變體的內毒素減毒的突變菌株。由這ー菌株製備的囊泡提供更廣的抗-fHBP抗體應答譜。各fhbp基因可受其自身的FNR活化啟動子調控，但也可能在多順反子轉錄物(単一 FNR調節子)中包括各fhbp基因。可修飾本發明腦膜炎球菌，以破壞Pnmbl869啟動子的轉錄終止。本發明腦膜炎球菌可以屬於任何血 清組，例如A、B、C、W135、Y。它們通常是血清組B菌株。該菌株可以是任何血清型(如l、2a、2b、4、14、15、16等)、任何血清亞型和任何免疫型(如LI ；L2 ；L3 ;L3，3，7 ；L10 ;等)。腦膜炎球菌可以來自任何適當譜系，包括高侵襲性與超毒カ譜系，如以下7種超毒力譜系中任ー種亞組I、亞組III、亞組IV-1、ET 5複合物、ET-37複合物、A4簇、譜系3。組成型活性FNRFNR是全局厭氧調節物，其在厭氧條件下的活性需要[4Fe_4S]簇。在有氧和無氧生長過程中合成FNR多肽，但在有氧培養中相關鐵-硫中心降解，半衰期約為2分鐘。在厭氧生長過程中[4Fe-4S]鐵-硫中心的組件促進ニ聚化，這是FNR結合FNR依賴性啟動子上的反向重複靶序列的先決條件。本發明腦膜炎球菌表達組成型活性FNR。已知可修飾來自大腸桿菌的FNR，以使其[4Fe-4S]簇對O2穩定，從而產生組成型活性蛋白，即它激活FNR依賴性基因的轉錄，即使在不限制氧氣吋。大腸桿菌序列中合適的突變包括[27] Asp-22 (如D22G) >Leu-28 (如L28H)、His-93 (如 H93R)、Glu-150 (如 E150K)和/或 Asp 148 (如 D148A、D148G、D148V)上的修飾。突變可具有各種潛在功能效果，例如，防止改變cAMP與FNR的結合、防止[4Fe-4S]簇的氧化、促進FNR ニ聚化等。公開文獻已對淋球菌FNR(如參考文獻28確認淋球菌殘基22和148上的L28H和D148A突變體即使在O2存在下也有活性)作出類似修飾，其中的實施例顯示可以相似方式修飾腦膜炎球菌FNR。實施例中示出了大腸桿菌和腦膜炎球菌FNR胺基酸序列(SEQ ID N0:4和6)的比對，以幫助選擇腦膜炎球菌FNR的其它有效突變。本發明的組成型活性腦膜炎球菌FNR可驅動FNR活化的腦膜炎球菌基因以氧氣依賴方式表達。優選的組成型活性FNR也對氮氧化物滅活作用(可使野生型蛋白的[4Fe-4S]簇亞硝化)有抗性。製備野生型腦膜炎球菌FNR蛋白的突變形式(如SEQ ID NO 4的突變體)的方法是本領域眾所周知的，例如定位誘變或易錯PCR。因此，可修飾腦膜炎球菌中表達O2依賴性FNR的內源性fnr基因，造成編碼的FNR蛋白反而組成型激活。本發明腦膜炎球菌表達組成型活性FNR吋，優選(但不一定)不表達FNR的非組成型活性形式。因此，所述組成型活性FNR可能是腦膜炎球菌表達的唯一 FNR。這可通過以下方式實現修飾內源fnr基因，或者作為替代方式，滅活內源fnr基因並引入編碼組成型活性蛋白的修飾的fnr基因，或者將fnr基因引入FNR空菌株「MC-fnrKO」 (參考文獻29中公開)。本發明還提供組成型活性腦膜炎球菌FNR。與野生型FNR序列(來自菌株MC58的SEQ ID NO :4)相比，這可以在殘基Leu-22(如L22H)、Glu-144(如E144K)和/或Asp-148 (如D148A、D148G、D148V)中的一個或多個上產生突變。例如，本發明的組成型活性腦膜炎球菌FNR可包含SEQ ID NO :5，其中野生型Asp 148被Ala取代(即對應於大腸桿菌D148A突變體的腦膜炎球菌突變)。本發明還提供可驅動從腦膜炎球菌FNR活化啟動子表達的轉錄因子，其中所述因子包含與SEQ ID NO :4具有至少序列相同性的胺基酸序列，條件是胺基酸序列的殘基148 (根據SEQ ID NO 4編號)不是Asp (例如是Ala、Gly或Val)。本發明還提供編碼這些FNR蛋白的核酸。可以多種方式製備本發明中的核酸，例如，完全或部分化學合成(例如DNA的亞磷醯胺合成)、利用核酸酶(例如限制性酶)消化較長核酸、連接較短核酸或核苷酸(例如使用連接酶或聚合酶)、由基因組或cDNA文庫製備等。本發明核酸可採取各種形式，例如，單鏈、雙鏈、載體、引物、探針、標記、未標記等。本發明中的核酸優選地採取分離或基本分離的形式。術語「核酸」包括DNA和RNA，還有其類似物，如含有修飾主鏈的類似物，以及肽核酸(PNA)等。本發明所述核酸可以被標記，例如，使用放射性或螢光標記。本發明還提供包含本發明核苷酸序列(如克隆或表達載體)的載體(如質粒)和用這種載體轉化的宿主細胞。FNR活化的基因和啟動子腦膜炎球菌中多種基因由FNR依賴性啟動子轉錄。例如，參考文獻29報導由微陣列實驗鑑定的各種FNR依賴性基因和操縱子175種基因的轉錄差異超過2倍。FNR活化基因包括但不限於nmbl806、mapA、pgm β、ΝΜΒ0388、galM、nmb0363、nmbl805、nosR、nmbl677、aniA和fhbp。在具有組成型活性FNR的腦膜炎球菌中，即使在有氧條件下，也能増加任何這些基因(相對於野生型)的表達。任何這些基因均可用作天然FNR活化啟動子的來源，從而可聯繫於和驅動下遊感興趣基因的表達。本發明也可與修飾的FNR活化啟動子一起使用。例如，實施例顯示匪117菌株具有Pfhbp啟動子，其具有無效-10啟動子元件,不顯示由組成型活性FNR過度表達。因此，可用於本發明的修飾的FNR活化啟動子可具有作為δ 70啟動子共有序列的-10和/或-35六聚體(如 SEQ ID NO :20 是-10 且SEQ ID NO :21 是-35 ;或者 SEQ ID Ν0:31 是-10且SEQ ID NO :32是-35)，因此可對其進行修飾以使其序列更接近(或完全接近)該共有序列。相似地，用於本發明的修飾的FNR活化啟動子可具有來自基因如腦膜炎球菌aniA的對FNR有高親和カ的FNR結合位點(FNR框)，例如SEQ ID NO :30，或者可具有使其序列更接近(或完全接近)FNR框共有序列SEQ ID NO 19的修飾的FNR結合位點。因此，通常來看，可構建存在FNR時有高度活性的啟動子，如通過連接來自已知FNR活化啟動子的啟動子元件(-10、-35和FNR框),包括野生型或優化元件。雖然本發明腦膜炎球菌可具有組成型活性FNR，但在翻譯後水平控制這種組成型活性。因此，為了最大程度提高組成型活性FNR的胞漿水平，應該在FNR積極轉錄和翻譯的條件下培養腦膜炎球菌。 在本發明腦膜炎球菌中實現表達的FNR活化基因可以是內源性FNR活化啟動子控制下的內源性基因(如內源性fhbp基因)，引入的FNR活化啟動子控制下的內源性基因，內源性FNR活化啟動子控制下的引入基因，或引入的FNR活化啟動子控制下的引入基因。因此，本發明可用於過度表達內源性或外源性蛋白質(例如，作為參考文獻10所述方法的替代方式)，例如將編碼外膜蛋白的基因與FNR活化啟動子連接，從而提高這些蛋白質在外膜中(因而在囊泡中)的水平。本發明尤其可用於由FNR依賴性啟動子表達外膜蛋白。所述蛋白質如fHBP可在外膜中過度表達(相對於野生型菌株)，並保留在由腦膜炎球菌製備的脂蛋白體囊泡中。所述外膜蛋白可以是囊泡中的免疫可及形式，即可結合本發明純化多肽的抗體也可結合存在於囊泡中的所述多肽。轉錄在FNR激活的啟動子控制下，因而可提高其表達的最優選的基因是編碼H因子結合蛋白的fhbp。H因子結合蛋白
全長fHBP具有胺基酸序列SEQ ID NO 1(菌株MC58)。成熟脂蛋白(N-末端半胱氨酸)缺少SEQ ID NO 1的前19個胺基酸，fHBP的人工AG形式缺少前26個胺基酸。MC58序列屬於fHBP家族I。家族II和III的示範性序列是SEQ ID NO 2 (家族II ;菌株2996)和SEQ ID NO :3 (家族III ;菌株M1239)，在野生型腦膜炎球菌中，它們類似地在N末端半胱氨酸上脂化。fhbp基因的啟動子被FNR激活，因此本發明可用於在腦膜炎球菌中表達任何這些fHBP序列。更常見的是，本發明可用於表達編碼包含以下序列的胺基酸序列的fhbp基因SEQ ID NO :1、2或3之一；(a)與SEQ ID NO :1、2或3中任一序列有至少x%序列相同性的胺基酸序列，其中 X 值為 65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99 或更高；和/或(b) SEQ IDNO :1，2或3中任一序列的至少η個胺基酸的片段，其中η值為7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100 或更高。(b)的片段優選包含所述 SEQ ID NO 的表位。給予宿主動物吋，fhbp基因編碼的蛋白質最好有能力誘導殺細菌性抗腦膜炎球菌抗體。關於殺細菌反應的其它信息在下文中給出。fhbp基因和/或其編碼的胺基酸序列可能是天然產生的序列或是人工序列。例如，已知製備人工fHBP序列，其摻入來自多種不同天然fHBP序列的特徵，參見例如，參考文獻30-33。也了解產生不同家族的fHBP序列的融合物，參見例如，參考文獻33-36。本發明可用於任何這些人工fHBP序列。這些方法可用於提供可引發識別ー個以上fHBP家族的抗體的fHBP蛋白。因此，給予宿主動物吋，fhbp基因編碼的蛋白質可有能カ誘導殺細菌性抗腦膜炎球菌抗體，該抗體識別SEQ ID NO :I、2和/或3中兩種或三種序列。例如，fhbp基因可能編碼下述任何胺基酸序列參考文獻8的SEQ ID NO :1_45中的各序列；參考文獻8的SEQ ID NO : 79、82、83、85、87、88、89和90 ;參考文獻8的SEQ IDNO =123-142 ;參考文獻5的SEQ ID NO 1-329內各胺基酸序列；參考文獻37的SEQ ID NO
2、4、6、8、10 或 12 ;參考文獻 31 的 SEQ ID NO :43、44、52、53、62、63、64 或 65 ;參考文獻 32的 SEQ ID NO :46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、58、59、60、63、64、65、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95 ;參考文獻30的SEQ ID NO :4_80中的各序列；參考文獻38的SEQID NO 4-78中的各序列；參考文獻38的SEQ ID NO =103-138中的各序列。例如，fhbp基因可能編碼包含本文所述SEQ ID N0:12、13和14 (稱為9C、IOA和8B)中任一項的胺基酸序列。脂蛋白體囊泡
本發明腦膜炎球菌尤其可用於製備保留來自細菌的外膜蛋白的脂蛋白體囊泡。例如，可通過使用組成型活性FNR過度表達fHBP來提供富含fHBP的囊泡。這些脂蛋白體囊泡可通過外膜破壞或出泡、形成包含外膜蛋白組分的囊泡而獲得。因此，該術語包括0MV、出泡、微囊泡(MV[39])和「天然OMV」 ( 「N0MV」 [40])。出泡、MV 和NOMV是天然產生的膜囊泡，在細菌生長時自發形成，釋放到培養基中。MV可以通過以下方法獲得在肉湯培養基中培養奈瑟球菌，將全細胞與肉湯培養基中較小的MV分離(例如，通過過濾或低速離心，只沉澱細胞而不沉澱較小囊泡)，然後從細胞耗盡的培養基中收集MV (例如，通過過濾、差速離心或MV聚集，通過高速離心沉澱MV)。通常可根據培養基中產生的MV的量選擇用於生產MV的菌株，例如文獻41和42描述了具有高MV產量的奈瑟氏菌。高出泡菌株可參見參考文獻43。破壞mltA基因[24]也可提供在培養期間自發釋放合適囊泡的菌株。從細菌人工製備0MV，可以利用去汙劑處理(例如用脫氧膽酸鹽)或通過非去汙劑方式(例如參見參考文獻44)進行製備。形成OMV的技術包括用膽酸鹽去汙劑(例如，石膽酸、鵝脫氧膽酸、烏索脫氧膽酸、脫氧膽酸、膽酸、烏索膽酸等的鹽，優選用脫氧膽酸鈉[45和46]處理奈瑟球菌)在不會沉澱去汙劑的充分高的pH下[47]處理細菌。其它技術基本可以在沒有去汙劑存在的情況下[44]利用如超聲、均化、微流化、空化、滲透壓休克、研磨、法式壓制(French press)、混合等技術進行。不使用或使用低去汙劑的方法可以保留有用的抗原，如NspA[44]。因此ー種方法可以使用含有O. 5%或更低如約O. 2%、約O. 1%,
<O. 05%或O濃度的脫氧膽酸鹽的OMV提取緩衝液。參考文獻48描述了ー種製備OMV的有用過程，涉及對粗OMV進行超濾，代替高速離心。該過程可以涉及在超濾後進行超離心的步驟。如果LOS存在於囊泡中，可以對囊泡進行處理，以將其LOS與蛋白質組分聯繫起來(「內泡」偶聯[23])。所述脂蛋白體囊泡可用作免疫原性組合物中的免疫原性組分。形成囊泡的方法可包括從任何活的和/或完整的細菌分離囊泡的又ー步驟，例如，通過大小分離(如過濾，使用允許囊泡通過但不允許完整細菌通過的濾器)，或通過離心以使細胞相對於囊泡優先沉澱(例如低速離心)。免疫原性組合物本發明提供包含本發明脂蛋白體囊泡的免疫原性組合物。這些組合物可通過將所述囊泡與藥學上可接受的運載體和/或免疫佐劑和/或一種或多種其它免疫原性組分配製在一起製備得到。所述免疫原性組合物可包括藥學上可接受的載體，其可以是本身不會誘導產生對接受所述組合物的患者有害的抗體的任何物質，且可以實現無異常毒性的給藥。藥學上可接受的載體可以包括液體，如水、鹽水、甘油和こ醇。輔助物質也可以存在於該類載體中，如溼潤劑或乳化剤、PH緩衝物質等。關於合適載體的充分討論見參考文獻49。奈瑟球菌感染會影響身體的各個部分，因此本發明中的組合物可以製備成各種形式。例如，可將所述組合物製備為液體溶液或懸浮液形式的注射劑。也可製備適合在注射前溶解或懸浮於液體運載體的固體形式。可製備所述組合物用於局部給藥，例如油膏、乳膏或粉劑。可將所述組合物製備為用於ロ服的製劑，例如，片劑、膠囊或糖漿(任選調味)。可將所述組合物製備為採用細粉或噴霧的用於肺部給藥的製劑，例如吸入劑。可將所述組合物製備為栓劑或陰道栓。所述組合物可以製成鼻部、耳部或眼部給藥製劑，例如滴劑。該組合物優選無菌。其優選無熱原。優選用緩衝液處理使其處於例如pH6_pH 8，通常為約pH 7。當組合物包含氫氧化鋁鹽時，有用的是包括組氨酸緩衝劑[50]。本發明中的組合物可以與人體等張。免疫原性組合物包含免疫有效量的免疫原，以及任何其它所需的其它特定組分。「免疫有效量」指在一次劑量或一系列劑量的一部分中給予個體的對治療或預防有效的量。該量根據所治療個體的健康和身體狀況、年齡、所治療個體的分類組(例如，非人的靈長動物、靈長動物等)、個體免疫系統合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗配方、治療醫生對醫學情況的評估和其它相關因素而變化。預計所述量將落入可通過常規試驗測定的較寬範圍內。以前有關腦膜炎球菌囊泡疫苗的工作為本發明提供了藥學、生理學和製劑方面的指南。例如，VA-MENG0C-BC 是可注射懸液，其在O. 5ml中包含吸附於2mg氫氧化鋁凝膠的50μ g菌株Cu-385-83的OMV和50 μ g血清組C莢膜多糖，再加O. 01%硫柳汞和磷酸鹽緩衝 液。MeNZB 也是O. 5ml懸液，並含有吸附於I. 65mg氫氧化鋁佐劑的25 μ g菌株NZ98/254的0MV，以及組氨酸緩衝液和氯化鈉。MenBvac類似於MeNZB ，但由菌株44/76製備得到。各亞型的OMV濃度要足夠高，以便在通過單ー劑量方案或多劑量方案(例如，包括加強劑量)給予患者後提供保護性免疫。本發明組合物的OMV濃度通常為10至500yg/ml，優選為25至200 μ g/ml，更優選為約50 μ g/ml或約100 μ g/ml (用OMV中的總蛋白表示)。所述組合物可與其它免疫調節劑聯合給藥。可以用於本發明組合物的佐劑包括但不限於A.含礦物質的組合物本發明中適合用作佐劑的含有礦物質的組合物包括礦物鹽，例如鋁鹽和鈣鹽。本發明包括礦物鹽，如氫氧化物(例如羥基氧化物)、磷酸鹽(例如，羥基磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等，[參見，例如參考文獻54的第8章和第9章]，或不同礦物化合物的混合物，其中的化合物可採取任何合適形式(例如凝膠、晶體、無定形等)，優選吸附。也可將含有礦物質的組合物製成金屬鹽的顆粒。稱為"氫氧化鋁"的佐劑一般是羥基氧化鋁鹽(通常至少部分為晶體)。可採用紅外(IR)光譜將式AlO (OH)代表的羥基氧化鋁與其它鋁化合物，如氫氧化鋁Al (OH)3區別開，具體區別是lOTOcnr1處存在吸收條帶和3090-3100( ^處存在強肩[參考文獻54的第9章]。半峰高處衍射帶的寬度(WHH)反映了氫氧化鋁佐劑的結晶程度，結晶不佳的顆粒因晶體尺寸較小而顯示更強的譜線增寬。表面積隨WHH的増加而增加，WHH值較大的佐劑顯示吸附抗原的能力較強。氫氧化鋁佐劑通常呈纖維形態(例如，如電子透射顯微圖中所見)。氫氧化鋁佐劑的Pl通常約11，即在生理pH下佐劑本身具有表面正電荷。據報導，pH 7. 4時氫氧化鋁佐劑的吸附容量為I. 8-2. 6毫克蛋白質/毫克Al+++。稱為"磷酸鋁"的佐劑一般是羥基磷酸鋁，也常常含有少量硫酸鹽(即羥基磷酸硫酸鋁)。可通過沉澱獲得這些佐劑，沉澱期間的反應條件和濃度影響磷酸根取代所述鹽中羥基的程度。羥基磷酸鹽的？04「1摩爾比通常為0.3-1.2。羥基磷酸鹽因存在羥基而有別於嚴格的A1P04。例如，3164CHT1處的條帶(例如在200°C下)表明存在結構性羥基[參考文獻54的第9章]。磷酸鋁佐劑的P04/A13+摩爾比通常為O. 3-1. 2，優選為O. 8-1. 2，更優選為0.95±0.1。磷酸鋁通常是無定形的，尤其是羥基磷酸鹽。典型的佐劑是P04/A1摩爾比為O. 84-0. 92的無定形的羥基磷酸鋁，包含O. 6mg Al3Vml0磷酸鋁通常是顆粒(如在透射電子顯微圖上觀察到的板狀形態)。抗原吸附後顆粒直徑一般是O. 5-20 μ m(如約5-10 μ m)。據報導，pH 7. 4時磷酸鋁佐劑的吸附容量為O. 7-1. 5毫克蛋白質/毫克Al+++。磷酸鋁的零電點(PZC )與磷酸對羥基的取代程度逆相關，這種取代程度可能取決於用於通過沉澱製備鹽的反應條件和反應物濃度。也通過改變溶液中游離磷酸根離子的濃度(更多磷酸根=更多酸性PZC)或加入緩衝劑如組氨酸緩衝劑(使PZC鹼性更強)改變PZC0本發明所用的磷酸鋁的PZC通常為4. 0-7. 0，更優選為5. 0-6. 5，例如約為5. 7。用於製備本發明組合物的鋁鹽懸浮液可以，但不一定含有緩衝液(如磷酸鹽或組氨酸或Tris緩衝液)。該懸浮液優選無菌且無熱原。懸浮液可含有游離的水性磷酸根離子，如存在濃度為I. 0-20mM，優選5-15mM，更優選約10mM。該懸浮液也可含有氯化鈉。在一個實施方式中，佐劑組分包括氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物。在這種情況下，磷酸鋁多於氫氧化鋁，例如重量比為至少2 1，例如，彡5 : I、彡6 : I、彡7 : I、彡8 : I、彡9 I等。給予患者的組合物中Al+++的濃度優選小於10mg/ml,例如< 5mg/ml、< 4mg/ml、
<3mg/ml、< 2mg/ml、< lmg/ml 等。優選範圍是 0. 3-lmg/ml。優選最大值是< O. 85mg/齊 。B.油乳劑適合用作本發明佐劑的油乳劑組合物包含鯊烯-水乳剤，如MF59 [參考文獻54的第10章；也參見參考文獻51] (5%鯊烯、O. 5%吐溫80和O. 5%司盤85，用微流化床配製成亞微米顆粒)。也可以使用完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)。已知各種水包油乳剤，它們通常包括至少ー種油和至少ー種表面活性剤，所述油和表面活性劑是可生物降解(可代謝)和生物相容的。乳劑中的油滴直徑通常小於5 μ m，有利地乳液包含具有亞微米直徑的油滴，通過微流化床實現這種小尺寸以提供穩定乳剤。優選尺寸小於220nm的液滴，因為其可進行過濾滅菌。本發明可使用的油諸如來自動物(如魚)或植物的油。植物油的來源包括堅果、種籽和穀物。最常見的花生油、大豆油、椰子油和橄欖油是堅果油的示例。也可使用獲自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。種籽油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在穀物油中，最常見的是玉米油，但也可以使用其它穀類的油，如小麥、燕麥、黒麥、稻、畫眉草、黑小麥等。可從堅果和種籽油開始，通過水解、分離和酯化合適物質製備甘油和1，2_丙ニ醇的6-10碳脂肪酸酷，其不是種籽油中天然產生。來自哺乳動物乳汁的脂肪和油類是可代謝的，因此可以用於實施本發明。獲得動物來源純油所必需的分離、純化、皂化和其它方法的過程為本領域熟知。大多數魚類含有容易回收的可代謝油。例如，鱈魚肝油、鯊魚肝油和諸如鯨蠟的鯨油是可以用於本發明的幾種魚油的示例。通過生化途徑用5-碳異戊ニ烯單位合成許多支鏈油，其總稱為萜類。鯊魚肝油含有稱為鯊烯的支鏈不飽和萜類化合物，即2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-ニ十四碳六烯。其它優選油是生育酚(見下)。包含鯊烯的水包油乳液是特別優選的。可以使用油的混合物。
表面活性劑可以按其『HLB』 (親水/親脂平衡)分類。本發明優選的表面活性劑的HLB為至少10，優選至少15，更優選至少16。可以與本發明一起使用的表面活性劑包括但不限於聚氧こ烯去水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特別是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ;以商品名D0WFAX 出售的環氧こ烷(EO)、環氧丙烷(PO)和/或環氧丁烷(BO)的共聚物，如直鏈ΕΡ/Ρ0嵌段共聚物；重複的こ氧基(氧-1，2-こニ基)數量不同的辛苯聚醇，特別感興趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚こ氧基こ醇)；(辛基苯氧基)聚こ氧基こ醇(IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂如磷脂醯膽鹼(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油 醇的聚氧こ烯脂肪醚(稱為苄澤表面活性剤)，如三こニ醇單月桂基醚(苄澤30);以及去水山梨糖醇酯(總稱為司盤)，如去水山梨糖醇三油酸酷(司盤85)和去水山梨糖醇單月桂酸酷。乳液中包含的優選表面活性劑是吐溫80 (聚氧こ烯脫水山梨糖醇單油酸酯)、司盤85 (脫水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。如上所述，吐溫80等去汙劑可提供下文實施例所見的熱穩定性。可使用表面活性劑的混合物，如吐溫80/司盤85混合物。聚氧こ烯去水山梨糖醇酯如聚氧こ烯去水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚こ氧基こ醇(曲通X-100)的組合也適合。另ー種有用的組合包含月桂醇聚醚_9加聚氧こ烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。優選的表面活性劑的含量(重量％ )為聚氧こ烯去水山梨糖醇酯(如吐溫80) O. 01-1%,特定是約O. I %;辛基-或壬基-苯氧基聚氧こ醇(如曲通XlOO或曲通系列的其它去汙劑)0. 001-0. 1%，特定是O. 005-0. 02%;聚氧こ烯醚(如月桂醇聚醚9)0. 1-20%,優選O. 1-10 %，特定是O. 1-1 %或約0.5%。本發明所用的具體水包油乳液佐劑包括但不限於 角藍烯、吐溫80 (Tween 80)和司盤(Span)85的亞微米乳液。所述乳液的體積組成可以是約5%角鯊烯、約O. 5%聚山梨酯80和約O. 5%司盤85。以重量計，這些比例為4. 3%鯊烯、O. 5%聚山梨酯80和O. 48%司盤85。這種佐劑稱為『MF59』 [51-53]，參考文獻54的第10章和參考文獻55的第12章更詳細地描述了該佐劑。.MF59乳液宜包含檸檬酸根離子，如IOmM檸檬酸鈉緩衝液。 包含鯊烯、α-生育酚和聚山梨酯80的乳液。這些乳液可含有2_10 %鯊烯、2-10%生育酚和O. 3-3%吐溫80，鯊烯生育酚的重量比優選彡I (例如O. 90)，因為這能使乳液更穩定。鯊烯和吐溫80的體積比可以約為5 2，或者重量比約為11 5。可通過將吐溫80溶解於PBS產生2%溶液，然後將90ml該溶液與5g DL- α -生育酚和5ml鯊烯的混合物混合，隨後使該混合物微流體化來製備ー種這類乳液。得到的乳液可含有如平均直徑為100-250nm，優選約180nm的亞微米油滴。 鯊烯、生育酚和曲通去汙劑(如曲通X-100)的乳液。該乳液也可包含3d-MPL(見下)。所述乳液可包含磷酸鹽緩衝液。 含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去汙劑(如曲通X-100)和生育酚(如α-生育酚琥珀酸鹽)的乳液。該乳液可包含這三種組分，其質量比約為75 11 10(如750 μ g/ml聚山梨酯80、110 μ g/ml曲通X-100和100 μ g/ml琥珀酸α -生育酚)，這些濃度應包括抗原中這些組分的貢獻。所述乳液還可包含鯊烯。該乳液也可包含3d-MPL(見下)。所述水相可包含磷酸鹽緩衝液。
鯊烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401 ( 「普流羅尼克 L121，，(" Plur0nicTMLI21"))的乳液。所述乳液可用pH 7. 4的磷酸鹽緩衝鹽水配製。該乳液是ー種有用的胞壁醯ニ肽遞送載體，且已與含蘇氨醯基-MDP的「 SAF-1」佐劑[56](O. 05-1% Thr-MDP、5%鯊烷、2. 5%普流羅尼克L121和O. 2%聚山梨酸酯80) —起使用。也可不與Thr-MDP —起使用，例如用「 AF」佐劑[57] (5 %鯊烷、I. 25 %普流羅尼克L121和O. 2%聚山梨酸酯80)。優選微流體化。 含有鯊烯、水溶劑、聚氧こ烯烷基醚親水性非離子型表面活性劑(如聚氧こ烯(12)十六十八醚)和疏水性非離子型表面活性劑(如去水山梨糖醇酯或ニ縮甘露醇酯，如去水山梨糖醇單油酸酯或『司盤80』)的乳液。該乳液優選為熱可逆的和/或其中至少90%油滴(以體積計)的尺寸小於200nm[58]。該乳液也可含有以下一種或多種物質糖醇；低溫保護劑(例如，糖，如十二烷基麥芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。這類乳液可凍幹。 含有O. 5-50%油、O. 1-10%磷脂和O. 05_5%非離子型表面活性劑的乳液。如參考文獻59所述，優選的磷脂組分是磷脂醯膽鹼、磷脂醯こ醇胺、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯肌 醇、磷脂醯甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。優選亞微米液滴尺寸。 不可代謝油(如輕質礦物油)和至少ー種表面活性劑(如卵磷脂、吐溫80或司盤80)的亞微米水包油乳液。可包含添加劑，例如QuilA皂苷、膽固醇、皂苷-親脂體偶聯物(如通過葡糖醛酸的羧基將脂族胺加到脫醯基皂苷上而產生的GPI-0100，如參考文獻60所述)、ニ甲基雙十八烷基溴化銨和/或N，N-雙十八烷基-N，N-雙(2-羥こ基)丙ニ胺。 包含礦物油、非離子親脂性こ氧基化脂肪醇和非離子親水性表面活性劑(例如，こ氧基化脂肪醇和/或聚氧こ烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[61]。 包含礦物油、非離子親水性こ氧基化脂肪醇和非離子親脂性表面活性劑(例如，こ氧基化脂肪醇和/或聚氧こ烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[61]。 皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如膽固醇)結合成螺旋膠束的乳液[62]。通常在傳遞給病人時混合組合物中的抗原和佐劑。可以在生產時或在遞送時將該乳液與抗原臨時混合。因此，在包裝或出售的疫苗中該佐劑和抗原可分開保存，使用時配製成最終製劑。所述抗原通常是水性形式，從而最終通過混合兩種液體製備疫苗。所述兩種液體的混合體積比可變(例如5 1-1 5)，但通常約為I : I。C.皂苷製劑[參考文獻54的第22章]皂苷製劑也可以用作本發明的佐劑。皂苷是在許多種類植物的樹皮、葉、莖幹、根甚至花中發現的留醇糖苷和三萜糖苷的異質群體。已廣泛研究了作為佐劑的得自皂皮樹(Quillaia saponaria Molina)樹皮的阜苷。阜苷也可商品化獲自麗花菝葜(Smilaxornata)(墨西哥菝葜)、滿天星(Gypsophilla paniculata)(婚紗花)和肥阜草(Saponariaofficianalis)(皂根)。皂苷佐劑製劑包括純化製劑如QS21，以及脂質製劑如ISC0M。QS21以商標Stimulon 出售。已採用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。已鑑定了用這些技術純化的特定組分，包括037、0317、0318、0321、0!^、0!1-8和職-(。所述皂苷優選QS21。製備QS21的方法參見參考文獻63。皂苷製劑也可包含留醇，如膽固醇[64]。皂苷和膽固醇的組合可用於形成稱為免疫刺激複合物(ISCOM)的獨特顆粒[參考文獻54第23章，還參見參考文獻65和66]。ISCOM通常還包含磷脂，如磷脂醯こ醇胺或磷脂醯膽鹼。任何已知的皂苷均可用於ISCOM中。ISCOM優選包含QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。任選地，ISCOM可不含其它去汙劑[67]。開發基於皂苷的佐劑的綜述可參見參考文獻68和69。D.細菌或微生物衍生物適用於本發明的佐劑包括細菌或微生物衍生物，如腸細菌的脂多糖(LPS)的無毒衍生物、脂質A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物。LPS的無毒衍生物包括單磷醯脂質A (MPL)和3_0_脫醯基MPL (3dMPL)。3dMPL是3脫-O-醯基單磷醯脂質A與4、5或6醯化鏈的混合物。3脫-O-醯基單磷醯脂質A的優選「小顆粒」形式見參考文獻70中所述。3dMPL的這種「小顆粒」小到足以在過濾除菌時通過O. 22 μ m膜[70]。其它無毒LPS衍生物包括單磷醯脂質A模擬物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸鹽衍生物，例如RC-529[71，72]。 脂質A衍生物包括大腸桿菌的脂質A衍生物，如0M-174。例如，參考文獻73和74中描述了 0M-174。適合用作本發明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通過磷酸鍵與鳥苷連接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含迴文結構或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯示具有免疫刺激作用。CpG可以包含核苷酸修飾/類似物，如硫代磷酸酯修飾，可以是雙鏈或單鏈。參考文獻75、76和77公開了可能的類似物取代，例如用2』-脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷。參考文獻78-83中進ー步討論了 CpG寡核苷酸的佐劑作用。CpG序列可能導向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT [84]。CpG序列可特異性誘導Thl免疫應答，如CpG-A 0DN，或更特異地誘導B細胞應答，如CpG-B ODN0參考文獻85-87中討論了 CpG-A 和 CpG-B ODN。優選 CpG 為 CpG-A ODN。CpG寡核苷酸優選構建成5』末端可被受體識別。任選將兩個CpG寡核苷酸序列的3』端相連接形成「免疫聚體」。參見例如，參考文獻88-90。基於免疫刺激性寡核苷酸的特別有用的佐劑被稱為IC-31 [91-93]。因此，本發明使用的佐劑可以包含(i)和(ii)的混合物(i)含有至少ー個(優選多個)CpI基序(即胞嘧啶與肌苷相連形成二核苷酸)的寡核苷酸(例如15-40個核苷酸)，和(ii)聚陽離子聚合物，如含有至少ー個(優選多個)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(如5_20個胺基酸)。所述寡核苷酸可以是包含26-聚體序列5' -(IC)13-3' (SEQ ID NO 7)的脫氧核苷酸。聚陽離子聚合物可以是含有ll-聚體胺基酸序列KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO 8)的肽。這種SEQID NO :7和8的組合提供IC-31 佐劑。細菌ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物可以用作本發明的佐劑。優選所述蛋白衍生自大腸桿菌(大腸桿菌不耐熱腸毒素「LT」)、霍亂菌(「CT」)或百日咳菌(「PT」)。參考文獻94中描述了將脫毒的ADP-核糖基化毒素用作黏膜佐劑,參考文獻95中描述了將其用作胃腸道外佐劑。所述毒素和類毒素優選全毒素形式，包含A和B亞單位。A亞單位優選含有脫毒突變；B亞單位優選不突變。所述佐劑優選脫毒的LT突變體，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。參考文獻96-103中描述了將ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐劑。ー種有用的CT突變體是CT_E29H[104]。優選根據參考文獻105中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亞單位的排列對比對胺基酸取代基編號，該參考文獻的全部內容特別納入本文作為參考。E.人免疫調節劑適合用作本發明佐劑的人免疫調節劑包括細胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[106]等)[107]、幹擾素(如幹擾素_ Y )、巨噬細胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子。優選的免疫調節劑是IL-12。F.生物粘著劑和黏膜粘著劑生物粘著劑和黏膜粘著劑也可以用作本發明的佐劑。合適的生物粘著劑包括酷化透明質酸微球[108]或黏膜粘著劑如聚(丙烯酸)交聯衍生物、聚こ烯醇、聚こ烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素。殼聚糖及其衍生物也可用作本發明的佐劑[109]。G.微粒微粒也可以用作本發明的佐劑。微粒(即直徑為 IOOnm至 150 μ m,更優選直徑 200nm至 30 μ m,最優選直徑 500nm至 10 μ m的顆粒)由生物可降解的無毒材料(例如，聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酷、聚酐、聚己內酯等)形成，優選聚丙交酯こ交酯共聚物，並任選經處理而具有帶負電錶面(例如用SDS處理)或帶正電錶面(例如用陽離子去汙劑如CTAB處理)。H.脂質體(參考文獻54第13和14章)。適合用作佐劑的脂質體製劑的例子見參考文獻110-112所述。I.咪唑並喹諾酮化合物。適合用作本發明佐劑的咪唑並喹諾酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，"瑞喹莫德3Μ")，見參考文獻113和114所述。本發明也可包含以上鑑定的一種或多種佐劑各方面的組合。例如，可將以下佐劑組合物用於本發明(1)皂苷和水包油乳劑[115] ；(2)皂苷(如QS21) +無毒LPS衍生物(如3dMPL)[116] ；(3)皂苷(如QS21)+無毒LPS衍生物(如3dMPL) +膽固醇；(4)皂苷(如QS21) +3dMPL+IL12 (任選+固醇)[117] ； (5) 3dMPL與(例如)QS21和/或水包油乳劑的組合[118] ;(6)SAF，含有10%鯊烯、O. 4%吐溫80 、5%普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，或微流體化成為亞微米乳液或渦旋振蕩產生粒度較大的乳液。(7) Ribi 佐劑系統(RAS) (RI公司(Ribi Immunochem))，含有2%鯊烯、O. 2%吐溫80和一種或多種細菌細胞壁組分，所述組分選自單磷醯脂質A (MPL)、海藻糖ニ黴菌酸酯(TDM)或細胞壁骨架(CWS)，優選MPL+CWS(Detox );和(8) —種或多種無機鹽(如鋁鹽)+LPS的無毒衍生物(如3dMPL)。用作免疫刺激劑的其它物質可參見參考文獻54的第7章。可用氫氧化鋁佐劑，抗原一般吸附在該鹽上。還優選具有包含鯊烯，具有亞微米油滴的水包油乳液是優選的，尤其是在年長者中。有用的佐劑組合包括Thl和Th2佐劑的組合，如CpG和鋁鹽，或雷西莫特和鋁鹽。可以使用磷酸鋁和3dMPL的組合。除囊泡外，免疫原性組合物可包含一種或多種其它免疫原性組分。這類組分包括但不限於其它腦膜炎球菌抗原和/或非腦膜炎球菌抗原。腦膜炎球菌抗原除了包括上述囊泡外，本發明組合物還可包括一種或多種其它腦膜炎球菌抗原來提高菌株覆蓋範圍。因此，組合物可以包含多肽或糖，在給予哺乳動物時可以引發對腦膜炎球菌具有殺菌作用的抗體應答。組合物可包含純化的腦膜炎球菌抗原。下面給出有關腦膜炎球菌抗原的其它詳情。例如，它可包括腦膜炎球菌抗原287、NadA> NspA、HmbR、NhhA> App>936> Omp85或額外fHBPo 一種組合物(參見參考文獻119和120)可包含以下的ー種或多種包含SEQ ID NO 9的多肽；包含SEQ ID NO 10的多肽；和/或包含SEQ ID NO 11的多肽(或包含SEQ IDNO 11的胺基酸24-350的多肽)。這些多肽優選在異源宿主中重組表達，然後純化，以便(例如)與所述囊泡混合。組合物可包含腦膜炎球菌莢膜糖抗原，例如以偶聯物形式。本發明的組合物可包含287抗原。287抗原作為基因NMB2132包括在奈瑟球菌B血清組菌株MC58[121]的出版的基因組序列中(GenBank登錄號GI :7227388 ;本文的SEQID N0:23)。之後已出版了來自許多菌株的287抗原序列。例如，287的等位基因形式如文獻122的圖5和15所示，以及例如文獻123的實施例13和圖21 (其中的SEQ ID 3179到3184)。已報導了許多287抗原的免疫原性片段。本發明所用的優選287抗原包含某胺基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO :23具有50%或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、 80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或更高);和/或(b)包含SEQ IDN0:23的至少'n'個連續胺基酸的片段，其中'n'是7個或更多個(如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多個)。(b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:23的表位。本發明最有用的287抗原可在施給對象後引起抗體，其能與胺基酸序列SEQ ID NO :23組成的腦膜炎多肽結合。有利的用於本發明的287抗原可在施給對象後引發殺菌性抗奈瑟球菌抗體。
本發明的組合物可包含NadA抗體。NadA抗原作為基因NMB1994包括在奈瑟球菌B血清組菌株MC58[121]的出版的基因組序列中(GenBank登錄號GI =7227256 ;本文的SEQID N0:24)。迄今已來自許多菌株的NadA抗原序列，已經詳細公開了作為奈瑟氏菌粘附素的蛋白活性。已報導了許多NadA的免疫原性片段。本發明所用的優選Nad多肽包含某胺基酸序列，該序列(a)與SEQ ID勵24具有50%或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5% 或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO :24的至少'n'個連續胺基酸的片段，其中'n'是7個或更多個(如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多個)。(b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:24的表位。本發明最有用的NadA抗原可在施給對象後引起抗體，其能與胺基酸序列SEQ ID NO :24組成的腦膜炎多肽結合。有利的用於本發明的NadA抗原可在施給對象後弓丨發殺菌性抗奈瑟球菌抗體。一個這種片段是SEQID NO 11 的胺基酸 24-350。
本發明的組合物可包含NspA抗原。NspA抗原作為基因NMB0663包括在腦膜炎B血清組菌株MC58[121]的出版的基因組序列中(GenBank登錄號GI =7225888 ;本文中的SEQID N0:25)。先前文獻124和125提到該抗原。之後已出版了來自許多菌株的NspA抗原序列。已報導了許多NspA的免疫原性片段。本發明所用的優選NspA多肽包含某胺基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO :25具有50%或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或更高);和/或(b)包含SEQ IDN0:25的至少'n'個連續胺基酸的片段，其中'n'是7個或更多個(如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多個)。(b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:25的表位。本發明最有用的NspA抗原可在施給對象後引起抗體，其能與胺基酸序列SEQ ID NO :25組成的腦膜炎多肽結合。有利的用於本發明的NspA抗原可在施給對象後引發殺菌性抗奈瑟球菌抗體。本發明的組合物可包含腦膜炎HmbR抗原。全長HmbR序列作為基因NMB1668包括在腦膜炎B血清組菌株MC58 [121]的出版的基因組序列中(GenBank登錄號GI :727246 ;本文的SEQ ID NO :26)。本發明可使用包含HmbR全長序列的多肽，但常用含有部分HmbR序列的多肽。因此在ー些實施方式中，根據本發明使用的HmbR序列可包含與SEQ ID NO :26具有序列相同性的胺基酸序列，其中i值為50、60、70、80、90、95、99或更高。在其它實施方式中，本發明的HmbR序列可包含SEQ ID NO :26的至少j個連續胺基酸的片段，其中j值為 7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高。在其它實施方式中，根據本發明使用的HmbR序列可包含一胺基酸序列，(i)其與SEQ ID NO26具有序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO 26中至少j個連續胺基酸的片段。 優選j個胺基酸的片段包含來自SEQ ID NO 26的表位。這些表位通常包含位於HmbR表面上的胺基酸。有用的表位包括涉及HmbR與血凝素結合的胺基酸，因為與這些位點結合的抗體能夠封閉細菌與宿主血凝素結合的能力。HmbR的拓撲學及其關鍵功能性殘基如文獻126所述。本發明最有用的HmbR抗原可在施給對象後引起抗體，其能與胺基酸序列SEQ ID NO26組成的腦膜炎多肽結合。有利的用於本發明的HmbR抗原可在施給對象後引發殺菌性抗奈瑟球菌抗體。本發明的組合物可包含NhhA抗體。NhhA抗原作為基因NMB0992包括在奈瑟球菌B血清組菌株MC58[121]的出版的基因組序列中(GenBank登錄號GI =7226232 ;本文的SEQID N0:27)。自從例如文獻122和127已出版了來自許多菌株的NhhA抗原序列，也已報導了許多NhhA的免疫原性片段。它也稱為Hsf。本發明所用的優選NhhA抗原包含某胺基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO :27具有50%或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或更高);和/或(b)包含SEQ IDN0:27的至少'n'個連續胺基酸的片段，其中'n'是7個或更多個(如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多個)。(b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:27的表位。本發明最有用的NhhA抗原可在施給對象後引起抗體，其能與胺基酸序列SEQ ID NO :27組成的腦膜炎多肽結合。有利的用於本發明的NhhA抗原可在施給對象後引發殺菌性抗腦膜炎抗體。本發明的組合物可包含App抗原。App抗原作為基因NMB1985包括在奈瑟球菌B血清組菌株MC58[121]的出版的基因組序列中(GenBank登錄號GI :7227246 ;本文的SEQID N0:28)。之後已出版了來自許多菌株的App抗原序列。已報導了許多App的免疫原性片段。本發明所用的優選App多肽包含某胺基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO : 28具有50%或更高的相同性(如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高);和/或(b)包含 SEQ ID N0:28 的至少,n'個連續胺基酸的片段，其中'n'是7個或更多個(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多個)。(b)的優選片段包含來自 SEQ ID NO:28的表位。本發明最有用的App抗原可在施給對象後引起抗體，其能與胺基酸序列SEQ IDNO 28組成的腦膜炎多肽結合。有利的用於本發明的App抗原可在施給對象後引發殺菌性抗奈瑟球菌抗體。本發明的組合物可包含0mp85抗原。0mp85抗原作為基因NMB0182包括在奈瑟球菌B血清組菌株MC58[121]的出版的基因組序列中(GenBank登錄號GI =7225401 ;本文的SEQ ID NO :29)。之後已出版了來自許多菌株的0mp85抗原序列。0mp85的其它信息可見文獻128和129。已報導了許多0mp85的免疫原性片段。本發明所用的優選Omp抗原包含某胺基酸序列，該序列(a)與SEQ ID N0:29具有50%或更高的相同性(如60%、65%、70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID N0:29的至少'n'個連續胺基酸的片段，其中'n'是7 個或更多個(如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多個)。(b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:29的表位。本發明最有用的0mp85抗原可在施給對象後引起抗體，其能與胺基酸序列SEQ ID NO :29組成的腦膜炎多肽結合。有利的用於本發明的0mp85抗原可在施給對象後引發殺菌性抗奈瑟球菌抗體。本發明的組合物可包含936抗原。936抗原作為基因NMB2091包括在腦膜炎B血清組菌株MC58[130]的出版的基因組序列中(本文的SEQ ID NO :22)。本發明所用的優選 936抗原包含某胺基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO :22具有50%或更高的相同性(如60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%、99. 5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID N0:22的至少'n'個連續胺基酸的片段，其中'n'是 7 個或更多個(如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多個)。(b)的優選片段包含來自SEQ ID NO :22的表位。本發明最有用的936抗原可在施給對象後引起抗體，其能與胺基酸序列SEQ ID NO :22組成的腦膜炎多肽結合。936抗原是fHBP的良好融合伴侶(例如見文獻119和120)。這些抗原優選以基本純或基本分離的形式(即基本不含其它奈瑟球菌或宿主細胞多肽)或基本分離的形式製備。一般來說，在非天然發生環境中提供所述多肽，例如，將其從非天然發生環境中分離出。在一些實施例中，目標多肽存在於相對於對照該多肽富集的組合物中。照此提供純化多肽，其中純化指所述多肽存在於基本不含其它表達多肽的組合物中，其中基本不含指所述組合物少於90%、通常少於60%、更加通常少於50%的部分由其它表達多肽構成。術語「多肽」指任何長度的胺基酸聚合物。所述聚合物可以是線性或支鏈聚合物，可以包含經修飾的胺基酸，可以被非胺基酸打斷。該術語也包括天然方式或通過人工介入修飾的胺基酸聚合物；例如，ニ硫鍵形成、糖基化、脂化、こ醯化、磷酸化或任何其它操作或修飾，如與標記組分偶聯。該定義也包括，例如，含有一個或多個胺基酸類似物(包括例如，非天然胺基酸等)，以及本領域已知的其它修飾。多肽可以以單鏈或結合鏈的形式產生。本發明組合物可包括來自腦膜炎球菌血清組A、C、W135和Y中1、2、3或4種的偶聯的莢膜糖抗原。現有的血清組C 疫苗(Menjugate [131]，Meningitec11^P NeisVac-C )含有偶聯糖。Menjugate 和Meningitec 具有與CRM197載體偶聯的寡糖抗原，而NeisVac-C 使用的是與破傷風類毒素載體偶聯的完整多糖(去-O-こ醯化)。Menactra 疫苗含有血清組Y、W135、C和A各組的偶聯莢膜糖抗原。本發明中的組合物可以包含腦膜炎球菌血清組Y、W135、C和A中一組或多組的莢膜糖抗原，其中所述抗原與載體蛋白偶聯且/或其為寡糖。例如，所述組合物可以包含來自以下的莢膜糖抗原血清組C;血清組A和C;血清組A、C和W135 ;血清組A、C和Y ;血清組C、W135和Y ;或血清組A、C、W135和Y全部四組。每劑量各腦膜炎球菌糖抗原的通常量為I μ g_20l·! g，例如，約I μ g、約2. 5μ g、約4 μ g、約5 μ g或約10 μ g(以糖表達)。在混合物包含血清組A和C的莢膜糖吋，MenA糖與MenC糖的比例(w/w)可以大於1(例如，2 1、3 1、4 1、5 : 1、10 : I或更高)。在混合物包含血清組Y與血清組C和W135中一組或兩組的莢膜糖時，MenY糖和MenW135糖的比例(w/w)可以大於I (例如，2 : 1、3 : 1、4 1、5 UlO I或更高)，且/或MenY糖和MenC糖的比例(w/w)可以小於I (例如，I : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5或更低)。血清組A C W135 Y的糖的優選比例(w/w)為1 : I : I : I ;1 : I : I : 2 ;2 : I : I : I ;4 : 2 : I : I ;8 : 4 : 2 : I ; 4 2 I 2 ；8 4 I 2 ；4 2 2 I ；2 2 I I ；4 4 2 I ；2 : 2 : I : 2 ;4 : 4 : I : 2 ;和2 : 2 : 2 : I。血清組C W135 Y的糖的優選比例(w/w)為1 : I : I ;1 : I : 2 ;1 : I : I ;2 : I : I ;4 : 2 : I ;2 : I : 2 ;4 : I : 2 ;2 : 2 : I ;和2 : I : I。優選使用質量基本相等的各種糖。使用的莢膜糖可以是寡糖形式。通過對純化莢膜多糖進行片段化(例如通過水解)可以方便地形成寡糖，片段化後通常要純化所需大小的片段。可進行多糖的片段化，以使寡糖的平均聚合程度(DP)最終小於30(例如，血清組A為10到20，優選約10 ;血清組W135和Y為15到25，優選約15-20 ;血清組C為12到22等)。可通過離子交換色譜或比色測定方便地測定DP[132]。如果進行水解，通常對水解產物進行篩分，以去除短鏈寡糖。可用各種方法如超濾後進行離子交換色譜達到此目的。對血清組A來說，優選去除聚合程度小於或等於約6的寡糖；對血清組W135和Y來說，優選去除聚合程度小於4左右的寡糖。參考文獻131描述了 Menjugate 中使用的優選MenC糖抗原。所述糖抗原可以經化學修飾。這對降低血清組A的水解特別有用[133 ;見下文]。可以進行腦膜炎球菌糖的脫-O-こ醯化。對寡糖的修飾可以在解聚之前或之後進行。本發明中的組合物包含MenA糖抗原時，優選所述抗原為天然糖上有ー個或多個羥基被封閉基團取代的修飾糖[133]。該修飾可以改善耐水解性。本發明組合物中的莢膜糖通常會與載體蛋白偶聯。通常，偶聯可以增強糖的免疫原性，因為偶聯可以將糖由T-非依賴性抗原轉變為T-依賴性抗原，由此允許免疫記憶的引發。偶聯對兒科疫苗特別有用，是ー項眾所周知的技木。典型的載體蛋白是細菌毒素，如白喉或破傷風毒素，或者其類毒素或突變體。可以使用CRM197白喉毒素突變體[134]，其為PREVNAR 產品中的載體。其他合適的載體蛋白包括，腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[135]、合成肽[136，137]、熱激蛋白[138，139]、百日咳蛋白[140，141]、細胞因子[142]、淋巴因子[142]、激素[142]、生長因子[142]、含有各種病原體衍生抗原的多種人⑶4+T細胞表位的人造蛋白[143]如N19[144]、流感嗜血桿菌的D蛋白[145-147]、肺炎球菌溶血素[148]或其無毒衍生物[149]、肺炎球菌表面蛋白PspA[150]、鐵攝取蛋白[151]、艱難梭菌(C. difficile)的毒素A或B[152]、重組金黃色葡萄球菌胞外蛋白 A(rEPA) [153]等等。
可採用任何合適的偶聯反應，必要時採用任何合適的接頭。一般在偶聯前活化或官能化所述糖。活化可包括例如用氰化試劑如CDAP(如I-氰基-4-ニ甲基氨基四氟硼酸吡啶[154，155等])。其它合適的技術採用碳ニ亞胺、醯肼、活性酷、降冰片烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S-NHS、EDC、TSTU等。可用任何已知方法，如參考文 獻156和157所述的方法通過接頭基團進行連接。ー種連接類型包括多糖的還原性胺化，將得到的氨基與己ニ酸接頭基團的一端偶聯，然後將蛋白質偶聯於該己ニ酸接頭基團的另一端[158，159]。其它接頭包括B-丙醯胺基[160]、硝基苯基-こ基胺[161]、滷代醯基滷化物[162]、配糖鍵[163]、6_氨基己酸[164]、ADH[165]、C4-C12部分[166]等。作為採用接頭的替代方法，可以採用直接連接。直接連接蛋白質可包括氧化多糖，然後與蛋白質進行還原性胺化，如參考文獻167和168所述。優選包括以下步驟的方法將氨基引入到糖中(例如用-NH2取代末端=O基團)，然後用己ニ酸ニ酯(例如己ニ酸N-羥基琥珀醯亞胺基ニ酷)衍生後，與載體蛋白反應。另一種優選的反應採用將CDAP與蛋白D載體進行活化，例如用於MenA或MenC。非腦膜炎球菌抗原組合物可包括非腦膜炎球菌抗原，例如來自非腦膜炎球菌病原體，如細菌或病毒的抗原。因此，組合物可以包括ー種或多種下列其它抗原-來自肺炎鏈球菌的糖抗原-來自A型肝炎病毒如滅活病毒的抗原-來自こ型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原-白喉抗原，如白喉類毒素-破傷風抗原，如破傷風類毒素-來自百日咳博德特菌(Bordetellapertussis)的抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，也可任選與百日咳桿菌黏附素(百日咳桿菌粘附素)和/或凝集原2和3的組合-來自こ型流感嗜血桿菌的糖抗原-脊髓灰質炎抗原如IPV-來自黏膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhal is)的抗原-來自無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae) (B組鏈球菌)的蛋白質和/或糖抗原-來自嗜熱鏈球菌(Streptococcuspyogenes) (A組鏈球菌)的抗原-來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抗原所述組合物可以包含ー種或多種這些其它抗原。必要時，可使有毒的蛋白質抗原脫毒(如通過化學和/或遺傳方式使百日咳毒素脫毒)。在所述組合物中包含白喉抗原時，也優選包含破傷風抗原和百日咳抗原。相似地，在包含破傷風抗原時，也優選包含白喉和百日咳抗原。相似地，在包含百日咳抗原時，也優選包含白喉和破傷風抗原。因此，優選DTP組合。糖抗原優選偶聯物形式。上文中更詳細地討論所述偶聯物的載體蛋白。所述組合物中各抗原的濃度一般是至少I μ g/ml。通常，任何給定抗原的濃度將足以弓I發針對該抗原的免疫反應。免疫除提供上述免疫原性組合物外，本發明還提供ー種在哺乳動物中引起抗體應答的方法，包括將本發明的免疫原性組合物給予所述哺乳動物。所述抗體應答優選地為保護性和/或殺菌性抗體應答。本發明也提供這類方法中所用的本發明組合物。
本發明還提供了一種保護哺乳動物免受奈瑟球菌(例如腦膜炎奈瑟球菌)感染的方法，包含將本發明中的免疫原性組合物給予所述哺乳動物。本發明提供用作藥物(例如，用作免疫原性組合物或疫苗)的本發明組合物。本發明還提供本發明囊泡在製備防止奈瑟球菌(例如腦膜炎球菌)感染哺乳動物的藥物中的應用。所述哺乳動物優選人。所述人可以是成人，或優選是兒童。當預防性使用疫苗吋，人優選為兒童(如幼童或嬰兒)；當疫苗用於治療用途時，人優選為成人。準備給予兒童的疫苗也可給予成年人，例如用以評估安全性、劑量、免疫原性等。所述用途和方法特別適用於防止/治療包括但並不限於腦膜炎(特別是細菌性的腦膜炎，如腦膜炎球菌性腦膜炎)和菌血症的疾病。治療性措施的功效可以通過在給予本發明中的組合物後對奈瑟球菌感染進行監測來測試。可通過監測在施用組合物後針對fHBP或其它抗原的免疫應答測試預防性治療的效力。本發明組合物的免疫原性可以通過給予受試對象(例如，12-16個月大的兒童或動物模型[169])，然後測定標準參數，包括血清殺菌抗體(SBA)和ELISA效價(GMT)來進行測定。通常在給予該組合物後約4周測定這些免疫應答，並與給予該組合物之前測定的值作比較。優選至少4倍或8倍的SBA增長。給予ー個以上劑量的組合物時，可以進行一次以上的給藥後測定。本發明中的優選組合物可以在患者體內產生優於可接受百分比的人對象各抗原組分血清保護標準的抗體效價。具有相關抗體效價的抗原是眾所周知的，高於該效價就認為宿主針對所述抗原發生血清轉化，該類效價由如WHO —類的組織公布。優選多於80%的具有統計學顯著性的對象樣品發生血清轉化，更優選多於90%，更優選多於93%，最優選96-100%。本發明的組合物通常直接給予患者。可以通過胃腸外注射(例如，皮下、腹膜內、靜脈內、肌肉內或給予到組織間隙)，或通過直腸、ロ服、陰道、外用、透皮、鼻內、眼部、耳部、肺部或其它黏膜給藥途徑完成直接遞送。優選在大腿或上臂進行肌肉內給藥。注射可以通過針頭(例如皮下針頭)進行，但也可以採用無針注射。通常的肌肉內劑量為約O. 5ml。本發明可用來引發全身和/或黏膜免疫。劑量治療可採用單劑量方案或多劑量方案。多劑量可以用於初次免疫方案和/或加強免疫方案。初次給藥方案之後，可以進行加強給藥方案。可以通過常規方法確定初次劑量之間(例如4-16周)以及初次和加強劑量之間的適當時機。殺菌應答優選的免疫原性組合物可以弓I發對腦膜炎球菌具有殺菌作用的抗體應答。可以方便地測定小鼠的殺菌性抗體應答，其為疫苗功效的標準指標[例如，見參考文獻170的尾注14]。本發明組合物可以優選地引發對來自下列三個菌株組中至少兩組的每組的至少ー種腦膜炎奈瑟球菌菌株具有殺菌作用的抗體應答(I)MC58、gbl85( = M01-240185)、m4030、m2197、m2937、isslOOl、NZ394/98、67/00,93/114, bzl98、ml390、nge28、lnpl7592、00_241341、f6124、205900、ml98/172、bzl33、gbl49( = M01-240149)、nm008、nm092、30/00、39/99、72/00、95330、bzl69、bz83、cu385、h44/76、ml590、m2934、m2969、m3370、m4215、m4318、n44/89、14847。(II)961-5945、2996、96217、312294、11327、 a22、 gb013( = M01-240013)、 e32、ml090、m4287、860800、599、95N477、90-18311、cll、m986、m2671、1000、ml096、m3279、bz232、dk353、m3697、ngh38、L93/4286。(III)M1239,16889，gb355 ( = M01-240355)，m3369, m3813, ngpl65。例如，組合物可以引發對血清組B腦膜炎奈瑟球菌菌株MC58、961-5945和M1239中的兩個或三個菌株有效的殺菌反應。組合物可以優選地引發對至少50% (例如，60%、70%、80%、90%、95%或更多)的臨床相關腦膜炎球菌血清組B菌株具有殺菌作用的抗體應答。所述組合物可引發抗體應答，其對B血清組的腦膜炎奈瑟球菌以及血清組A、C、W135和Y中的至少ー組(例如1、2、
3、4)的菌株具有殺菌性。所述組合物可引起對淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)和/或灰色奈瑟球菌(N. cinerea)菌株具有殺菌性的抗體應答。所述組合物可以引發對來自參考文獻2中圖5所示的系統樹的三條主分枝中的至少兩條分枝的菌株具有殺菌作用的反應。組合物可以引發對超毒カ譜系ET-37、ET_5、A4簇、譜系3、亞組I、亞組III和亞組IV-I中至少2個(例如，2、3、4、5、6、7)譜系的腦膜炎奈瑟球菌菌株具有殺菌作用的抗體應答[171，172]。組合物還可以誘導對一個或多個高侵襲性譜系的殺菌性抗體應答。組合物可以引發對下列多基因座序列類型中至少2個(例如，2、3、4、5、6、7)類型的腦膜炎奈瑟球菌菌株具有殺菌作用的抗體應答ST1、ST4、ST5、ST8、STlU ST32和ST41[173]。所述組合物還可以引發對ST44菌株具有殺菌作用的抗體應答。所述組合物不需要誘導針對指定譜系或MLST中各個和每個MenB菌株的殺菌性抗體；相反，對具體超毒力譜系或MLST中更多個血清組B腦膜炎球菌菌株中的任何四個菌株的特定組來說，所述組合物誘導的抗體優選地對所述組的至少50% (例如，60%、70%、80%、90%或更多)具有殺菌作用。優選的菌株組包括下面的國家中至少四個所分離到的菌株:GB、AU、CA、NO、IT、US、NZ、NL、BR和CU。所述血清優選地具有至少為1024(例如，21Q、2n、212、213、214、215、216、217、218或更高，優選至少為214)的殺菌效價，即所述血清可以在以I 1024稀釋後殺死ー個特定菌株中至少50%的測試細菌，如參考文獻170的尾注14所述。優選的組合物可以引發小鼠中的抗體應答，甚至在血清以I : 4096稀釋或更稀時仍保持殺菌性。概述術語「包含」涵蓋「包括」以及「由……組成」，例如，「包含」X的組合物可以僅由X組成或可以包括其它物質，例如X+Y。與數值X相關的術語「約」是可選的並表示例如x±10%。術語「基本上」不排除「完全」，如「基本上不含」 Y的組合物可能完全不含Y。優選通過MPSRCH程序(牛津分子科技公司(Oxford Molecular))執行的Smith-Waterman同源性捜索算法，利用仿射缺ロ捜索測定「序列相同性」，參數為缺ロ開放、罰分=12,缺ロ延伸罰分=I。腦膜炎球菌分類在血清組之後包括血清型、血清亞型和免疫型，標準命名法包括血清組、血清型、血清亞型和免疫型，彼此之間由冒號隔開，例如B:4:P1. 15:L3，7，9。在血清組B中，一些譜系經常引起疾病(高侵襲性)，一些譜系引起比其它譜系更嚴重形式的疾病(超毒力)，其餘的很少引起疾病。識別出7個超毒カ譜系，即亞組I、III和IV-1、ET-5複合體、ET-7複合體、A4簇和譜系3。通過多座位酶電泳(MLEE)對這些進行了定義，但是也可以使用多座位序列分型(MLST)對腦膜炎球菌分類[參考文獻173]。4種主要的超毒力簇是ST32、ST44、ST8和STll複合體。附圖
簡要說明圖I顯示圍繞nmbl869基因的起始密碼子的基因組序列(SEQ ID NO 17)。圖2顯示圍繞fhbp基因的起始密碼子的基因組序列(SEQ ID NO 18)。
圖3顯示各種菌株中短和長fhbp轉錄物的northern印跡。圖4顯示多種菌株中三種不同蛋白的Western印跡。
具體實施例方式其它信息可由參考文獻174獲得。腦膜炎奈瑟球菌MC58菌株中fhbp基因座的分析fhbp基因側接於nmb 1869(果糖-雙磷酸醛縮酶)和nmbl871基因。轉錄終止子分析揭不出fhbp基因下遊Ilnt的Rho非依賴性終止子的典型莖環結構。在nmbl869和fhbp基因的GTG起始密碼子之間有157bp的基因間區。在nmbl869基因下遊20個核苷酸處的該基因間區中，存在另ー推定的Rho非依賴性轉錄終止子。這些有關基因座的初步觀察結果提示，fhbp基因可能轉錄成ー個基因並且不是操縱子成員。對MC58的總RNA進行RT-PCR分析顯示產生跨上遊基因間區、而不是下遊基因間區的擴增產物，這提示fhbp可與上遊nmbl869基因一起轉錄。對MC58野生型菌株、NMB1869無效突變體(Λ nmb 1869)和fhbp無效突變體(Afhbp)菌株的總RNA進行Northern印跡分析顯示出> 2000nt的長轉錄物,在野生型菌株中通過fhbp和nmbl869探針檢測到,但在兩個突變株中不存在。該轉錄物的預計大小與雙順反子信使的預計大小良好對應，並驗證了 nmbl869和fhbp基因的共同轉錄。還在野生型和Anmbl869突變菌株中檢測到剛好低於IOOOnt的較短fhbp特異性mRNA，這提示存在fhbp單順反子轉錄物。此外,雙順反子信使的轉錄被消除時Anmbl869突變體中存在這種較短轉錄物表明較短的fhbp轉錄物是因自身專用啟動子驅動的fhbp基因轉錄而來,而不是加工較長轉錄物的結果。此夕卜，nmb 1869探針在野生型菌株和fhbp無效菌株中檢測到 IlOOnt的較小的nmbl869特異性轉錄物，表明也產生nmbl869上遊基因的單順反子轉錄物。總之，這些結果表明兩種不同啟動子驅動nmbl869和fhbp基因座的三種不同mRNA轉錄物的合成。nmb 1869和fhbp基因由其專用啟動子轉錄到單順反子轉錄物上,但也由nmbl869上遊的啟動子驅動共同轉錄到雙順反子轉錄物上。較長的雙順反子轉錄物很可能由無效終止產生，導致NMB1869下遊轉錄終止子的通讀。由生長至對數中期的腦膜炎奈瑟球菌(N. meningitidis)培養物提取的總RNA進行引物延伸，以確定mRNA的啟動點。nmbl869-特異性引物與來自MC58的總RNA雜交，並用逆轉錄酶延長。主要延長產物從nmbl869轉錄物的Y末端到其起始密碼子上遊29個核苷酸的位置(圖I)。還用來自MC58和Λ 1869突變體的總RNA進行fhbp特異性引物延伸，該項工作從fhbp單順反子轉錄物的起點開始,到fhbp的起始密碼子上遊45個核苷酸的位置(圖2)。在每種情況下，延長引物上遊的核苷酸序列顯示存在類似於大腸桿菌(E. coli)σ 70依賴性啟動子的-10和-35六聚體的元件(圖I和2)。這些序列應限定腦膜炎奈瑟球菌(N. meningitidis)Pnmb 1869 和 Pfhbp 啟動子。 鑑定這兩個啟動子驅動 合成三條mRNA後，研究它們的調節機制。在不同氧氣條件下研究fhbp基因的表達情況。由生長至對數中期後接觸微好氧條件(+)或氧氣限制條件(-)30分鐘的野生型菌株和fnr無效突變體提取總RNA。進行Northern印跡分析，以分析兩種fHBP轉錄物的水平(圖3)。野生型在氧氣限制期間上調單順反子轉錄物(泳道2與泳道I)，但在fnr無效突變體中沒有這種現象(泳道3和4)，這表明在氧氣限制下FNR介導誘導。為了驗證FNR依賴性調節，採用在染色體的異源位點中表達ー個拷貝的fnr基因的突變體菌株。在這種Afnr_C菌株中，fhbp單順反子mRNA的上調在氧氣限制條件下恢復(泳道5和6)。此外，在氧氣限制條件下較長的雙順反子轉錄物的表達水平較低，但似乎不是FNR依賴性調節。組成型活性腦膜炎球菌FNR雖然參考文獻29已將fhbp基因鑑定為FNR調節子的可能成員，但它沒有提供實驗確認，並且沒有意識到兩種不同fhbp轉錄物的存在，其中只有ー種是FNR活化的。為了進ー步驗證FNR活化活性,產生FNR蛋白的組成型活性形式。已知可修飾大腸桿菌的FNR，以使其[4Fe_4S]簇是O2穩定的。實現此種穩定性的ー個突變是D148A，其中Asp-148 (例如，在SEQ ID NO :6中，大腸桿菌菌株CFT073)突變為Ala。FNR的推定ニ聚化結構域中發生此單胺基酸取代產生組成型活性蛋白，其可在氧氣存在下用作轉錄激活物[175]。大腸桿菌序列SEQ ID NO 6與腦膜炎球菌序列(SEQ ID NO 4)的比對為
SEQID4 MASHMTTHQMKT—----LCSSCSLRELOiPVGLLPMELSOLDAVlROSRRLKKGEYtrc 54
SEQID6· HIPEKRIIRRIQSGGCAIttCQDCSISQI.CIPFTl,NEHELOQLDNlIEMKPlQKGQTtrK 60
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SEQID^ VOEAFTSLFAIRSGFFKffWSQDGRIX}VTGFFMSGELIGMDGICSHVHSCD WALEDSE 114SEQID6MDEI,KSLraiESGTIKSrTITEQGOSQITCFfiLAGDLVGrDAIGSGHHP'SrAQALETSM 120
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SEQID 與 VCELPFfH lEELGaHlPSLRTMFFRMMSRElVRWVMLLLGNHM^EBlMFLLNLSaR 174 SEOX06 VCEIPFETLDDLSamPNLROOMMRLHSGEIKGDgDHILLLSKKNAEERLMFiyNLSRB ISQ
** * . # *. , , . ^ 龠知 ■* ·Λ ^ . ι * * * · ,4* 4-
SEQlM LYSEGF^KDFlIiRMSREElGSYLGLKLETVSRTLS^fBQEGLISVEHKHlKlMLQVLK 234
FhQmFsmETRhTmmmGmmhivETisBLLQBrQKsanhhmGKYijiEmuhLh 240
*■ ·* < # * * *夤#-,·· * Jk .★ t
SEQiD4i^vsgcshax 24 禮
SEQi os QLmmmm 2 so儘管這兩條序列的總體相同性低(40% )，大腸桿菌殘基D154(下劃線)也出現在腦膜炎球菌序列的殘基148處。利用定位誘變代替編碼腦膜炎球菌序列的Asp-148的密碼子，並用GCC丙氨酸密碼子代替它。該修飾基因和其編碼蛋白在下文中稱為「fnrD148A」。用紅黴素抗性盒取代整個編碼序列，以產生腦膜炎球菌的Afnr無效突變體[29]。為了補償fnr無效突變體，將Ptac啟動子控制下的野生型fnr或D148A突變體fnr基因整合到Afnr的染色體中會聚的ORF NMB1428和NMB1429之間，具體是分別用pCompInd-fnr 或 pCompInd_fnrD148A 轉化 Δ fnr 菌株。pCompInd-fnr 是 pCompInd 的衍生質粒，其中野生型fnr基因由MC58基因組擴增而來並作為732bp NdeI/NsiI片段克隆到Ptac啟動子下遊。pCompInd_fnrD148A質粒是編碼fnrD148A的pCompInd-fnr的衍生物。用QuickChange 試劑盒(司查塔基(Stratagene) )將突變引入pCompInd-fnr中。用pCompInd-fnr或pCompInd_fnrD148A質粒轉化Δ fnr菌株。而且，為了產生從突變基
因的整合拷貝表達FnrD148A蛋白的重組菌株，將pCompInd-fnrD148A質粒轉化到腦膜炎球菌分離物 H44/76、4243、F6124、M6190、LNP17592, M01-240345、NM117、LNP17094, B3937、M01-240013、M3153、5/99、BZ232、1000、0X99. 30304 中，產生各菌株的衍生物。為了轉化天然感受態的腦膜炎奈瑟球菌，將四個或五個新鮮培養過夜的單菌落重懸於20 μ I PBS,打點到GC瓊脂平板上，平板中加入5-10 μ g線性質粒DNA，乾燥，並於37°C孵育4-8小吋。然後，在含有合適抗生素的平板上選擇轉化子，將單菌落重新劃線於選擇性培養基以便進ー步分析。將單菌落重懸於50μ1 PBS，放入沸水浴中5分鐘，在臺式離心機中以最大速度離心5分鐘。I μ I樣品用作PCR分析模板，以矯正雙交換轉化子。利用在微好氧或氧氣限制條件下培養的補充有突變基因的FNR敲除菌株(Λ fnr_⑶148A)的總RNA進行Northern印跡分析，顯示即使在氧氣存在條件下，突變的FNR蛋白也能夠促進fhbp單順反子mRNA轉錄(圖3，泳道7和8)。因此，突變FNR以不依賴氧氣的方式驅動轉錄。敲除上遊nmbl869基因，從而消除雙順反子RNA信使的合成，不會影響單順反子轉錄物的FNR-氧氣-依賴性調控(圖3，泳道9和10)。總之，這些數據表明，在氧氣限制條件下由專用FNR活化啟動子誘導fhbp轉錄。還在菌株H44/76中研究fhbp基因的轉錄和調節。該項工作也顯示兩條fhbp轉錄物，並在野生型菌株中驗證fhbp單順反子mRNA因氧氣限制而上調，還因組成型活性FNR突變蛋白的表達而上調(圖3，泳道11-14)。利用Western印跡分析將FNR轉錄調節與所有菌株中總蛋白水平相關聯。在微好氧條件下，由新鮮培養的過夜平板培養物製備總蛋白提取物，用針對NMB1869、fHBP和FNR蛋白的特異性抗體進行免疫印跡。如圖4所示，fHBP表達在表達FNR的組成型活性形式的Λ fnr_CD148A和H44/76_CD148A菌株中明顯增加(泳道4和8)，與微好氧條件下的Northern結果相關聯。而且，與野生型菌株中的FNR表達相比，重組菌株中由異源Ptac啟動子表達的各FNR蛋白等位基因過度表達，但只有D148A突變體能誘導fHBP的過度表達。這些數據強烈支持FNR活性，而不是其高表達在促進fHBP表達中的重要性。將編碼野生型和突變體FNR蛋白(fnr和fnrD148A基因)的基因克隆到pET15b表達載體中，以便在大腸桿菌中重組表達。表達這些蛋白，依靠N末端組氨酸標籤用Ni2+-親和色譜純化。
檢測兩種重組蛋白與aniA啟動子的體外結合活性。該啟動子已在腦膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌上通過DNA微陣列和DNA結合研究良好鑑定，在氧氣限制期間它在FNR的直接控制下[28，29，176]。含有MC58的aniA啟動子的特異性探針與濃度遞增的重組蛋白一起培育，然後進行DNA酶I消化。加入13nM FNRD148A蛋白導致完全保護相對於轉錄起始位點跨-30至-50且含有aniA預測的FNR-框共有序列的DNA區域。然而在這些條件下，野生型蛋白質不產生保護作用。因此，該突變體在有氧條件下有結合DNA的組成型活性，並結合預測的FNR-框。加入I μ M FnrD148Α能保護相對於Pfhbp的轉錄起始位點跨-28位至-50位，因而重疊-35啟動子元件的核苷酸。對啟動子序列進行分析掲示出存在正好重疊-35六聚體的推定FNR-框TTGAC-N4-CTCAT (SEQ ID NO: 16)。該序列與大腸桿菌FNR框共有序列(SEQID NO 19)相比有三個核苷酸不同。這些數據表明FNR結合fhbp啟動子區，以促進fHBP蛋白的轉錄和表達。
在多種菌株中進行研究也在其它腦膜炎球菌菌株中研究fHBP蛋白表達的FNR依賴性調節，這些菌株來自地理多變來源並代表與疾病相關的主要克隆集合體。在不同fHBP家族的菌株上進行初歩Western印跡分析。所有菌株均表達fHBP抗原，但是如前所述[2]，菌株間的表達水平不同。利用已經用於產生MC58 Δ fnrC_D148A菌株的相同構建物製備表達組成型活性FNR的等基因突變體菌株。對獲得的轉錄物和其野生型進行Western印跡分析。在這些突變體菌株中，內源性fnr基因沒有滅活。轉化菌株的FNR蛋白表達水平高於野生型，驗證了轉化的成功。而且，重組菌株也過度表達fHBP蛋白。唯一的例外是匪117菌株。雖然它過度表達FNR，但它不顯著過度表達fHBP。對Pfhbp啟動子測序，雖然FNR框完全保守，但-10啟動子元件相對於MC58序列具有2個突變，顯示不大可能用作高效-10元件的TACCGC序列(SEQ ID NO 15)。總之，這些結果表明fhbp基因的FNR依賴性調節不限於MC58和H44/76菌株。囊泡產生如上所述，編碼由其天然啟動子(啟動的)fhbp的菌株表達FNR的組成型活性形式吋，它們過度表達fHBP。因此，相對於相應野生型菌株製備的囊泡，理想情況下不使用去汙劑[25，44]由這些菌株製備的囊泡富含fHBP。這些囊泡可用於產生抗-腦膜炎球菌免疫力。各自具有不同家族fHBP的這類囊泡的ニ價或三價混合物可用於增加覆蓋譜。在其它實施方式中，工程改造表達組成型活性FNR的腦膜炎球菌，以表達兩種或三種fHBP變體，以使來自該菌株的囊泡已經是fHBP ニ價或三價。可通過染色體的不同位點上整合、但各自在FNR激活的啟動子控制下的外源基因単獨表達不同變體。應理解，僅以舉例的方式描述了本發明，可對之進行修改而仍在本發明的範圍和精神內。參考文獻[l]W099/57280.[2]Masignani 等(2003) J Exp Med 197 :789-799.[3]Welsch 等(2004) J Immunol 172:5605-15.[4]Hou 等(2005) J Infect Dis 192(4) :580-90.
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權利要求
1.一種腦膜炎球菌，其(a)具有其轉錄處於FNR激活的啟動子控制下的基因，和(b)表達FNR的組成型活化形式。
2.如權利要求I所述的腦膜炎球菌，其特徵在於，所述轉錄在FNR激活的啟動子控制下的基因是fhbp。
3.一種製備腦膜炎球菌突變體的方法，包括(a)修飾其內源性fnr基因，以使編碼的FNR蛋白組成型活化，或(b)引入編碼FNR的組成型活性形式的基因的步驟。
4.一種製備脂蛋白體腦膜炎球菌囊泡的方法，該方法包括處理權利要求I或2所述的或可通過權利要求3所述方法獲得的腦膜炎球菌的步驟，以破壞其外膜，從而由其形成包含外膜的蛋白質組分的囊泡。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述脂蛋白體腦膜炎球菌囊泡包含fHBP。
6.如權利要求4或5所述的方法，其還包括從任何活的和/或完整的細菌分離所述囊泡的步驟。
7.一種腦膜炎球菌，其表達FNR的組成型活性形式。
8.如前述任一項權利要求所述的腦膜炎球菌或方法，其特徵在於，所述腦膜炎球菌不表達活性LpxLl酶。
9.如前述任一項權利要求所述的腦膜炎球菌或方法，其特徵在於，所述腦膜炎球菌是高出泡腦膜炎球菌。
10.一種腦膜炎球菌FNR的組成型活性形式。
11.一種製備免疫原性組合物的方法，所述方法包括將權利要求4-6中任一項所述方法製備的囊泡與下述物質配製在一起的步驟藥學上可接受的運載體；和/或免疫佐劑；和/或一種或多種其它免疫原性組分。
12.如前述任一項權利要求所述的腦膜炎球菌、方法或FNR，其特徵在於，所述FNR的組成型活性形式具有突變D148A。
13.ー種核酸，其編碼權利要求10或12所述的FNR。
14.ー種包含權利要求13所述核酸的載體。
15.—種包含權利要求14所述的載體的宿主細胞。
全文摘要
在天然情況下，腦膜炎球菌fhbp基因(編碼H因子結合蛋白)在兩種差異調控的啟動子控制下，由兩種獨立轉錄物表達。在一個轉錄物中，它與相鄰上遊基因由Pnmb1869啟動子共同表達。另一轉錄物是單順反子，由其自身專用啟動子Pfhbp表達，該表達由全局調控蛋白FNR應氧氣限制條件而激活。為了提高單順反子轉錄物的表達，採用組成型活性FNR突變體。因此可激活Pfhbp啟動子，導致FNR-激活基因如fhbp的過度表達。
文檔編號A61K35/74GK102724988SQ201080049678
公開日2012年10月10日 申請日期2010年9月30日 優先權日2009年9月30日
發明者F·奧裡恩特, I·德萊尼 申請人:諾華有限公司