一種利用基因打靶技術製備哺乳動物乳腺生物反應器的方法
2023-08-06 05:04:56
專利名稱:一種利用基因打靶技術製備哺乳動物乳腺生物反應器的方法
技術領域：
本發明涉及基因技術，具體地說，屬於一種利用基因打靶技術製備哺乳動物乳腺生物反應器的方法。
背景技術：
醫用蛋白基因是用於治療相應蛋白質缺失或缺少的外源性蛋白基因，生物體中有成千上萬的蛋白基因，它們都在執行著相應的特異的功能，有些蛋白基因在生物體中是不可缺少的或保持一定的蛋白質水平，否則就會引起疾病。工業用蛋白質是工業上的重要原材料，如蠶絲和蜘蛛絲蛋白等等。蜘蛛絲蛋白的強度和彈性都比鋼材的要好，並且它的重量輕多了，被稱之為生物鋼，是航天、軍工和民用的重要材料。
用哺乳動物乳腺生物反應器生產蛋白質是生產醫用和工業用蛋白質的重要方法之一。其重要意義在於乳腺生物反應器與細菌發酵和細胞培養生產醫用蛋白質相比，具有以下優點(1)乳汁中的蛋白質種類少，提取方便；(2)成本低，只需常規動物飼養，不需細菌發酵的裝置和細胞培養罐等；(3)乳腺合成的蛋白質具有糖基化，生物活性高。
自1997年體細胞克隆羊「多莉」培育成功以來(Wilmut et al，1997)，哺乳動物乳腺生物反應器再一次成為科學研究和社會關注的熱點。與原核注射獲得的轉基因動物相比，大動物轉基因體細胞的克隆有以下的優點獲得轉基因動物的效率高，資金投入少；更重要的是，可以首先對體外培養的細胞進行遺傳改造，如轉基因的整合及檢測，基因組基因的失活以及外源基因的定點插入(基因打靶，也稱基因定點整合，同源重組)，進而獲得相應的轉基因和基因打靶的克隆動物。
基因打靶(gene targeting)是20世紀80年代發展起來的一項重要的分子生物學技術，是利用基因轉移方法，將外源DNA序列導入靶細胞後，通過外源DNA序列與靶細胞內染色體上同源DNA序列間的重組，將外源DNA定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，或對某一預先確定靶位點進行定點突變，從而改變細胞遺傳特性的方法。作為新興技術，基因打靶技術有著無可比擬的優點基因打靶所適用的細胞即可以是原核細胞，也可以是真核細胞；基因打靶能把外源基因引入染色體DNA的特定片段上；在設計合理的情況下，基因打靶可以對宿主細胞染色體基因進行精細的改造；基因打靶後被擊中的基因或新引入的基因隨染色體DNA的複製而穩定複製。目前該技術在改造生物、培育新的生物品種，研究基因機構與功能、表達與調控，研究細胞生活周期調控機制以及遺傳病的基因治療等方面得到應用並不斷完善。
Schnieke等(1997)第一個報導了轉基因克隆動物(綿羊)；兩年後(Baguisi etal，1999)克隆山羊獲得成功；Keefer等於2002年獲得轉基因克隆山羊；中國科學院遺傳與發育生物學研究所等也於2001和2002年分別報導了在揚州出生的克隆山羊和轉基因克隆山羊(Zou et al，2001 and 2002)。大動物的基因打靶工作於2000年開始有報導，McCreath等將醫用蛋白質基因定點整合到體細胞的a1膠元蛋白原基因(a1-procollagen)位點，並獲得了克隆綿羊；Denning等(2001)報導通過基因打靶技術將綿羊的a1半乳糖基轉移酶(a1-galactosyltransferase)基因和Prion蛋白質基因失活。Lai等和Dai等(2002)幾乎在同一時間報導了基因打靶豬(半乳糖基轉移酶基因失活)的研究成功。但至今為止國內外很少有用基因打靶技術製備哺乳乳腺生物反應器的報導。部分用隨機轉基因製備的哺乳動物生物反應器的產品已進入臨床試驗階段。例如美國GTC生物治療公司生產的人的抗凝血酶素III已進入臨床試驗階段；加拿大Nexia生物技術公司的蜘蛛絲蛋白已開始大量地開發和生產。所以，採用基因打靶技術製備哺乳乳腺生物反應器將進一步提高醫用蛋白質在奶中的含量。
嶗山奶山羊是我國的高產奶山羊之一，產奶量大，產奶期8個月以上，長者可達10個月，一胎羊平均年產奶310公斤，二胎羊平均年產奶590公斤，第三胎平均年產奶700公斤以上，高者可達1300公斤，相當於1/3頭奶牛的產奶量，而且山羊的研究周期短，飼養管理費用低，是乳腺生物反應器的重要研究對象之一。本專利申請人所用的人的抗凝血酶素III基因，其基因產物是人類保健和治療一些疾病的重要蛋白質(Lu etal，2000)。抗凝血酶素III是一種血漿糖蛋白，它與傷口的止血和維持體內血液的流動性密切相關。臨床上，抗凝血酶素III主要用於治療心肌梗塞，血栓性靜脈炎，凝血酶素缺乏症和血栓症(腦血栓)等。並用於外科手術過程中，以防止和減少血液凝結塊進入血液循環系統(Levy et al，2002，Konkle et al，2003)。
上海傑隆生物工程股份有限公司的專利申請公開號為CN1502694的專利申請中公開了一種通過Cre-loxp定點打靶體細胞克隆家畜作為乳腺生物反應器的方法，該方法首先將基因打靶載體轉入體細胞中，進行克隆，獲得克隆動物或克隆體細胞，然後再將醫用蛋白基因轉入到克隆的體細胞中，又進行一次克隆動物體細胞的克隆，最後獲得轉基因的基因打靶動物。即需要進行兩次體細胞基因轉化，篩選和體細胞克隆，獲得基因打靶家畜乳腺生物反應器的周期就幾乎增加一倍，加大了工作量和生產醫用蛋白的成本。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的不足之處，將醫用或工業用蛋白質基因，通過基因打靶的方法，將功能基因定點整合到哺乳動物的乳腺蛋白基因的位點上，使內源的乳腺蛋白基因的表達受阻，而表達轉入的功能基因，以改變乳汁中的蛋白質組成成分，增加功能基因的表達量。從而減少生產醫用或工業用蛋白質的成本，為人類的健康和生活服務。
本發明的技術解決方案是利用基因打靶技術製備哺乳動物乳腺生物反應器的方法，包括下列步驟1.將醫用蛋白基因、Lox序列、Ploy(A)信號、篩選基因和lox序列構建到哺乳動物的乳蛋白基因的表達框架中，構建基因打靶載體；2.轉化受體細胞並篩選；3.通過PCR和Southern分析，獲得基因打靶的細胞株；4.基因打靶的細胞株的細胞核移植，獲得基因打靶克隆動物；5.基因打靶動物的擴繁；6.將Cre蛋白質轉入基因打靶羊的受精卵中或體細胞即再克隆，獲得沒有篩選基因的基因打靶動物；7.利用Cre-lox和IRES序列的特點，將第二個醫用蛋白基因加到基因打靶動物中，獲得能合成兩個醫用蛋白基因的基因打靶生物反應器。
本發明的有益效果如下本發明與轉基因動物乳腺生物反應器相比，其明顯效益是基因打靶的醫用蛋白基因的表達量高於轉基因的表達量(大約要高於2-10倍)。並利了乳腺蛋白基因的Poly(A)信號，一方面減少了醫用蛋白的生產成本，為企業增加利潤，另一方面，減少市場上的銷售價格，為患者服務。
與中國專利申請CN1502694相比，本專利的基因打靶載體帶有一個醫用蛋白質基因(人源抗凝血酶III基因)的完整的表達單位(在人源抗凝血酶III基因的後面有一個牛的生長激素基因的Poly(A)信號)，基因打靶載體在第一代的克隆動物的乳腺中表達醫用蛋白質，縮短了獲得醫用蛋白基因基因打靶的克隆動物乳腺生物反應器的時間，同時，本基因打靶栽體，在隨機整合的體細胞克隆動物中，也是一種隨機轉基因的生物反應器；CN1502694專利申請的方法，需要進行兩次體細胞基因轉化，篩選和體細胞克隆，獲得基因打靶家畜乳腺生物反應器的周期就幾乎增加一倍，加大了工作量和生產醫用蛋白的成本。在本專利的基因打靶載體中有兩個Lox序列，他們是同一方向，在Cre蛋白質的作用下，將篩選基因(Neo)切除，就可以利用β-酪蛋白基因的Poly(A)信號，增加醫用蛋白基因的表達量，降低整個生物反應器的成本。在剩下的唯一lox位點上，利用Cre-lox重組和IRES序列的特點，還可加入第二個醫用蛋白基因，使兩個或多個醫用蛋白基因在同一基因打靶動物中同時高效地表達。在CN1502694專利申請的方法中，醫用蛋白質基因沒有利用β-酪蛋白基因的Poly(A)信號。
圖1奶山羊β-酪蛋白基因的結構和基因打靶技術路線示意圖。
圖2基因打靶的細胞株及其克隆羊的Southern和PCR分析。
圖中1是基因打靶克隆羊；2、4是基因打靶的胎兒成纖微細胞株，3是對照組羊DNA，W是空白對照，MW是1KB DNA分子量標記(Invitrogen)，DNA用Pst1酶切，Pst1和Kpn1之間的DNA為探針。
圖3第一隻基因打靶克隆羊的繁殖後代。
圖中基因打靶克隆公羊和後代的PCR和Southern結果1、a，b，c，d，e，f，g，h，I，j，k，l，m，n，o，p，q，r，s是基因打靶克隆公羊的後代，t是基因打靶公羊本身的DNA樣品，5.0kb片斷是山羊的基因組片斷，6.0kb是基因打靶片斷，MW是DNA分子量。
2、PCR是用所有的基因打靶克隆公羊及其後代的DNA樣品，但只有PCR陽性的羊的DNA用於Southern雜交。
圖4、第二批基因打靶羊及其Southern和PCR的分析。
圖中新的基因打靶克隆公羊的獲得及其PCR和Southern分析結果AT3.1，AT3.2和AT3.3是從基因打靶細胞株獲得的克隆羊，AT3.1和AT3.2是基因打靶羊，AT3.3不含有基因打靶片斷，證明是從正常細胞而來的克隆羊。C是正常羊DNA對照，5.0kb片斷是山羊的基因組片斷，6.0kb是基因打靶片斷，MW是DNA分子量。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例詳細說明本發明。
本發明包括以下步驟(1)選用哺乳動物的乳蛋白基因為轉基因的調控區和表達框架，在乳蛋白基因的表達框架上建立一個唯一的酶切位點，然後將醫用蛋白基因連接，在乳蛋白基因的表達框架上，基因打靶載體的篩選基因，Poly(A)信號與醫用蛋白基因連在一起，並由兩個同一方向的Lox序列相隔。
(2)所構建的載體經DNA序列分析，確定功能基因與乳蛋白基因的DNA序列，並與乳蛋白基因本身的表達和功能基因的胺基酸組成一致。
(3)用電穿孔或脂質體誘導的方法將基因載體轉入體細胞中。
(4)在培養基中對細胞株進行篩選，獲得篩選後的陽性細胞株；一部分細胞冷凍保存，一部分細胞用於製備DNA。
(5)陽性細胞株的DNA，經PCR和Southern雜交分析，確定同源重組(基因打靶)的細胞株。
(6)重組的細胞株的細胞移入成熟的去核卵母細胞的卵周隙內，然後使供核細胞和去核卵母細胞融合。
(7)將克隆胚胎移植到寄母羊中，獲得基因打靶克隆羊。
(8)收集基因打靶動物的乳劑，提純醫用蛋白質。
(9)將Cre蛋白轉入基因打靶動物的受精卵或體細胞中(再克隆)，切除篩選基因。
(10)將第二個醫用蛋白質基因轉入基因打靶動物基因組中。
在操作過程中可以利用Cre-lox技術將篩選基因從基因打靶載體上切除；並將第二功能基因定點加到基因打靶羊的體細胞或受精卵的lox位點上，快速製備新的功能基因的基因打靶乳腺生物反應器(如圖1)。
下面以嶗山奶山羊為例，採用抗凝血酶因子基因(Antithrombin III，ATIII，AT3)構建以山羊酪蛋白基因(β-casein)為框架的基因打靶載體，並最終獲得以抗凝血酶因子基因為功能基因的嶗山奶山羊乳腺生物反應器。參見圖1，其具體操作程序如下(一)功能基因的獲得抗凝血酶III基因是從人的相關組織中獲得mRNA，轉錄成cDNA，然後通過PCR方法建立兩端的連接酶切位點。PCR產物連接在pUC19上，再進行DNA序列分析；克隆的ATIII基因的DNA序列與已公開的DNA序列相同。具體方法是抗凝血酶III基因的製備是根據已公開的ATII的DNA順序(Gene Bank，D29832)，設計PCR引物(並在引物前加入1個唯一的Xho1酶酶切位點)進行PCR反應，PCR產物克隆到pUC19載體上，進行順序分析，再將DNA順序分析正確的ATIII的DNA片段，加上一個lox序列，PolyA序列，新黴素基因(Neomycin)和Lox序列，最後連接到奶山羊β-酪蛋白基因DNA載體的表達框架上。
(二)基因打靶載體的構建用綿羊的β-酪蛋白基因的一片斷為探針，從嶗山奶山羊的基因組文庫中分離出一段完整的β-酪蛋白基因，並用PCR方法去除β-酪蛋白基因的部分第二外顯子與第七外顯子及其之間的DNA序列，建立一個Not1位點，然後將抗凝血酶III和含有兩個同一方向Lox序列的Poly(A)信號和新黴素基因基因，連接在β-酪蛋白基因的表達框架上。
(三)轉化受體細胞從30至45天胎齡的嶗山奶山羊胎兒中分離出胎兒成纖維細胞，分離的細胞培養在DMEM-F12(1∶1)並添加10％胎牛血清(FCS)和抗菌素的培養基中。用電穿孔(Bio-rad)或脂質體介導法將基因打靶載體轉入山羊胎兒成纖維細胞中，然後在含有G418(600ug/ml)的培養基中篩選培養大約15-20天；細胞株再進行擴繁，一部分細胞冷凍保存，一部分用於製備DNA。
本實施例共分離6個嶗山奶山羊的胎兒，建立6個原始細胞系。從中篩選了4個細胞系用於細胞轉染，將基因打靶載體轉入胎兒成纖維細胞中；在含有600ug/ml G418的DMEM-F12(1∶1)培養基中篩選大約15-20天。在基因打靶細胞的篩選過程中，細胞生長較好的細胞株都被挑選，所以細胞株的成活率低一些，並且DNA分析後表明，只有大約1％的細胞株發生了基因的同源重組，最終只有0.3％的細胞株可用於克隆試驗，見表一。
表一細胞的生長與轉基因和基因打靶效率
(四)陽性細胞株的細胞核移植山羊經同期發情和超排處理，獲得體內成熟的卵母細胞和寄母羊。陽性細胞在體外飢餓2-5天後，移入去核卵母細胞的卵周隙內，用電刺激的方法將供核細胞與去核卵母細胞融合，體外培養4小時後，用離子黴素(Ionomycin)激活5分鐘，再在含有6-二甲基苯胺嘌呤(6-DMAP)的培養基中培養5小時。最後，克隆胚胎移入正常培養基中培養；第二天，移入寄母羊輸卵管中。
(五)DNA的製備，Southern和PCR分析將培養的細胞和少量克隆羊的組織轉入DNA裂解液(含有蛋白酶K)中，在55℃水浴鍋中過夜，然後加入兩倍的純酒精，混勻，離心；用70％的酒精洗DNA一次，自然乾燥，然後加入適量的TRIS-EDTA溶液，待DNA全部溶解後，放入-20℃的冰箱中。用Pst1酶消化DNA溶液過夜，在0.8％的凝膠上電泳，然後將DNA轉入纖維膜中，分別用P32標記探針進行雜交。獲得DNA的Southern圖片。用PCR引物對基因打靶的細胞株和克隆羊進行PCR分析。
細胞的克隆試驗分兩批進行。供核細胞從液氮中復甦後，體外培養一段時間，然後在含有0.5％FCS的培養基中飢餓2-5天。體內成熟的卵母細胞為供卵細胞。共獲得313卵母細胞，融合率為78％，174枚克隆胚胎移植到22隻寄母中，1隻寄母羊懷孕，產出1隻克隆羊羔。Southern和PCR分析表明克隆羊羔含有抗凝血酶III基因，這是世界上所獲得的第一隻含有醫用蛋白基因的基因打靶的克隆山羊。
細胞核移植統計數據見表二，基因打靶羊的Southern和PCR的分析見圖二。圖二中，基因打靶的細胞株及其克隆羊的Southern和PCR分析圖。1是基因打靶克隆羊；2.4是基因打靶的胎兒成纖微細胞株，3是對照組羊DNA，W是空白對照，MW是1KB DNA分子量標記(Invitrogen).DNA用Pst1酶切，Pst1和Kpn1之間的DNA為探針；PCR條件是94℃2分鐘；然後94℃25秒，65℃15秒，72℃8分鐘，共31循環；最後在68℃下10分鐘。
表二細胞核移植統計表
至目前為止，第一隻含有抗凝血酶III基因的基因打靶克隆羊(雄性)生長發育正常，並與其它的嶗山奶山羊交配，獲得了較大群體的基因打靶羊的後代(見其後代的PCR和Southern分析圖)。於2004年3月又出生的三隻基因打靶克隆羊的生長發育正常。經PCR和Southern分析，其中有兩隻克隆羊是基因打靶的克隆羊，另一隻是從正常細胞而克隆的克隆羊。這兩隻基因打靶克隆公羊已與相關的奶山雌羊交配，生長和發育都良好。
序列表110青島森淼實業有限公司120利用基因打靶技術製備哺乳動物乳腺生物反應器的方法13000919116015170Patent version 5.121012113866212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(3866)223奶山羊β-酪蛋白的啟動區和第1外顯子和內含子和部分，基因打靶載體的5』同源臂40011 GGTACCTGAT GTCATCTTAA ATTGCTGGCT TTTTGATTTT CCATTGGACA 50AGCTTCTTTC TTTAGTATAT TGTTAAGGAT TTCCTTGATC AAGATTTTAC 100CTACTTTTCT GGTCCAATTG GTGAGAGACA GTCATAAGGA AATGCTGTGT 150TTATTGCACA ATATGTAAAG CATCTTCCTG AGAAAATAAA AGGGAAATGT 2005 TGAATGGGAA GGATATGCTT TCTTTTGTAT TCCTTTTCTG AGAAATCAGA 250CTTTTTCACC TGTGGCCTTG GCCACCAAAA GCTAACAAAT AAAGGCATAT 300GAAGTAGCCA AGGCCTTTTC TAGTTATATC TATGACACTG AGTTCATTTC 350ATCATTTATT TTCCTGACTT CCTCCTGGGT CCATATGAGC AGTCTTAGAA 400TGAATATTAG CTGAATAATC CAAATACATA GTAGATGTTG ATTTGGGTTT 45010 TCTAAGCAAT CCAAGACTTG TATGACAGTA AGATGTATTA CCATCCAACA 500
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1 GACGACGACG ACAAG 1521062111398212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(1398)223人源抗凝血酶III基因40061 ATGATTTATT CCAATGTGAT AGGAACTGTA ACCTCTGGAA AAAGGAAGGT 50TTATCTTTTG TCCTTGCTGC TCATTGGCTT CTGGGACTGC GTGACCTGTC 100ACGGGAGCCC TGTGGACATC TGCACAGCCA AGCCGCGGGA CATTCCCATG 150AATCCCATGT GCATTTACCG CTCCCCGGAG AAGAAGGCAA CTGAGGATGA 2005 GGGCTCAGAA CAGAAGATCC CGGAGGCCAC CAACCGGCGT GTCTGGGAAC 250TGTCCAAGGC CAATTCCCGC TTTGCTACCA CTTTCTATCA GCACCTGGCA 300GATTCCAAGA ATGACAATGA TAACATTTTC CTGTCACCCC TGAGTATCTC 350CACGGCTTTT GCTATGACCA AGCTTGGTGC CTGTAATGAC ACCCTCCAGC 400AACTGATGGA GGTATTTAAG TTTGACACCA TATCTGAGAA AACATCTGAT 45010 CAGATCCACT TCTTCTTTGC CAAACTGAAC TGCCGACTCT ATCGAAAAGC 500CAACAAATCC TCCAAGTTAG TATCAGCCAA TCGCCTTTTT GGAGACAAAT 550CCCTTACCTT CAATGAGACC TACCAGGACA TCAGTGAGTT GGTATATGGA 600GCCAAGCTCC AGCCCCTGGA CTTCAAGGAA AATGCAGAGC AATCCAGAGC 650GGCCATCAAC AAATGGGTGT CCAATAAGAC CGAAGGCCGA ATCACCGATG 70015 TCATTCCCTC GGAAGCCATC AATGAGCTCA CTGTTCTGGT GCTGGTTAAC 750ACCATTTACT TCAAGGGCCT GTGGAAGTCA AAGTTCAGCC CTGAGAACAC 800AAGGAAGGAA CTGTTCTACA AGGCTGATGG AGAGTCGTGT TCAGCATCTA 850TGATGTACCA GGAAGGCAAG TTCCGTTATC GGCGCGTGGC TGAAGGCACC 900
CAGGTGCTTG AGTTGCCCTT CAAAGGTGAT GACATCACCA TGGTCCTCAT 95020 CTTGCCCAAG CCTGAGAAGA GCCTGGCCAA GGTAGAGAAG GAACTCACCC 1000CAGAGGTGCT GCAAGAGTGG CTGGATGAAT TGGAGGAGAT GATGCTGGTG 1050GTCCACATGC CCCGCTTCCG CATTGAGGAC GGCTTCAGTT TGAAGGAGCA 1100GCTGCAAGAC ATGGGCCTTG TCGATCTGTT CAGCCCTGAA AAGTCCAAAC 1150TCCCAGGTAT TGTTGCAGAA GGCCGAGATG ACCTCTATGT CTCAGATGCA 120025 TTCCATAAGG CATTTCTTGA GGTAAATGAA GAAGGCAGTG AAGCAGCTGC 1250AAGTACCGCT GTTGTGATTG CTGGCCGTTC GCTAAACCCC AACAGGGTGA 1300CTTTCAAGGC CAACAGGCCT TTCCTGGTTT TTATAAGAGA AGTTCCTCTG 1350AACACTATTA TCTTCATGGG CAGAGTAGCC AACCCTTGTG TTAAGTAA 1398210721134212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(34)223loxp序列40071 ATAACTTCGT ATAGCATACA TTATACGAAG TTAT 3421082116212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(6)223Taq1位點40081 CTCGAC 62109211420212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(420)223牛生長激素基因的Poly(A)信號序列40091 ATTAATACGA CTCACTATAG GGAATTCCAG GGGGGTGGTG GATATCCTGG 50TACCGCGGCC GCTCGAGCAT GCATCTAGAG GGCCCTATTC TATAGTGTCA 100CCTAAATGCT AGAGCTCGCT GATCAGCCTC GACTGTGCCT TCTAGTTGCC 150AGCCATCTGT TGTTTGCCCC TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT 2005 GCCACTCCCA CTGTCCTTTC CTAATAAAAT GAGGAAATTG CATAAGCTTG 250GCACTGGCCG TCGTTTTACA ACGTCGTGAC TGGGAAAACC CTGGCGTTAC 300CCAACTTAAT CGCCTTGCAG CACATCCCCC TTTCGCCAGC TGGCGTAATA 350GCGAAGAGGC CCGCACCGAT CGCCCTTCCC AACAGTTGCG CAGCCTGAAT 400GGCGAATGGA AATTGTAAGC 420210102116
212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(6)223Xho1位點400101 CTCGAG 6210112111104212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(1104)223Neo基因序列400111 ATCCGAACAA ACGACCCAAC ACCCGTGCGT TTTATTCTGT CTTTTTATTG 50CCGATCCCCT CAGAAGAACT CGTCAAGAAG GCGATAGAAG GCGATGCGCT 100GCGAATCGGG AGCGGCGATA CCGTAAAGCA CGAGGAAGCG GTCAGCCCAT 150TCGCCGCCAA GCTCTTCAGC AATATCACGG GTAGCCAACG CTATGTCCTG 2005 ATAGCGGTCC GCCACACCCA GCCGGCCACA GTCGATGAAT CCAGAAAAGC 250GGCCATTTTC CACCATGATA TTCGGCAAGC AGGCATCGCC ATGGGTCACG 300ACGAGATCCT CGCCGTCGGG CATGCGCGCC TTGAGCCTGG CGAACAGTTC 350GGCTGGCGCG AGCCCCTGAT GCTCTTCGTC CAGATCATCC TGATCGACAA 400
GACCGGCTTC CATCCGAGTA CGTGCTCGCT CGATGCGATG TTTCGCTTGG 45010 TGGTCGAATG GGCAGGTAGC CGGATCAAGC GTATGCAGCC GCCGCATTGC 500ATCAGCCATG ATGGATACTT TCTCGGCAGG AGCAAGGTGA GATGACAGGA 550GATCCTGCCC CGGCACTTCG CCCAATAGCA GCCAGTCCCT TCCCGCTTCA 600GTGACAACGT CGAGCACAGC TGCGCAAGGA ACGCCCGTCG TGGCCAGCCA 650CGATAGCCGC GCTGCCTCGT CCTGCAGTTC ATTCAGGGCA CCGGACAGGT 70015 CGGTCTTGAC AAAAAGAACC GGGCGCCCCT GCGCTGACAG CCGGAACACG 750GCGGCATCAG AGCAGCCGAT TGTCTGTTGT GCCCAGTCAT AGCCGAATAG 800CCTCTCCACC CAAGCGGCCG GAGAACCTGC GTGCAATCCA TCTTGTTCAA 850TGGCCGATCC CATATTGGCT GCAGGGTCGC TCGGTGTTCG AGGCCACACG 900CGTCACCTTA ATATGCGAAG TGGACCTGGG ACCGCGCCGC CCCGACTGCA 95020 TCTGCGTGTT CGAATTCGCC AATGAAACCA CACTGCTCGA CATTGGGTGG 1000AAACATTCCA GGCCTGGGTG GAGAGGCTTT TTGCTTCCTC TTGCAAAACC 1050ACACTGCTCG AGGAATTCAT AACTTCGTAT AATGTATGCT ATACGAAGTT 1100ATGC 11042101221134212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(3866)223Lox序列400121 ATAACTTCGT ATAGCATACA TTATACGAAG TTAT 3421013
2113866212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(9)223Not1位點400131 GCGGCCGCC 9210142112233212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(2233)223奶山羊β-酪蛋白的部分第7外顯子至第9外顯子基因序列。，基因打靶載體的3』同源臂400141 ATCCCTTCAC TGGGCCCATC CCTAACAGCC TCCCACAAAA CATCCTGCCT 50CTTACTCAAA CCCCTGTGGT GGTGCCGCCT TTCCTTCAGC CTGAAATAAT 100GGGAGTCCCC AAAGTGAAGG AGACTATGGT TCCTAAGCAC AAAGAAATGC 150CCTTCCCTAA ATATCCAGTT GAGCCCTTTA CTGAAAGCCA GAGCCTGACT 2005 CTCACTGATG TTGAAAAGCT GCACCTTCCT CTGCCTCTGG TCCAGTCTTG 250GATGCACCAG CCTCCCCAGC CTCTTTCTCC AACCGTCATG TTTCCTCCTC 300
AGTCCGTGCT GTCCCTTTCT CAGCCCAAAG TTCTGCCTGT TCCCCAGAAA 350GTAGTGCCCC AGAGAGATAT GCCCATCCAG GCCTTTCTGC TGTACCAGGA 400GCCTGTACTT GGTCCTGTCC GGGGACCCTT CCCTATTCTT GTAAGTCTAA 45010 ATTTACTAAC TGTGCTGTTT AACTTCTGAT GTTTGTATGA TATTTGAGTA 500ATTAAGAGCC CTACAAAAAA TCAATAATGA ATGGTTCCAA AATAAGCATA 550GCTGAGATTA ATGATTCTCA GCATTGGTTA TAAATAGAAT AAGCTGGAAA 600ACCTTCACCT CCCCTCCACC ACCAGATCTC AATGTCTAGG CTTACCCATG 650GAGATTCTGA TTAACTGTTC TTTCTATGTA GAAGAAACTT ATTGGGAAGA 70015 AATAATATAA TGGACTATGA TTTAATTGGT CTGTTGAGAA TTTAGATGAA 750GGGGATTAAG TTACAATAAA GCCAGAATTG AACTTGATAA TCTCACTTGG 800CTAAGAATAA CAAACCTAAG AAGGTTTGCT ATTTTCTACA ATTTTGAAGT 850TTTCCTTATG CACAATTATT TCACCACATG ACTCATTTCA CCTCTTGTTT 900TTGATATATG AGCATATGAG GGCAAAATAC TGAAGATGCT TATTTCAATA 95020 CTCAGGGAAA ATTTTCTTGC CAAAAGGCAA GAATTGTATA ATTCATTCAC 1000TTATTTTATT TTTTTAATTT TTAAGGTCTA AGAGGATTTC AAAGTGAATG 1050CCCCCTCCTC ACTTTTGGTA AGCTTTAGGA GATTGGAGGC AGACTGATCA 1100TTTTTATAGT TAATATCTTT TACATTTCAT CTTCCTGGAT AAGCCCCAAT 1150AGTAGCAATT TCTATCAGTA TACCAGCGTA AAGATTAGTT TTAAATATAT 120025 TTTCAGTGAT TGACTGTTAT TTACTGACCT GAAATTATGT ATCTGTTATA 1250TTTCAAATAA TGCAAAACTG TATATATATG GTGTTGACAG ATTTGATTGG 1300TTTTCTTTCA ATTGCCTATA TCCTTATTAT TGATTGTAAT CATTTATAGA 1350AAAAACAAAA TAATTTCTTA TACTTTTATG TAAACCTGTT AGAGCTTATT 1400TTAAAGATCA ACTGCATTCA CATTTCTAAT CTAGTCATTA TGAGCTTCAA 145030 TTGTTTTATC TCACTTAAAA TTTATATATT GTCTTTTAAT TCATGAGTCA 1500AAATACAATC TCACAGTCCA GATATGGGAC TTAAAAGGGG AATAGCATAT 1550AGTTTTGATA TTCTTAAAGA AATACATCTT TTTGTGATCA TGATTCAGCA 1600GACATTTTAA TAAAACAATT CCAAGTGAGC CGACACTTGG TCCTAGAGGA 1650ATTTTTATAA TCTTAAGGTA AGGCACAGCA TGGTGTTTTT GTAATAAGAT 170035 TTCTTTTATG AAAAAGTCAC ACCAAAATTG GAAATGGGGT GAGATGAAGA 1750GTTATAACAT ATAACTAAAT GGACATTTGT TCTCTATTCC ACAGAATTGA 1800
CTGCGACTGG AAATATGGCA ACTTTTCAAT CCTTGCATCA TGCTACTAAG 1850ATAATTTTTA AATGAGTATA CATGGAACAA AAAATGAAAC TTTATTCCTT 1900TATTTATTTT ATGCTTTTTC ATCTTAATTT GAATTTGAGT CATAAACCAT 195040 ATACTTTCAA AATGTTAATT CAACATTAGC ATAAAAGTTC AATTTTAACT 2000TGGAAATATC ATGAACATAT CAAATTATGT ATAAAAATAA TTTCTGGAAT 2050TGTGATTATT ATTTCTTTAA GAATCTATTT CCTAACCAGT CATTTCAATA 2100AATTAACCCT TAGGCATATT TAAGTTTTCT TGTCTTTATT ATATTTTTAA 2150AAATGAAATT GGTCTCTTTA TTGTTAACTT AAATTTATCT TTGATGTTAA 2200AAATAGCTGT GGAAAATTAA AATTGGATAG AAT 2233210152116212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(6)223Sma1位點400151 CCCGGG 6
權利要求
1.一種利用基因打靶技術製備非人哺乳動物乳腺生物反應器的方法，其特徵在於該方法包括下列步驟(1)將醫用蛋白基因、Lox序列、Ploy(A)信號、篩選基因和lox序列構建到哺乳動物的乳蛋白基因的表達框架中，構建基因打靶載體；(2)轉化受體細胞並篩選；(3)通過PCR和Southern分析，獲得基因打靶的細胞株；(4)基因打靶的細胞株的細胞核移植，獲得基因打靶克隆動物；(5)基因打靶動物的擴繁；(6)將Cre蛋白質轉入基因打靶羊的受精卵中或體細胞即再克隆，獲得沒有篩選基因的基因打靶動物；(7)利用Cre-lox和IRES序列的特點，將第二個醫用蛋白基因加到基因打靶動物中，獲得能合成兩個醫用蛋白基因的基因打靶生物反應器。
2.根據權利要求
1所述的方法，其特徵在於所述的乳蛋白基因包括乳球蛋白、α-酪蛋白基因、β-酪蛋白基因、乳漿蛋白基因，乳鐵蛋白基因。
3.根據權利要求
1所述的方法，其特徵在於所述的醫用蛋白基因連接在乳蛋白基因的表達框架上，並定點整合在內源的乳蛋白基因上，然後在乳汁中特異高效表達。
4.根據權利要求
1所述的方法，其特徵在於所述的哺乳動物包括牛、山羊和綿羊、豬、兔、馬。
5.根據權利要求
1所述的方法，其特徵在於將Poly(A)終止信號加在醫用蛋白質基因的後面，同源重組的細胞株經過克隆後，獲得基因打靶的轉基因克隆動物，並在其奶中直接高效表達醫用蛋白。
6.根據權利要求
1所述的方法，其特徵在於利用Cre-lox技術將篩選基因從基因打靶載體上切除，利用β-酪蛋白基因的Poly(A)終止信號。
7.根據權利要求
1所述的方法，其特徵在於利用在唯一lox序列上加入第二個兩醫用蛋白基因，使兩個醫用蛋白基因在同一動物中同時表達。
專利摘要
本發明公開了一種利用基因打靶技術製備哺乳動物乳腺生物反應器的方法，包括下列步驟1.將醫用蛋白基因、Lox序列、Ploy(A)信號、篩選基因和lox序列構建到哺乳動物的乳蛋白基因的表達框架中，構建基因打靶載體；2.轉化受體細胞並篩選；3.通過PCR和Southern分析，獲得基因打靶的細胞株；4.基因打靶的細胞株的細胞核移植，獲得基因打靶克隆動物；5.基因打靶動物的擴繁；6.將Cre蛋白質轉入基因打靶羊的受精卵中或體細胞即再克隆，獲得沒有篩選基因的基因打靶動物；7.利用Cre－lox和IRES序列的特點，將第二個醫用蛋白基因加到基因打靶動物中，獲得能合成兩個醫用蛋白基因的基因打靶生物反應器。
文檔編號C12Q1/68GKCN1730659SQ200510055256
公開日2006年2月8日 申請日期2005年3月17日
發明者袁三平, 張義靜, 鮮建 申請人:青島森淼生物技術研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan