腫瘤蛋白p185檢測試劑盒的製作方法

2023-08-06 04:14:36

腫瘤蛋白p185檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種腫瘤蛋白P185檢測試劑盒，其包括腫瘤蛋白P185單克隆抗體、酶標板、陽性對照品、陰性對照品、洗滌液、終止液、辣根過氧化物酶-鏈親和素及其顯色底物，所述的腫瘤蛋白P185單克隆抗體包括包被在酶標板上的腫瘤蛋白P185單克隆抗體和生物素標記的腫瘤蛋白P185單克隆抗體，採用本發明的腫瘤蛋白P185檢測試劑盒可以有效、穩定地測定人體血清中的腫瘤蛋白P185水平，其靈敏度和精密性高，測試重複性好。
【專利說明】腫瘤蛋白P185檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物學和醫學檢驗領域，具體是涉及一種腫瘤蛋白P185檢測試劑盒。【背景技術】
[0002]P185是由癌基因HER-2/neu編碼的一種重要的腫瘤表面標記蛋白，在乳腺、卵巢、肺、胃、肝等十餘種癌症患者中均顯示有過量表達，P185過量表達的患者腫瘤惡性程度高，術後易發生轉移和復發，並且對化療藥物治療具有抗性，因此檢測腫瘤抗原P185的表達水平，對多種腫瘤的鑑別診斷、分類預示療效以及治療方案的選擇均有重要意義，尤其是乳腺癌，P185已是國際公認的一個重要的臨床指標。與檢測腫瘤組織中腫瘤蛋白P185的表達相比，檢測病人血清中腫瘤蛋白P185的表達簡便易行，適合臨床需要，但是目前國內尚未建立檢測患者的血清中P185的試劑盒，因此研發出高靈敏性、高特異性及穩定性的P185檢測試劑盒，用於乳腺、卵巢、肺、胃、肝等十餘種癌症血清中P185的檢測，這對上述腫瘤的篩查、診斷與治療具有重要意義。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供一種腫瘤蛋白P185檢測試劑盒，該檢測試劑盒精密性高、穩定性好。
[0004]為實現上述目的，本發明採用的技術方案是:一種腫瘤蛋白P185檢測試劑盒，其特徵在於:包括腫瘤蛋白P185單克隆抗體、酶標板、陽性對照品、陰性對照品、洗滌液、終止液、辣根過氧化物酶-鏈親和素及其顯色底物，所述的腫瘤蛋白P185單克隆抗體包括包被在酶標板上的腫瘤蛋白P185單克隆抗體和生物素標記的腫瘤蛋白P185單克隆抗體。
[0005]更為具體的方案為:所述的包被在酶標板上的腫瘤蛋白P185單克隆抗體為腫瘤蛋白P185單克隆抗體2Dn，所述的生物素標記的腫瘤蛋白P185單克隆抗體為腫瘤蛋白P185單克隆抗體3F9，腫瘤蛋白P185單克隆抗體2Dn、3F9的製備步驟如下:
[0006]a)以NIH/3T3細胞1.p免疫第一批6?8周的Balb/C雌鼠，得到雌鼠的抗NIH/3T3血清；
[0007]b)收集長至匯合的T6-17細胞，用PBS緩衝液洗三次，將上述製備的抗NIH/3T3抗血清用PBS緩衝液以1:20?100稀釋，然後取2ml加入T6-17細胞中，在4°C條件下溫育過夜，期間晃動盛放T6-17細胞的試管8-10次，然後再用PBS緩衝液洗三次，得到懸浮於PBS緩衝液中的T6-17細胞；
[0008]c)用上述懸浮於PBS緩衝液中的T6-17細胞1.P免疫第二批6_8周的BaLb/C雌鼠，然後取雌鼠的脾細胞製成細胞懸液；
[0009]d)將步驟c得到的細胞懸液與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合；
[0010]e)用ELISA法從上述融合的細胞中篩選出分泌腫瘤蛋白P185單克隆抗體的雜交瘤細胞，採用有限稀釋法對雜交瘤細胞進行克隆化，從而得到兩株具有穩定分泌腫瘤蛋白P185單克隆抗體能力的雜交瘤細胞株，分別命名為雜交瘤細胞株2Dn、雜交瘤細胞株3F9。[0011]所述的洗滌液是由28.8g 的 Na2HP04.12H20、80g 的 NaCl、3.9g 的 NaH2P04.2Η20和50ml的Tween-20加入純化水溶解定容至100000ml所得。
[0012]所述的顯色底物包括顯色液A和顯色液B，所述的顯色液A是用檸檬酸緩衝液將30%過氧化氫稀釋1000倍所得，所述的顯色液B為用含20% 二甲基亞碸的檸檬酸緩衝液將四甲基聯苯胺配製成0.4mg/ml所得。
[0013]所述的終止液是濃度為2mol/L的硫酸溶液。
[0014]所述的陽性對照品、陰性對照品分別為人體的P185陽性血清、P185陰性血清。
[0015]本發明在常規酶聯免疫吸附試驗的基礎上，通過生物素與辣根過氧化物酶-鏈親和素之間的高度放大作用，建立了一種高靈敏度生物素-親和素-酶聯免疫檢測試劑盒，以測定待測樣中的腫瘤蛋白P185表達水平。親和素是卵白蛋白中提取的一種鹼性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個亞單位組成，對生物素有非常高的親和力，其結合常數高達ΙΟΙδΜ—1 ；所述的生物素很易與抗體等蛋白質以共價鍵結合，這樣結合有酶的辣根過氧化物酶-鏈親和素分子與結合有特異性抗體的生物素分子產生反應，既起到了多級放大作用，又由於酶在遇到相應的顯色底物時發生催化作用而呈色，從而達到檢測目標抗原或抗體分子的目的，採用本發明的腫瘤蛋白Ρ185檢測試劑盒可以有效、穩定地測定人體血清中的腫瘤蛋白Ρ185水平，其靈敏度高，測試重複性好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1、2是腫瘤蛋白單克隆抗體2Dn和3F9純化前後的SDS-PAGE分析結果；
[0017]圖3是腫瘤蛋白單克隆抗體2Dn識別抗原的SDS-PAGE及Western blot分析結果;
[0018]圖4是四個腫瘤標本的免疫組織化學染色示意圖。
【具體實施方式】
[0019]以下對腫瘤蛋白P185檢測試劑盒的製備、使用步驟以及使用效果做進一步的說明:
[0020]1、腫瘤蛋白P185檢測試劑盒的製備
[0021]I)常規器材及試劑的準備:
[0022]96孔酶標板、P185陽性血清、P185陰性血清、洗滌液、終止液、辣根過氧化物酶-鏈親和素以及顯色液A、顯色液B，其中P185陽性血清和P185陰性血清的符合率達100%。
[0023]2)腫瘤蛋白P185單克隆抗體的製備:
[0024]a)收集NIH/3T3細胞1.p免疫第一批6?8周的Balb/C雌鼠，NIH/3T3細胞的每次使用劑量為IO7/只，每隔兩周一次，三次後從雌鼠尾部取血，用ELISA法測血清滴度，將滴度最高的雌鼠再用同量的NIH/3T3細胞進行1.P免疫，七天後從該雌鼠的眼窩取血，即得雌鼠的抗NIH/3T3血清；
[0025]b)收集長至匯合的T6-17細胞，採用PBS緩衝液(即磷酸鹽緩衝液)洗三次，所述的T6-17細胞為轉染Her-2/neu癌基因的NIH/3T3細胞，其膜表面高表達腫瘤蛋白P185，將上述製備的抗NIH/3T3血清用PBS緩衝液以1:50的比例稀釋，然後取2ml加入T6-17細胞中，在4°C條件下溫育過夜，期間晃動盛放T6-17細胞的試管9次以使細胞懸浮，然後再用PBS緩衝液洗三次，得到懸浮於PBS緩衝液中的T6-17細胞；
[0026]c)用上述懸浮於PBS緩衝液中的T6-17細胞1.P免疫第二批6_8周的BaLb/C雌鼠，劑量為IO7/小隻，在第I周、第3周和第6周各一次，第7周從雌鼠的尾部取血，用ELISA法測血清滴度，將滴度最高的雌鼠再用同量的T6-17細胞1.P免疫，三天後取該雌鼠的脾細胞製成細胞懸液；
[0027]d)將步驟c得到的細胞懸液與骨髓瘤細胞SP2/0混合，並在融合劑PEG的作用下進行細胞融合，所述的骨髓瘤細胞SP2/0由中國科學院上海細胞庫提供；
[0028]e)用ELISA法從上述融合的細胞中篩選出分泌腫瘤蛋白P185單克隆抗體的雜交瘤細胞，採用有限稀釋法對雜交瘤細胞進行克隆化，從而得到兩株具有穩定分泌腫瘤蛋白P185單克隆抗體能力的雜交瘤細胞株，分別命名為雜交瘤細胞株2Dn和雜交瘤細胞株3F9，
[0029]f)將雜交瘤細胞株2Dn和3F9分別注入不同的雌鼠體內，收集腹水,採用ProteanA親和層析法將腹水中的抗體純化即得腫瘤蛋白P185單克隆抗體2Dn和3F9，純化抗體的方法也可以採用聚乙二醇沉澱法等常規的方法，如圖1和2所示為腫瘤蛋白P185單克隆抗體2Dn和3F9純化前後的SDS-PAGE分析結果，其中第I泳道為腫瘤蛋白P185單克隆抗體純化前的SDS-PAGE分析結果，第2泳道為腫瘤蛋白P185單克隆抗體純化後的SDS-PAGE分析結果，從圖中可以看出純化後的腫瘤蛋白P185單克隆抗體2Dn和3F9僅存一條帶，說明腫瘤蛋白P185單克隆抗體2Dn和3F9已被純化，如圖3所示為腫瘤蛋白單克隆抗體2Dn識別抗原的SDS-PAGE及Westernblot分析結果，其中第I泳道為T6-17細胞的培養上清中腫瘤蛋白P185的SDS-PAGE分析結果，其顯示僅存一條帶，說明T6-17細胞的膜表面高表達P185，圖3中的第2泳道為本發明製備的腫瘤蛋白P185單克隆抗體2D11與T6-17細胞的培養上清中腫瘤蛋白P185的WEST-BL0T分析結果，其顯示也僅有一條帶，說明兩者有明顯的特異性反應。
[0030]3 )包被96孔酶標板:
[0031]採用直接吸附法，用pH為9.6的PBS緩衝液將上述製備的腫瘤蛋白P185單克隆抗體2D11稀釋至20?ΙΟΟμ g/ml，按100 μ I/孔的加入量加於96孔酶標板中，在溫度為2?8°C的條件下放置過夜，然後用洗滌液洗滌，甩幹，即得包被有腫瘤蛋白P185單克隆抗體2Dn的96孔酶標板。
[0032]4)生物素化腫瘤蛋白P185單克隆抗體3F9:
[0033]將上述製備的腫瘤蛋白P185單克隆抗體3F9與活化的生物素混合進行標記，透析去除未結合的生物素，即得生物素標記的腫瘤蛋白P185單克隆抗體3F9。
[0034]2、腫瘤蛋白P185檢測試劑盒的使用步驟如下:
[0035]I)加樣:
[0036]在包被有腫瘤蛋白P185單克隆抗體2Dn的96孔酶標板上劃分陽性對照孔、陰性對照孔、待測樣品孔和空白孔共四組檢測孔，陽性對照孔中加入P185陽性血清，陰性對照孔中加入P185陰性血清，待測樣品孔中加入待測血清，三種樣品的加入量均為ΙΟΟμ I/孔，然後在酶標板上加蓋或者覆膜，在37°C條件下放置2h後棄去液體，用洗滌液洗滌，甩幹；
[0037]2)加生物素標記的腫瘤蛋白P185單克隆抗體3F9:
[0038]每個檢測孔中加入ΙΟΟμ I生物素標記的腫瘤蛋白Ρ185單克隆抗體3F9，在37°C條件下放置Ih後棄去液體,每個檢測孔中加入350 μ I洗漆液浸泡I?2min,甩幹或輕輕地拍幹，洗滌、甩幹的動作重複3次；
[0039]1、加辣根過氧化物酶-鏈親和素:
[0040]每個檢測孔中加入100 μ I的辣根過氧化物酶-鏈親和素,在37°C條件下放置Ih後棄去液體,每個檢測孔中加入350 μ I洗漆液浸泡I?2min,甩幹或輕輕地拍幹,洗漆、甩幹的動作重複5次；
[0041]3)加顯色底物:
[0042]在每個檢測孔中依次加入顯色液A、顯色液B各一滴，在37°C條件下避光，顯色；
[0043]2、加終止液:按照上述顯色底物的加入順序依次在每個檢測孔中加入50 μ I終止液，終止反應，終止反應的表現為檢測孔中的液體由藍色快速轉變成黃色；
[0044]3、結果檢測:
[0045]在加入終止液後15min內，用酶聯儀在450nm的波長條件下檢測每個檢測孔的光密度OD值，檢測試劑盒的檢測標準為:待測血清的OD值是P185陰性血清的OD值的2.1倍以上時，檢測樣判為陽性，否則檢測樣判為陰性。經檢測，本發明製備的包被96孔酶標板的變異係數CV值小於10%，對同一批次及不同批次的檢測試劑盒進行試驗測試，測試結果顯示批內及批間的試劑盒的CV值均小於15%，說明本發明的腫瘤蛋白P185檢測試劑盒具有高精密性。
[0046]3、本發明製備的雜交瘤細胞株2Dn、3F9的特性的檢定結果:
[0047]I)分泌抗體的穩定性:經檢測，製備得到的雜交瘤細胞株連續克隆後分泌的單克隆抗體陽性率達100%，在體外傳代3個月以上得到的雜交瘤細胞株仍能保持穩定的分泌抗體；
[0048]2)細胞核學特徵:經檢測，上述製備的雜交瘤細胞的核型符合人體的腫瘤細胞分裂中期的染色體核型；
[0049]3)支原體檢測:採用常規的DNA螢光染色法對雜交瘤細胞株2Dn、3F9的支原體進行檢測，具體將veix)細胞接種到置於小培養皿中的蓋玻片上，在37°C的培養箱中靜置24h，採集貼壁或半貼壁的雜交瘤細胞，用無抗生素的培養液傳代，3?4天後，雜交瘤細胞呈連續單層生長，長至60%左右匯合，取100 μ I培養液滴入上述vero細胞的小培養皿中，在37°C條件下培養，3?4天後，用D-hanks平衡鹽溶液洗滌小培養皿中的蓋玻片，再用固定液固定兩次，兩次固定時間分別為5min、10min,之後將蓋玻片置於小染色缸中，用Hoechst33258染液染色30min,乾燥,用封片液封片，最後在突光顯微鏡下觀察,細胞核外無細小螢光亮點，表明本發明製備的雜交瘤細胞株2Dn、3F9均為支原體陰性。
[0050]4、使用本發明的腫瘤蛋白P185檢測試劑盒的臨床實驗報告:
[0051]對122例乳腺癌、120例胃癌腫瘤患者及110例正常獻血員的腫瘤蛋白P185進行檢測，同時，將陽性腫瘤患者的腫瘤組織進行石蠟包埋，免疫組化，然後對陽性腫瘤患者免疫組化的腫瘤組織中的腫瘤蛋白P185進行檢測，結果如表I所示:
[0052]表I患者和正常對照組的腫瘤蛋白P185水平檢測數據表
[0053]
【權利要求】
1.一種腫瘤蛋白P185檢測試劑盒，其特徵在於:包括腫瘤蛋白P185單克隆抗體、酶標板、陽性對照品、陰性對照品、洗滌液、終止液、辣根過氧化物酶-鏈親和素及其顯色底物，所述的腫瘤蛋白P185單克隆抗體包括包被在酶標板上的腫瘤蛋白P185單克隆抗體和生物素標記的腫瘤蛋白P185單克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於:所述的包被在酶標板上的腫瘤蛋白P185單克隆抗體為腫瘤蛋白P185單克隆抗體2Dn，所述的生物素標記的腫瘤蛋白P185單克隆抗體為腫瘤蛋白P185單克隆抗體3F9，腫瘤蛋白P185單克隆抗體2Dn、3F9的製備步驟如下: a)以NIH/3T3細胞1.p免疫第一批6?8周的Balb/C雌鼠，得到雌鼠的抗NIH/3T3血清； b)收集長至匯合的T6-17細胞，用PBS緩衝液洗三次，將上述製備的抗NIH/3T3抗血清用PBS緩衝液以1:20?100稀釋，然後取2ml加入T6-17細胞中，在4°C條件下溫育過夜，期間晃動盛放T6-17細胞的試管8-10次，然後再用PBS緩衝液洗三次，得到懸浮於PBS緩衝液中的T6-17細胞； c)用上述懸浮於PBS緩衝液中的T6-17細胞1.P免疫第二批6-8周的BaLb/C雌鼠，然後取雌鼠的脾細胞製成細胞懸液； d)將步驟c得到的細胞懸液與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合； e)用ELISA法從上述融合的細胞中篩選出分泌腫瘤蛋白P185單克隆抗體的雜交瘤細胞，採用有限稀釋法對雜交瘤細胞進行克隆化，從而得到兩株具有穩定分泌腫瘤蛋白P185單克隆抗體能力的雜交瘤細胞株，分別命名為雜交瘤細胞株2Dn、雜交瘤細胞株3F9 ； f)將雜交瘤細胞株2Dn、3F9分別注入不同的雌鼠體內，收集腹水，將腹水中的抗體純化，即得腫瘤蛋白P185單克隆抗體2Dn、3F9。
3.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於:所述的洗滌液是由28.Sg的Na2HPO4.12H20、80g 的 NaCl、3.9g 的 NaH2PO4.2H20 和 50ml 的 Tween-20 加入純化水溶解定容至100000ml所得。
4.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於:所述的顯色底物包括顯色液A和顯色液B，所述的顯色液A是用檸檬酸緩衝液將30%過氧化氫稀釋1000倍所得，所述的顯色液B為用含20% 二甲基亞碸的檸檬酸緩衝液將四甲基聯苯胺配製成0.4mg/ml所得。
5.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於:所述的終止液是濃度為2mol/L的硫酸溶液。
6.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於:所述的陽性對照品、陰性對照品分別為人體的P185陽性血清、P185陰性血清。
【文檔編號】G01N33/68GK103698536SQ201310718223
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月20日 優先權日:2013年12月20日
【發明者】宋禮華, 徐振山, 周業亭, 吳強 申請人:安徽安科生物工程（集團）股份有限公司