漢防己甲素在製備癌細胞自噬誘導劑上的應用的製作方法

2023-07-08 03:04:36

專利名稱：漢防己甲素在製備癌細胞自噬誘導劑上的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥技術領域，涉及漢防己甲素在製備誘導癌症細胞自噬的誘導劑上的應用。
背景技術：
惡性腫瘤與心血管疾病是導致人類疾病和死亡的兩個最大頑疾。惡性腫瘤中肺癌、胃癌、食管癌、腸癌、肝癌、宮頸癌、乳腺癌、白血病、惡性淋巴瘤、鼻咽癌等在我國是常發性腫瘤，且以肺癌、胃癌、食管癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌最為多見，約佔全部惡性腫瘤的70% — 80% ο癌症治療的傳統方法中有放療、化療、手術；然而放療、化療在殺傷腫瘤細胞的同時，也對人體正常細胞有損傷，毒副作用大且造成患者生活質量差、生存率低。因此，篩選高效低毒的抗癌藥物一直是癌症治療的重要研究課題，特別是設計專門針對腫瘤細胞特定信號途徑或特定癌細胞靶位點的藥物。隨著研究者對細胞死亡現象本質的探究，尤其是對細胞凋亡分子機理的闡明，使人們對抗癌藥物的篩選及其作用機理有了全新的認識。有目的地誘導腫瘤細胞的凋亡已成為一種治療腫瘤的有效手段。漢防己甲素(Tetrandrine，分子式C38H42N2O6,分子量 622.75，CAS 號 518-34-3，以下簡寫為Tet)，又稱粉防己鹼，是從中草藥粉防己的根塊中提取的雙苄基異喹啉類生物鹼。臨床上常用於治療高血壓，肝纖維化和矽肺等疾病。近年來，一些研究表明較高濃度的漢防己甲素可誘導腫瘤細胞凋亡，顯示其具有潛在的抗腫瘤活性，如對人白血病細胞株HL-60、人白血病U937細胞、人肝癌細胞Mahlavu、人惡性淋巴瘤BM13674細胞、人神經膠質瘤細胞U138MG、鼠神經母細胞瘤Neuro 2a有抑制腫瘤細胞增生和誘導凋亡的作用；研究結果還表明，漢防己甲素可以通過提高細胞內活性氧水平抑制鼠神經母細胞瘤株生長，誘導其凋亡；在HT-29細胞中漢防己甲素通過PI3K/AKT/GSK3beta途徑誘導細胞周期阻滯和凋亡。Tet不僅能直接抑制腫瘤生長，並且具有放療增敏、逆轉耐藥、減輕放化療毒副反應的作用，表明Tet在抗腫瘤治療中有著良好的臨床應用前景。與以往報導不同，在本發明中，體內外實驗發現漢防己甲素能在較低濃度下誘導肝癌細胞發生自噬，且有顯著的劑量效應和時間依賴關係。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在於提供了漢防己甲素在製備誘導癌細胞自噬的誘導劑上的應用。所述的癌細胞為肝癌細胞。本發明的實驗研究發現，低濃度的(彡5 μ M)漢防己甲素可有效誘導肝癌細胞發生自噬，且有顯著的劑量效應和時間依賴關係。
本發明可用於誘導多種腫瘤細胞，不僅限於實例中所列舉的腫瘤類型。本發明通過漢防己甲素在低濃度下(彡5μΜ)誘導肝癌細胞BEL-7402、HepG2和Huh7自噬，研究漢防己甲素對肝癌細胞的誘導自噬的能力。本發明採用不同濃度漢防己甲素對肝癌細胞BEL-7402、HepG2和Huh7處理，通過蛋白質雜交和吖啶橙染色，觀察不同濃度漢防己甲素對誘導肝癌細胞形成自噬的能力。結果表明，不同濃度的漢防己甲素都能誘導肝癌細胞形成自噬，且呈濃度和時間依賴效應。


圖I不同濃度的Tet處理肝癌細胞，Western blot檢測細胞凋亡和細胞自噬的標誌性蛋白。肝癌細胞Bel7402、Hep G2和Huh7經不同濃度的Tet處理24小時後，Westernblot 檢測細胞內 PARP、Caspase-8、Caspase_3、LC3 蛋白。GAPDH 作為內參。圖2三種肝癌細胞經5 μ M Tet處理不同時間後，吖啶橙染色並在螢光顯微鏡下觀察。圖3統計分析Tet處理不同時間後Bel7402肝癌細胞自噬比例。圖4統計分析Tet處理不同時間後!tepG2肝癌細胞自噬比例。圖5統計分析Tet處理不同時間後Huh7肝癌細胞自噬比例。圖6 Tet處理Bel7402肝癌細胞引起細胞自噬的腫瘤組織電鏡照片(標尺為800nm ;處理組箭頭自噬溶酶體)。
圖7 Tet處理H印G2肝癌細胞引起細胞自噬的腫瘤組織電鏡照片(標尺為1300nm;處理組箭頭自噬溶酶體)。
圖8 Tet處理Huh7肝癌細胞引起細胞自噬的腫瘤組織電鏡照片(標尺為800nm;處理組箭頭自噬溶酶體)。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。所有實施例所用細胞的培養、藥品的添加以及癌細胞自噬均按以下方法進行。一、材料
I.細胞株肝癌細胞BEL-7402、HepG2和Huh7等細胞株均購自中國典型培養物保藏中心(China Center for Type CultureCollection, CCTCC)。2.試劑DMEM培養基、RPMI 1640培養基、胎牛血清和胰酶、乙二胺四乙酸等藥品來自GIBCO公司；漢防己甲素、青黴素、鏈黴素、DMSO、、Sigma公司產品。其餘試劑均為國產分析純。LC3抗體購自sigma公司；細胞色素C, Atg5, Atg7, caspase-3, caspase-8,caspase-9, PARP, phospho-Akt, phospho-ERK, p38 MAPK 和 JNK 等抗體均為 CellSignaling公司產品；吖啶橙、GAPDH抗體為碧雲天公司產品；二抗羊抗兔IgG-HRP為Beyotime公司產品；二抗羊抗鼠IgG-HRP為Beyotime公司產品；
3.儀器5% CO2細胞培養箱(ThermoForma，美國)，細胞培養超淨工作檯(蘇淨集團安泰公司)，低溫超速離心機(Haraeus公司，德國),倒置突光顯微鏡(Olympus,日本),透射電子顯微鏡(日立一H 600型)。二、主要試劑配製I)將漢防己甲素用二甲亞碸(dimethyl sulfoxide, DMSO)配製成1(Γ2Μ儲備液,小量分裝，一 20 1貯存備用，臨用時用相應細胞培養液稀釋到所需終濃度。2) 一抗/ 二抗工作液一抗/ 二抗均用封閉液以1:1000比例稀釋，4°C保存。3)PBS溶液將購買的PBS粉劑溶於5L三蒸水中，磁力攪拌器混勻，高壓蒸汽鍋滅菌，4°C保存。4)青黴素/鏈黴素溶液用PBS將青黴素和鏈黴素配製成10，000U/mL,用0. 22 μ m濾膜過濾除菌，_20°C保存。
5) DMEM-高糖細胞培養基DMEM粉劑溶於10L三蒸水中，磁力攪拌器中攪拌0. 5小時後，加入37g NaHCO3，繼續攪拌0. 5小時，用稀鹽酸將pH值調到7. 04-7. 05，真空泵抽濾除菌。培養細胞DMEM含10%的胎牛血清和1%的青黴素/鏈黴素。6) 5%牛奶封閉液稱取5g的脫脂牛奶溶於IOOmL雙蒸水中，磁力攪拌器混勻，分裝後-20°C保存。7) TBS 緩衝液(10X) Tris. Base 150g, KCl 10g，NaCl 400g，加雙蒸水至 5L，磁力攪拌器攪拌至其完全溶解，用HCl調pH調至7. 4，室溫保存。8) TBST緩衝液TBS緩衝液(10X) IOOmL,加雙蒸水至1L，再加lmLTween-20，搖勻。9) Tris-甘氨酸電泳緩衝液(5X) :75. 5g Tris. Base，360g 甘氨酸，5g SDS，加雙蒸水至5L，磁力攪拌器攪拌至其完全溶解，過夜，調pH調至8. 3-8. 8，4°C保存。使用時，取IOOmL加雙蒸水至1L，搖勻。10)Western blot 轉移緩衝液(10X) Tris. Base 151. 5g，甘氨酸 720g,加雙蒸水至5L，磁力攪拌器攪拌至其完全溶解，室溫存放。使用時，取IOOmL加雙蒸水至1L，搖勻。11) Inoue轉化緩衝液
①0. 5的PIPES (pH 6. 7)溶液的配置
將15. Ig PIPES溶於80mL三蒸水中。用5M KOH調pH值至6. 7，最後加純水，定容至100mL。用0. 2 μ m濾膜過濾除菌。分成小份於_20°C保存。② Inoue轉化緩衝液的配置
將下列組分溶於800mL純水中，然後加20mL0. 5M的PIPES (pH 6. 7)，加純水定容於1L。
表I Inoue轉化緩衝液各組分含量
試劑I需要量幾I終濃度
MnCla. 4Ha0_10. 88g 55mM
CaCla. 2Ha0~20g 15mM
Fe I18.65g 250mM
FlPES(0. 5M, pH6. 7) 20mL IOmM H^0~I補至 IL
二、實驗方法
I.細胞培養細胞按常規培養於含10 %小牛血清的RPMI-1640或DEME培養基(青黴素100 u/ mL，鏈黴素100 u/ mL)中，置CO2培養箱(37 °C，5 % CO2)中培養。2.選用對數生長期的腫瘤細胞，用胰酶消化後，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養基配成1-5X IO4個/ mL的細胞懸液，接種在24孔培養板中，每孔接種lmL，37°C，5%CO2培養箱中培養24h。
3.實驗組換新的含不同濃度被測藥品的培養基，對照組則換含等體積溶劑的培養基，每組設5平行孔，每孔中藥物溶劑(DMS0或水)的體積不超過1%總體積。每個濃度設5個復孔，37°C，5% CO2培養3 5天。
4.細胞總蛋白的提取及定量 I)提取細胞內總蛋白
①收集細胞將細胞進行消化，加到I.5mL離心管中，1600rpm離心4分鐘，棄上清；
②冰冷PBS重懸細胞；
③1600rpm離心4分鐘,棄上清；
④根據收集細胞量加入一定量1%SDS，沸水浴20分鐘；
⑤12000rpm離心10分鐘,取上清至新EP管。2)測定蛋白質的濃度(採用BCA測定)
①在酶標板上每孔加入23μ L的滅菌ddH20,然後再加入2 μ L的蛋白樣品；同時另取兩個孔，加入25 μ L的滅菌ddH20,作為對照；
②配製BCA工作液根據蛋白樣品數量，按A液B液=50:1的比例進行配置並充分混
勻；
③每孔加入200μ L配製的BCA工作液，於37°C放置30分鐘；
④在酶標儀上，利用570nm的波長測定蛋白樣品的OD值；
⑤根據已有的標準曲線計算出每個蛋白樣品的濃度；
⑥根據目標濃度進行取樣。5. Western blot (蛋白雜交實驗)
SDS-PAGE 電泳
1)①配分離膠根據目標蛋白的分子量配置相應濃度的分離膠，加入兩玻璃板間。再加入醫用酒精至玻璃板頂部。待其凝固後，倒出醫用酒精，用濾紙吸乾多餘酒精；
2)②配濃縮膠按照各成分的量依次加入，混勻，加到玻璃板間，插入梳子，凝固後，移走梳子；
3)③將玻璃板安裝到電泳槽中，倒入RunningBuffer ；
4)④上樣按照樣品的順序依次加樣，蛋白上樣量為20μ g，加入3μ L LoadingBuffer ；
5)⑤140V進行電泳；
6)⑥電泳完畢後，關閉電源，將玻璃板上取出，準備轉膜。7)蛋白轉膜(用半乾轉膜器進行)
8)①活化PVDF膜將PVDF膜在甲醇中浸泡3分鐘；
9)②轉膜按從下到上濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙的順序放置；
10)③開啟電源，電壓18V，轉膜30分鐘。11) 封閉，雜交
12)①將PVDF膜放入5%的牛奶封閉液中，室溫，搖床上緩慢搖動1-2小時；
13)②切PVDF膜根據目標蛋白的分子量切PVDF膜；
14)③將切好的PVDF膜放入相應的一抗中，4°C孵育過夜；
15)④回收一抗，用TBST漂洗膜3次，每次10分鐘；16)⑤將漂洗後的膜放入二抗中，室溫孵育1-2小時；
17)⑥回收二抗，再用TBST漂洗膜3次，每次10分鐘。18)顯影
19)①將顯色A液、B液等量均勻混合；
20)②把膜放入顯色液中，在暗室內使用X膠片感光、顯影。6.細胞吖啶橙染色
用無菌鑷子將滅菌好的蓋玻片加入十二孔板中，加入ImL的培養基，接種適量的細胞，搖勻，待細胞貼壁後，做後續實驗。把滅菌的蓋玻片放入12孔板孔中，接種上適量的細胞，24小時貼壁後，用藥物處理。處理完後，吸走上清，用PBS清洗兩遍，加入吖啶橙(終濃度為I μ g/mL)，室溫避光孵育20分鐘；用PBS清洗兩遍，倒扣在載玻片上，在螢光顯微鏡下觀察。7.電鏡觀察自噬泡
1)樣品的製備
①組織取材一2. 5%戊二醛前固定一O. IM磷酸緩衝液漂洗三次一鋨酸(1%)後固定一
O.IM磷酸緩衝液漂洗三次，梯度酒精脫水(50%，70%, 80%, 95%，100% 二次)每次15分鐘。②環氧樹脂包埋
純丙酮脫水二次(15分鐘)一 EP0N812 :丙酮(I :1)浸透30分鐘一純包埋液浸透I小時一純包埋液固化37°C 24小時後60°C 48小時。③瑞典BROMMA公司產LKB — V型超薄切片機切片一鈾、鉛染色(醋酸雙氧鈾，枸櫞酸鉛)
2)觀察
在放大倍數為6000X時，觀察細胞全貌；放大倍數為25000X時，觀察自噬泡。四、實驗結果
實驗分對照組(control)、漢防己甲素組(Tetrandrine),採用不同濃度漢防己甲素作用於肝癌細胞株，通過蛋白質雜交試驗和吖啶橙染色試驗和投射電鏡試驗檢測漢防己甲素誘導癌細胞的自噬作用。實驗例l:Western blot檢測低濃度漢防己甲素(彡5 μ Μ)處理肝癌細胞Bel7402、HepG2和Huh7引起細胞自噬的影響。較低濃度的漢防己甲素(彡5μΜ)處理肝癌細胞Bel7402、！fepG2和Huh7 24小時後可以顯者引起細胞自卩遼。如圖I所不，Western blot檢測細胞調亡和細胞自卩遼的標誌性蛋白，結果發現，0_5μΜ的漢防己甲素處理細胞後，與凋亡相關的蛋白PARP、Caspase-8、Caspase-3蛋白都未發生剪切，而與細胞自噬相關的蛋白LC3_ II表達量明顯上調，並且表現出較好的濃度依賴關係。這些結果表明漢防己甲素在較低濃度下可誘導肝癌細胞自噬，而不引發肝癌細胞凋亡。實驗例2 :吖啶橙染色實驗檢測低濃度漢防己甲素(彡5μΜ)處理肝癌細胞Be 17402、HepG2和Huh7引起細胞自噬的影響。為了進一步證實漢防己甲素可誘導肝癌細胞自噬，我們進行了檢測細胞自噬的吖啶橙染色實驗。該染料具有膜通透性，能透過細胞膜，使核DNA和RNA染色。它與細胞中DNA和RNA結合量存在差別，可發出不同顏色的螢光，與DNA結合量少發綠色螢光，與RNA結合量多發桔黃色或桔紅色螢光。因此，在螢光顯微鏡下觀察，吖啶橙使細胞核呈綠色或黃綠色均勻螢光；在自噬後期，在自噬溶酶體內酸性磷酸酶活性增強下，吖啶橙使酸性囊泡顯著著色。在螢光顯微鏡下觀察可以看到明亮的紅色螢光。用5μΜ的漢防己甲素處理Bel7402、HepG2和Huh7細胞8小時、16小時和24小時，吖啶橙染色後，在螢光顯微鏡下觀察。結果顯示，對照組只有極少數著色的自噬細胞，而處理組隨著處理時間的延長，三種肝癌細胞內紅色螢光點的強度和數量明顯增多(圖2)，這說明漢防己甲素可誘導細胞自噬。統計分析表明，隨時間推移，細胞自噬比例逐漸升高，24小時後三種細胞系的自噬比例都達到90%以上(圖 3，4，5)。實驗例3 :電鏡實驗檢測低濃度漢防己甲素(彡5μΜ)處理肝癌細胞Bel7402、HepG2和Huh7引起細胞自 噬的影響。電鏡觀察顯示對照組有極少的自噬泡，處理組則出現大量的自噬泡(圖6，7，8)。
權利要求
1.漢防己甲素在製備癌細胞自噬誘導劑上的應用。
2.如權利要求I所述的應用，其特徵在於所述的癌細胞為肝癌細胞。
全文摘要
本發明公開了漢防己甲素在製備誘導癌症細胞自噬的誘導劑上的應用。本發明採用不同濃度漢防己甲素對肝癌細胞BEL-7402、HepG2和Huh7處理，通過蛋白質雜交和吖啶橙染色，觀察不同濃度漢防己甲素對誘導肝癌細胞形成自噬的能力。結果表明，不同濃度的漢防己甲素都能誘導肝癌細胞形成自噬，且呈濃度和時間依賴效應。
文檔編號A61K31/4748GK102631346SQ20121010524
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年4月12日
發明者劉鑫, 李文化, 梅運軍, 陳超, 龔克 申請人:武漢大學