橋聯的聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物、其製備方法、中間體和用途與流程
2023-10-04 10:10:54
本發明涉及藥物載體領域，特別涉及包含橋聯的聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物的藥物載體領域。
背景技術：
納米尺度的藥物載體能保護藥物分子，改變藥物分子的體內分布和藥物代謝動力學，提高藥物胞內濃度，增強候選藥物成藥性，從而顯著增強藥效並降低毒副作用。基礎研究和應用領域已出現大量以兩親性嵌段聚合物為基礎的藥物輔料及其製劑，已批准上市的基於聚合物的納米藥物也取得了巨大經濟效益。其中代表性的兩親嵌段聚合物是具有優良的生物可降解性、生物可吸收性和生物相容性的聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段聚合物，其以聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚乙醇酸和聚乙二醇-聚己內酯為主。
納米藥物研究初期，通常認為延長顆粒體內循環可改善藥物體內分布，可達到增強治療效果的目的；然而，後續研究發現，在腫瘤的治療中，荷載藥物的納米顆粒在體內應突破多重屏障才能有效提高藥物療效，這些屏障包括：1)藥物分子或顆粒在血液中需有合適及延長的循環時間；2)納米顆粒荷載藥物需增強腫瘤組織中藥物的富集；3)需提高腫瘤細胞對藥物攝取；4)需使得藥物分子從腫瘤細胞內快速釋放。由傳統的兩親性嵌段聚合物，例如前述聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段聚合物，與藥物分子形成的納米藥物表面被親水性組份如聚乙二醇(PEG)覆蓋，有助於延長藥物體內循環時間，並促進藥物在腫瘤組織中富集，但覆蓋在納米藥物表面的PEG分子阻止腫瘤細胞對納米藥物的攝取，甚至阻止藥物分子從進入細胞的納米顆粒中釋放，限制了這些兩親性聚合物作為納米藥物載體的藥物輸送性能，制約其轉化和應用。
研究人員利用腫瘤細胞內特殊的理化微環境，設計了以敏感化學鍵 「橋聯」的兩親性嵌段聚合物，典型的如以二硫鍵、雙硒鍵「橋聯」的兩親性聚合物。這種「橋聯」兩親性聚合物是指利用特殊化學鍵作為親水性組份(如PEG)和其它疏水組分(如脂肪族聚酯)「橋聯」的一類兩親性聚合物，一般情況下，「橋聯」的化學鍵具有對特殊環境(如pH、還原環境)的敏感性，能在特定環境下發生快速降解，從而使得親水疏水組分分離，最終改變由其製備的納米顆粒的組成，導致納米顆粒性能的變化或破壞納米顆粒的結構，從而增強顆粒從內涵體逃逸，或促進藥物的釋放。這些對腫瘤細胞內特殊的理化微環境敏感的「橋聯」兩親性嵌段能解決部分問題，如藥物從納米藥物載體在胞內釋放的問題，但在腫瘤細胞對納米藥物載體的攝取方面沒有作用。
隨著橋聯化聚合物的發展以及「化學鍵庫」的日益擴大，相關工作逐漸轉移至如何改變橋聯化學鍵的組分以實現橋聯聚合物細胞外降解，從而克服聚乙二醇對納米顆粒細胞攝取的阻礙。腫瘤細胞外的腫瘤組織基質特異性微環境主要分為Warburg效應造成的弱酸性環境(pH 6.5-7.0)以及相關與腫瘤發生發展相關特異性表達的酶類物質，而後者更易被利用設計相關橋聯聚合物。如在對基質金屬蛋白酶2(MMP2)敏感的多肽(XPLG*LAGR9X)末端分別鍵合聚乙二醇及聚已內酯後形成的橋聯化聚乙二醇-九聚精氨酸-聚己內酯嵌段聚合物(PEG-XPLG*LAGR9X-PCL)。但以酶敏感的化學鍵橋聯的聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物聚合物載體的實際應用效果並不理想。載體體系的藥效缺乏重複性和普適性。此外，這類橋聯聚合物的合成工藝通常反應效率低，重複性差，在擴大合成方面不具備可實施性。
實體瘤內部環境呈現弱酸性(pH 6.5-7.0)，而納米顆粒在內吞進入腫瘤細胞後還要經歷內涵體/溶酶體中酸性更強的環境(pH 5.0-5.5)，氫離子與化學鍵的結合速度要遠高於酶與多肽化學鍵的結合，以具備pH響應性的化學鍵構建橋聯聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段聚合物的應用範圍將更為實際和廣泛。然而，由於腫瘤細胞內外上述pH值與正常生理環境的pH值相差較小，這對「橋聯」化學鍵的設計和響應敏感度提出了更苛刻的要求。因此，本發明重點旨在提供一類腫瘤基質和細胞內pH響應醯胺鍵橋聯的聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物嵌段聚合物，作為小分子化療藥物和核酸 藥物輸送載體，其能在腫瘤基質和細胞內pH環境下發生特異降解，改變納米顆粒結構，增強腫瘤細胞對納米顆粒的攝取，提高細胞內藥物含量，進而最終提高藥物治療效果。
技術實現要素：
為了解決以上技術問題，本發明首先提供：
第一方面，一種橋聯的聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物，其結構通式III如下：
其中，A3選自CgHh，g、h為整數，0≤g≤4，0≤h≤10；B3是甲基或不存在；C3選自CiHj，i、j為整數，1≤i≤20，2≤j≤42；R3不存在或為烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、滷素原子或被取代的烷基、烷氧基、芳基、芳氧基；PEG表示聚乙二醇殘基，aliphatic polyester表示脂肪族聚酯殘基。
其中，優選A3不存在，或為碳原子數1-4的亞烷基；
優選C3為碳原子數1-20的亞烷基，更優選碳原子數1-6的亞烷基；
優選R3為碳原子數1-6的烷基、碳原子數1-6的烷氧基、碳原子數6-20的芳基、碳原子數6-20的芳氧基、滷素原子，所述的烷基、烷氧基、芳基、芳氧基可以進一步被取代，更優選R3為碳原子數1-6的烷氧基。
2.根據上述第一方面所述的橋聯的聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物，其中聚乙二醇殘基以如下通式表示：
其中，x3為整數，1≤x3≤500。
所述脂肪族聚酯殘基是聚ε-己內酯、聚乳酸或聚乳酸乙醇酸殘基。
其中優選所述脂肪族聚酯的數均分子量為2000-20000；更優選5000-15000；
其中優選聚乳酸乙醇酸中乳酸和乙醇酸重複單元數量的比例為10-90/90-10，更優選20-80/80-20，進一步優選75/25。
3.根據上述第一或第二方面所述的橋聯的聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物的製備方法，包括：將馬來醯胺酸衍生物修飾的聚乙二醇作為引發劑，使脂肪族聚酯單體發生開環聚合反應，既得橋聯的聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物；或將馬來醯胺酸衍生物修飾的聚乙二醇與具有氨基端基的脂肪族聚酯發生大分子偶聯反應，既得橋聯的聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物。
其中優選在無水條件下進行開環聚合反應；
優選在催化劑存在下進行反應；
優選催化劑是有機雜環分子1，5，7-三疊氮雙環(4.4.0)癸-5-烯；
優選溶劑是二氯甲烷；
優選反應在0℃下進行；
優選反應時間是10-120min；
優選所得粗產物經過純化處理，例如沉澱處理。
4.本發明的第四個方面，提供一種馬來醯胺酸衍生物修飾的聚乙二醇，其結構通式II如下：
其中，A2選自CcHd，c、d為整數，0≤c≤4，0≤d≤10；B2為甲基或不存在；C2選自CeHf，e、f為整數，1≤e≤20，2≤f≤42；R2不存在或為烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、滷素原子或被取代的烷基、烷氧基、芳基、芳氧基；PEG表示聚乙二醇殘基。
其中的A2、B2、C2、R2以及PEG可以與根據第一方面的橋聯的聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物中的A3、B3、C3、R3以及PEG相同，並且 優選範圍也可以相同。
5.本發明的第五個方面，提供第四個方面所述的馬來醯胺酸衍生物修飾的聚乙二醇的製備方法，包括將氨基醇與端基含馬來酸酐基團的聚乙二醇混合，利用氨基醇中的伯胺基團與馬來酸酐基團進行開環反應形成醯胺鍵，既得馬來醯胺酸衍生物修飾的聚乙二醇。
其中優選反應在無水溶液體系中或無水條件下進行；
優選在室溫下進行反應；
優選對粗產物進行純化處理；
優選純化處理包括萃取分液和沉澱。
6.本發明的第六個方面，提供一種端基含馬來酸酐基團的聚乙二醇，結構通式I如下：
其中，A1選自CaHb，a、b為整數，0≤a≤4，0≤b≤10；B1為甲基或不存在；R1不存在或為烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、滷素原子或被取代的烷基、烷氧基、芳基、芳氧基；PEG表示聚乙二醇殘基。
其中的A1、B1、R1以及PEG可以與根據第一方面的橋聯的聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物中的A3、B3、R3以及PEG相同，並且優選範圍也可以相同。
7.本發明的第七個方面，提供第六個方面所述的端基含馬來酸酐基團的聚乙二醇的製備方法，包括將馬來酸酐取代基中的羧基進行醯氯化，再與聚乙二醇末端羥基進行反應。
優選醯氯化試劑為草醯氯、二氯亞碸；
優選溶劑為無水二氯甲烷；
優選反應溫度為0-40℃；
優選經過純化處理粗產物；
優選純化處理包括萃取、沉澱。
8.本發明的第八個方面，提供第一或第二個方面所述的橋聯的聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物製備的藥物載體或核酸載體。
其中優選所述載體的製備方法是將聚ε-己內酯、聚乳酸或聚乳酸乙醇酸與聚乙二醇形成的橋聯嵌段共聚物在與水不互溶的有機相中溶解，與水在超聲條件下進行乳化(例如，0℃，50-200W，30-120s)，從而製備納米顆粒；同時，如在有機相中加入疏水性藥物，可以完成對藥物的包載；
優選所述有機相為二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯；
優選所述疏水性藥物為紫杉醇、多西紫杉醇、去鹽酸化阿黴素、全反式維甲酸、羥基喜樹鹼中的一種或多種。
9.本發明的第九個方面，提供一種由第八個方面所述的藥物載體製備的載藥納米顆粒或載核酸納米顆粒。
其中優選納米顆粒包括將聚ε-己內酯、聚乳酸或聚乳酸乙醇酸與聚乙二醇形成的橋聯嵌段共聚物和陽離子脂質在與水不互溶的有機相中溶解，與siRNA水溶液初乳化(例如，0℃，50-200W，30-120s)，再與水進行第二次乳化(例如，0℃，50-200W，30-120s)，除去有機相後，即可得到高效包載siRNA的納米顆粒。
優選所述有機相為二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯；
優選所述陽離子脂質可以為N，N-二羥乙基-N-甲基-N-2-(膽固醇氧羰基氨基)乙基溴化銨和溴化三甲基-2，3-二油醯氧基丙基銨。
10.本發明的第十個方面，提供由第四個方面所述的馬來醯胺酸衍生物修飾的聚乙二醇製備而得的藥物載體或核酸載體，由第六個方面所述的端基含馬來酸酐基團的聚乙二醇製備而得的藥物載體或核酸載體，第八個方面所述的藥物載體或核酸載體，第九個方面所述的載藥納米顆粒或載核酸納米顆粒在製備抗腫瘤藥物中的用途。
附圖說明
圖1.本發明的實施例一中，端基為甲基馬來酸酐的PEG衍生物的化學結構及合成路線。
圖2.本發明的實施例一中，核磁共振氫譜對端基為甲基馬來酸酐的PEG衍生物進行表徵，溶劑為氘代氯仿。圖3.本發明的實施例一中，核 磁共振碳譜對端基為甲基馬來酸酐的PEG衍生物進行表徵，溶劑為氘代氯仿。圖4.本發明的實施例一中，核磁共振氫譜對端基為甲基馬來酸酐的不同分子量的PEG衍生物進行表徵，溶劑為氘代氯仿。
圖5.本發明的實施例二中，端基為馬來酸酐的PEG衍生物的化學結構及合成路線。圖6.本發明的實施例二中，核磁共振氫譜對端基為馬來酸酐的PEG衍生物進行表徵，溶劑為氘代氯仿。圖7.本發明的實施例二中，核磁共振碳譜對端基為馬來酸酐的PEG衍生物進行表徵，溶劑為氘代氯仿。圖8.本發明的實施例二中，核磁共振氫譜對端基為馬來酸酐的不同分子量的PEG衍生物進行表徵，溶劑為氘代氯仿。
圖9.本發明的實施例三中，α-PEG-β-甲基-6-羥己基馬來醯胺酸的化學結構及合成路線。圖10.本發明的實施例三中，核磁共振氫譜對α-PEG-β-甲基-6-羥己基馬來醯胺酸進行表徵，溶劑為氘代氯仿。圖11.本發明的實施例三中，核磁共振碳譜對α-PEG-β-甲基-6-羥己基馬來醯胺酸進行表徵，溶劑為氘代氯仿。圖12.本發明的實施例三中，核磁共振氫譜對不同分子量的α-PEG-β-甲基-6-羥己基馬來醯胺酸進行表徵，溶劑為氘代氯仿。
圖13.本發明的實施例四中，α-PEG-6-羥己基馬來醯胺酸的化學結構及合成路線。圖14.本發明的實施例四中，核磁共振氫譜對α-PEG-6-羥己基馬來醯胺酸進行表徵，溶劑為氘代氯仿。圖15.本發明的實施例四中，核磁共振碳譜對α-PEG-6-羥己基馬來醯胺酸進行表徵，溶劑為氘代氯仿。圖16.本發明的實施例四中，核磁共振氫譜對不同分子量的α-PEG-β-甲基-6-羥己基馬來醯胺酸進行表徵，試劑為氘代氯仿。
圖17.本發明的實施例五中，可酸催化水解醯胺鍵Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸共聚物的化學結構及合成路線。圖18.本發明的實施例五中，凝膠滲透色譜表徵Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸共聚物。圖19.本發明的實施例五中，核磁共振氫譜對Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸共聚物的化學結構進行表徵，溶劑為氘代氯仿。圖20.本發明的實施例五中，核磁共振碳譜對Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸共聚物的化學結構進行表徵，溶劑為氘代氯仿。
圖21.本發明的實施例六中，可酸催化水解醯胺鍵Dlink橋聯的聚乙 二醇-Dlink-聚乳酸共聚物的化學結構及合成路線。圖22.本發明的實施例六中，凝膠滲透色譜表徵Dlink橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚乳酸共聚物。
圖23.本發明的實施例六中，核磁共振氫譜可酸催化水解醯胺鍵Dlink橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚乳酸共聚物的化學結構進行表徵，試劑為氘代氯仿。圖24.本發明的實施例六中，核磁共振碳譜對Dlink橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚乳酸共聚物的化學結構進行表徵，溶劑為氘代氯仿
圖25.本發明的實施例七中，可酸催化水解醯胺鍵Dlink(或Dlinkm)橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚己內酯(或聚乙二醇-Dlinkm-聚己內酯)共聚物的化學結構及合成路線。圖26.本發明的實施例七中，凝膠滲透色譜表徵Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚己內酯共聚物。圖27.本發明的實施例七中，凝膠滲透色譜表徵Dlink橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚己內酯共聚物。圖28.本發明的實施例七中，核磁共振氫譜對可酸催化水解醯胺鍵Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚己內酯共聚物的化學結構進行表徵，溶劑為氘代氯仿。圖29.本發明的實施例七中，核磁共振氫譜對可酸催化水解醯胺鍵Dlink橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚己內酯共聚物的化學結構進行表徵，試劑為氘代氯仿。圖30.本發明的實施例七中，核磁共振碳譜對Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚己內酯共聚物的化學結構進行表徵，試劑為氘代氯仿。圖31.本發明的實施例七中，核磁共振碳譜對Dlink橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚己內酯共聚物的化學結構進行表徵，試劑為氘代氯仿
圖32.本發明的實施例八中，可酸催化水解醯胺鍵Dlinkm和Dlink橋聯的聚乙二醇-聚乳酸乙醇酸共聚物的化學結構及合成路線。圖33.本發明的實施例八中，凝膠滲透色譜表徵Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸乙醇酸共聚物。PLGA處下標分別代表D，L-LA和GA的聚合度。圖34.本發明的實施例八中，凝膠滲透色譜表徵Dlink橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚乳酸乙醇酸共聚物。PLGA處下標分別代表D，L-LA和GA的聚合度。圖35.本發明的實施例八中，核磁共振氫譜對可酸催化水解醯胺鍵Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸乙醇酸共聚物的化學結構進行表徵，試劑為氘代氯仿。圖36.本發明的實施例八中，核磁共振氫譜對可酸催化水解醯胺鍵Dlink橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚乳酸乙醇酸共聚物的化學結構進行表徵，試劑為氘代氯仿。圖37.本發明的實施例八中，核磁共振碳譜 對Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸乙醇酸共聚物的化學結構進行表徵，試劑為氘代氯仿。圖38.本發明的實施例八中，核磁共振碳譜對Dlink橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚乳酸乙醇酸共聚物的化學結構進行表徵，試劑為氘代氯仿。
圖39.本發明的實施例十中，(A)橋聯聚合物降解示意圖；高效液相色譜檢測對(B)mPEG113-Dlinkm-PDLLA42、(C)mPEG113-Dlinkm-PDLLA71、(D)mPEG113-Dlinkm-PDLLA142、(E)mPEG113-Dlink-PDLLA140組裝形成的納米顆粒在不同pH環境下的降解行為進行檢測。
圖40.本發明的實施例十一中，流式細胞術對NPPDLLA以及Dm-NPPDLLA在不同pH條件下處理後MDA-MB-231細胞的細胞攝取進行檢測。螢光標記Dm-NPPDLLA和NPPDLLA製備方法如實施例九所述，組分為mPEG113-Dlinkm-PDLLA142和mPEG113-b-PDLLA140。
圖41.本發明的實施例十二中，ICR小鼠體內不同組分納米顆粒的體內循環。RhoB標記的納米顆粒Dm-NPPDLLA和NPPDLLA製備方法如實施例九所述，組分為mPEG113-Dlinkm-PDLLA142和mPEG113-b-PDLLA140。
圖42.本發明的實施例十三中，不同處理組對MDA-MB-231原位腫瘤模型的抑制，多西紫杉醇的給藥劑量為3.5mg/kg。包載多西紫杉醇的NPPDLLA/DTXL，Dm-NPPDLLA/DTXL以及D-NPPDLLA/DTXL製備方法如實施例九所述，組分分別為mPEG113-b-PDLLA72、mPEG113-Dlinkm-PDLLA70以及mPEG113-Dlink-PDLLA75。通過函數t-test計算顯著性差異，*p＜0.05。
圖43.本發明的實施例十四中，雙乳化納米顆粒攜載siRNA在不同pH條件下對siRNA的釋放。攜載siRNA的納米顆粒Dm-NPPLGA/FAM-siNC和NPPLGA/FAM-siNC製備方法如實施例九所述，組分為mPEG113-Dlinkm-PLGA161/54和mPEG113-b-PLGA165/56。
圖44.本發明的實施例十五中，流式細胞術檢測MDA-MB-231細胞對不同pH條件下處理攜載siRNA的雙乳化納米顆粒的攝取行為。攜載siRNA的納米顆粒Dm-NPPLGA/Cy5-siNC和NPPLGA/Cy5-siNC製備方法如實施例九所述，組分為mPEG113-Dlinkm-PLGA161/54和mPEG113-b-PLGA165/56。MFI為細胞內平均螢光強度。通過函數t-test計算顯著性差異，**p＜0.01。圖 45.本發明的實施例十五中，高效液相色譜定量檢測MDA-MB-231細胞對不同pH條件下處理攜載siRNA的雙乳化納米顆粒的攝取行為。攜載siRNA的納米顆粒Dm-NPPLGA/Cy5-siNC和NPPLGA/Cy5-siNC製備方法如實施例九所述，組分為mPEG113-Dlinkm-PLGA161/54和mPEG113-b-PLGA165/56。通過函數t-test計算顯著性差異，*p＜0.05。圖46.本發明的實施例十五中，雷射共聚焦掃描顯微鏡觀察MDA-MB-231細胞對不同pH條件下處理攜載siRNA的雙乳化納米顆粒的攝取行為。攜載siRNA的納米顆粒Dm-NPPLGA/Cy5-siNC和NPPLGA/Cy5-siNC製備方法如實施例九所述，組分為mPEG113-Dlinkm-PLGA161/54和mPEG113-b-PLGA165/56。
圖47.本發明的實施例十六中，雙乳化納米顆粒攜載siRNA在pH 7.4(A)和pH 6.5(B)條件下對MDA-MB-231細胞的PLK1基因進行下調。攜載siRNA的納米顆粒Dm-NPPLGA/Cy5-siNC、NPPLGA/Cy5-siNC、Dm-NPPLGA/siPLK1和NPPLGA/siPLK1製備方法如實施例九所述，組分為mPEG113-Dlinkm-PLGA161/54和mPEG113-b-PLGA165/56。通過函數t-test計算顯著性差異，*p＜0.05。
圖48.本發明的實施例十七中，蛋白質印跡法檢測雙乳化納米顆粒攜載siRNA(Dm-NPPLGA/Cy5-siNC、NPPLGA/Cy5-siNC、Dm-NPPLGA/siPLK1和NPPLGA/siPLK1)在pH 6.5條件下對MDA-MB-231細胞的PLK1蛋白的影響。
圖49.本發明的實施例十八中，雙乳化納米顆粒攜載siRNA在pH 6.5條件下對MDA-MB-231細胞的細胞活力影響。攜載siRNA的納米顆粒(Dm-NPPLGA/Cy5-siNC、NPPLGA/Cy5-siNC、Dm-NPPLGA/siPLK1和NPPLGA/siPLK1)製備方法如實施例九所述，組分為mPEG113-Dlinkm-PLGA161/54和mPEG113-b-PLGA165/56。通過函數t-test計算顯著性差異，*p＜0.05。
圖50.本發明的實施例十九中，MDA-MB-231荷瘤小鼠體內攜載siRNA的雙乳化納米顆粒體內分布。攜載siRNA的納米顆粒(Dm-NPPLGA/Cy5-siNC和NPPLGA/Cy5-siNC)製備方法如實施例九所述，組分為mPEG113-Dlinkm-PLGA161/54和mPEG113-b-PLGA165/56。通過函數t-test計算顯著性差異，**p＜0.01。
圖51.本發明的實施例二十中，不同處理組對MDA-MB-231原位腫瘤模型的抑制。攜載siRNA的納米顆粒(Dm-NPPLGA/siPLK1和NPPLGA/siPLK1) 製備方法如實施例九所述，組分為mPEG113-Dlinkm-PLGA161/54和mPEG113-b-PLGA165/56。通過函數t-test計算顯著性差異，*p＜0.05。
具體實施方式
本發明首先提供一種端基含馬來酸酐基團的聚乙二醇(PEG)的衍生物，本發明涉及的聚乙二醇衍生物結構通式I如下：
其中，A1可以選自CaHb，a、b為整數，0≤a≤4，0≤b≤10；B1可以為甲基或不存在；R1不存在或為烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、滷素原子或被取代的烷基、烷氧基、芳基、芳氧基；PEG表示聚乙二醇殘基。
其中，優選A1不存在，或為碳原子數1-4的亞烷基；
優選R1為碳原子數1-6的烷基、碳原子數1-6的烷氧基、碳原子數6-20的芳基、碳原子數6-20的芳氧基、滷素原子，所述的烷基、烷氧基、芳基、芳氧基可以進一步被取代，更優選R1為碳原子數1-6的烷氧基。
聚乙二醇PEG是以如下通式表示：
其中，x1為整數，20≤x1≤500。
本發明進一步提供了一種端基含馬來酸酐基團的聚乙二醇衍生物的合成方法。
所述合成端基含馬來酸酐基團的聚乙二醇衍生物的方法是將馬來酸酐取代基中的羧基先進行醯氯化，製備醯氯化的馬來酸酐取代物，再在溫和條件下與聚乙二醇末端羥基進行反應，經過萃取、沉澱的方式純化，從而最終合成端基含馬來酸酐基團的聚乙二醇衍生物。所述方法中，醯氯化試劑為草醯氯、二氯亞碸等，但不僅限於此範圍；選取溶劑為無水二氯甲烷，反應溫度為0-40℃。
其次，本發明提供另一類馬來醯胺酸衍生物修飾的聚乙二醇(PEG)，其結構通式II如下：
其中，A2選自CcHd，c、d為整數，0≤c≤4，0≤d≤10；B2為甲基或不存在；C2選自CeHf，e、f為整數，1≤e≤20，2≤f≤42；R2不存在或為烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、滷素原子或被取代的烷基、烷氧基、芳基、芳氧基；PEG表示聚乙二醇殘基。
其中，優選A2不存在，或為碳原子數1-4的亞烷基；
優選C2為碳原子數1-20的亞烷基，更優選碳原子數1-6的亞烷基；
優選R2為碳原子數1-6的烷基、碳原子數1-6的烷氧基、碳原子數6-20的芳基、碳原子數6-20的芳氧基、滷素原子，所述的烷基、烷氧基、芳基、芳氧基可以進一步被取代，更優選R2為碳原子數1-6的烷氧基。
聚乙二醇是以如下通式表示：
其中，x2為整數，20≤x2≤500。
本發明提供了上述聚乙二醇衍生物的相應合成方法，所述聚乙二醇衍生物的合成方法是在溫和的無水溶液體系下，將氨基醇與端基含馬來酸酐基團的聚乙二醇衍生物按照一定比例混合，利用氨基醇中的伯胺基團與馬來酸酐基團進行開環反應，在室溫下形成特定的醯胺鍵，在反應後經萃取分液和沉澱的方式對產物進行處理純化，以得到最終的預期產物。
本發明提供了一類橋聯的聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物(Aliphatic Polyester)，其結構通式III如下：
其中，A3選自CgHh，g、h為整數，0≤g≤4，0≤h≤10；B3是甲基或不存在；C3選自CiHj，i、j為整數，1≤i≤20，2≤j≤42；R3不存在或為烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、滷素原子或被取代的烷基、烷氧基、芳基、芳氧基；PEG表示聚乙二醇殘基，aliphatic polyester表示脂肪族聚酯殘基。
其中，優選A3不存在，或為碳原子數1-4的亞烷基；
優選C3為碳原子數1-20的亞烷基，更優選碳原子數1-6的亞烷基；
優選R3為碳原子數1-6的烷基、碳原子數1-6的烷氧基、碳原子數6-20的芳基、碳原子數6-20的芳氧基、滷素原子，所述的烷基、烷氧基、芳基、芳氧基可以進一步被取代，更優選R3為碳原子數1-6的烷氧基。
其中聚乙二醇殘基以如下通式表示：
其中，x3為整數，1≤x3≤500。
本發明提供了一種橋聯化聚乙二醇-脂肪族聚酯的優選合成方法。
所述合成橋聯化聚乙二醇-脂肪族聚酯的優選合成方法為利用通式II所示的聚乙二醇衍生物作為大分子引發劑，在無水條件下利用有機雜環分子1，5，7-三疊氮雙環(4.4.0)癸-5-烯作為催化劑，使用二氯甲烷作為溶劑，在0℃進行溶液聚合引發ε-己內酯、丙交酯或乙交酯等單體的開環聚合反應，反應時間為10-120min，經過沉澱等方式最終達到純化效果，從而最終合成對應的橋聯化聚乙二醇-脂肪族聚酯。與常規合成橋聯化聚合物所使用的大分子偶聯方法不同，該合成路線簡便可控、利於重複；產物不包含未反應的高分子均聚物，便於純化，更具備可行性。
以下式為例，與非橋聯化嵌段聚合物相比，橋聯化聚乙二醇-脂肪族聚酯包含特定結構的醯胺基團。
這使得本發明涉及的橋聯聚合物具有其他特徵，即與處在中性條件下相比，醯胺鍵結構會在弱酸性條件下發生特異性降解，產生兩個不同組分：
當B3或B2為不存在時，橋聯醯胺鍵可在pH 5.0-6.0範圍發生降解，其中pH 5.0-5.5範圍內降解速度更快：
當B3或B2為甲基時，橋聯醯胺鍵可在pH 6.0-7.0範圍發生降解，其中pH 6.0-6.5範圍內降解速度更快：
本發明還提供了一種通過將嵌段共聚物在水中製備成納米顆粒，負載疏水性藥物從而形成納米藥物輸送體系的方法。
本發明所述製備方法是將聚ε-己內酯、聚乳酸或聚乳酸乙醇酸與聚乙二醇形成的橋聯嵌段共聚物在與水不互溶的有機相中溶解，與水在超聲條件下進行乳化(0℃，50-200W，30-120s)，從而製備納米顆粒；同時，如在有機相中加入疏水性藥物，可以完成對藥物的包載，且包載效率穩定、重複性好。所述有機相為二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯，但不局限於此範圍；所述疏水性藥物為紫杉醇、多西紫杉醇、去鹽酸化阿黴素、全反式維甲酸、羥基喜樹鹼等中的一種或多種，但不局限於此範圍。
本發明提供了通過將嵌段共聚物在水中製備成納米顆粒，負載親水性小幹擾RNA(siRNA)從而形成納米藥物輸送體系的方法。
所述合成方法是將聚ε-己內酯、聚乳酸或聚乳酸乙醇酸與聚乙二醇形成的橋聯嵌段共聚物和陽離子脂質在與水不互溶的有機相中溶解，與siRNA水溶液初乳化(0℃，50-200W，30-120s)，再與水進行第二次乳化(0℃，50-200W，30-120s)，除去有機相後，即可得到高效包載siRNA的納米顆粒。所述有機相為二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯，但不局限於此範圍；所述陽離子脂質可以為N，N-二羥乙基-N-甲基-N-2-(膽固醇氧羰基氨基)乙基溴化銨和溴化三甲基-2，3-二油醯氧基丙基銨，但不局限於此範圍。
本發明由聚ε-己內酯、聚乳酸或聚乳酸乙醇酸與聚乙二醇形成的橋聯嵌段共聚物，其聚乙二醇嵌段的穩定性與環境的pH條件有關，利用此性質，本發明所製備得到的納米載體可用於針對腫瘤組織的體內藥物輸送。在血液循環過程中(pH 7.4，PEG穩定存在)藉助聚乙二醇對納米顆粒的保護作用，可以較好地延長攜載藥物的循環時間，提高藥物生物利用度，降低藥物的體內毒性；而當納米顆粒進入腫瘤組織(pH 6.0-6.5)或腫瘤細胞(pH 5.0-5.5)後，橋聯醯胺鍵響應性降解，PEG會從納米顆粒表面脫落，納米載體的結構被破壞，細胞攝取或藥物釋放能力顯著提高，從而克服傳統非橋聯聚合物在藥物輸送過程中面臨的數重障礙，增加在腫瘤細胞內的活性分子含量，達到更強的腫瘤細胞增殖抑制。因此，與目前臨床 或基礎研究領域廣泛採用的游離藥物相比，本發明的橋聯化聚合物可有望提高其療效並降低毒副作用。
此外，本發明涉及的橋聯化聚合物的性質能夠通過調節聚合物組分、親疏水嵌段的分子量來進行調節，反應原料易得，反應條件溫和，工藝簡便，有利於放大化和批量生產。
本發明得到了針對腫瘤組織或腫瘤細胞內特定pH響應化學鍵橋聯的聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物，可用於小分子藥物或大分子核酸藥物的包載及其體內輸送。與傳統的聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段聚合物相比，本發明設計的橋聯聚合物在顆粒穩定性、體外藥物釋放、血液循環等方面有相同性能，但能夠藉助腫瘤組織或細胞內特異性pH調控納米顆粒表面的PEG程度，增強細胞攝取和胞內藥物釋放，進一步提高藥物療效。本發明為了合成得到橋聯聚乙二醇-脂肪族聚酯嵌段共聚物，使用的聚合反應條件溫和，來源易得，反應後純化過程簡便；該類聚合物組裝形成納米顆粒後，對腫瘤微環境的響應速度快，能顯著提高抗腫瘤藥效。
以下以實施例的方式描述本發明的某些具體實施方式，但是這些實施例僅用於說明目的，而不是用於限制本發明的範圍。
實施例
實施例中的縮寫：
(1)mPEG，聚乙二醇單甲醚
(2)PEG，聚乙二醇
(3)CDM，2-羧乙基-3-甲基馬來酸酐
(4)CSM，2-羧乙基-馬來酸酐
(5)TBD，1，5，7-三疊氮雙環(4.4.0)癸-5-烯
(6)ε-CL，ε-己內酯
(7)PCL，聚ε-己內酯
(8)D，L-LA，外消旋丙交酯
(9)PDLLA，聚乳酸
(10)GA，乙交酯
(11)PLGA，聚乳酸乙醇酸無規共聚物
(12)BHEM-Chol，N，N-二羥乙基-N-甲基-N-2-(膽固醇氧羰基氨基)乙基溴化銨
(13)RhoB，羅丹明B
(14)DIC，N，N-二異丙基碳二亞胺
(15)DMAP，4-二甲氨基吡啶
(16)PCL-RhoB，羅丹明B標記聚己內酯
(17)DTXL，多西紫杉醇
(18)siRNA，小幹擾RNA
實施例中原料來源及處理方法：
(1)mPEG，分子量2000，5000，10000，20000，Sigma-Aldrich公司，使用前經甲苯共沸蒸餾除水
(2)mPEG，分子量3400，上海景宇生物技術有限公司，使用前經甲苯共沸蒸餾除水
(3)PEG，分子量6000，Sigma-Aldrich公司，使用前經甲苯共沸蒸餾除水
(4)D，L-LA，濟南岱罡生物工程有限公司
(5)DTXL，武漢大華偉業醫藥化工有限公司
(6)GA，濟南岱罡生物工程有限公司
(7)ε-CL，日本大賽璐化學工業株式會社
(8)TBD，Sigma-Aldrich公司
(9)α-酮戊二甲酯，Sigma-Aldrich公司
(10)噻唑藍，Sigma-Aldrich公司
(11)安萬特醫藥
(12)紅色螢光和綠色螢光標記的siRNA(Cy5-siNC和FAM-siNC)，蘇州瑞博生物技術有限公司，反義鏈序列：5』-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3』
(13)PLK1 siRNA，蘇州瑞博生物技術有限公司，反義鏈序列：
5』-UAAGGAGGGUGAUCUUCUUCAdTdT-3』
(14)二氯甲烷和氯仿，液相色譜級，韓國森山公司，經布勞恩公司SPS800溶劑純化裝置處理
(15)MDA-MB-231細胞，ATCC公司
(16)Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM)完全培養基，Invitrogen公司
(17)ICR小鼠，北京華阜康生物科技股份有限公司
(18)BALB/c nude小鼠，北京華阜康生物科技股份有限公司
(19)未經特別說明的其它試劑，均為可從常規化學試劑公司商購獲得的分析純級別的試劑，直接使用
(20)陽離子脂質BHEM-Chol的具體合成過程如下：
在500毫升燒瓶內將2-溴乙胺氫溴酸鹽(17.4g，85.0mmol)和氯甲酸膽固醇酯(34.7g，77.3mmol)溶解於-30℃的氯仿溶液中，然後將三乙胺(24mL，172mmol)滴加到上述溶液中。在室溫下反應過夜後，用1M鹽酸的飽和氯化鈉溶液(150mL)洗滌三次，並用飽和氯化鈉溶液洗滌一次(150mL)。有機相用無水硫酸鎂乾燥後在減壓下除去有機溶劑得到粗產物。粗產物用乙醇和丙酮各重結晶一次後得到N-(2-溴乙基)氨基甲酸膽固醇酯。將得到的N-(2-溴乙基)氨基甲酸膽固醇酯(4.8g，7.8mmol)和N-甲基二乙醇胺(1.2g，9.7mmol)加入到50毫升乾燥的甲苯中，回流過夜。反應溶液沉澱到大量的乙醚中，過濾後收集沉澱並真空乾燥，在乙醇中重結晶產物兩次後得到白色固體，即得BHEM-Chol。
(21)聚乙二醇-聚乳酸(mPEG-b-PDLLA)具體合成過程如下：
將聚乙二醇單甲醚(mPEG113，1.0g，0.2mmol)和外消旋丙交酯(2.5g，17.4mmol)在手套箱內加入到乾燥的圓底燒瓶中，130℃加熱至二者熔融，攪拌條件下加入異辛酸亞錫(12.2mg，0.03mmol)，繼續反應2h。粗產物在二氯甲烷中溶解，並沉澱至冷的無水乙醚/甲醇(4/1，v/v)兩次。收集沉澱，真空乾燥至恆重，即得到聚乙二醇-聚乳酸嵌段聚合物。
對該聚合物進行核磁共振氫譜和凝膠滲透色譜分析，乳酸聚合度為140，聚合物分子量分布為1.14，記為mPEG113-b-PDLLA140。
(22)聚乙二醇-聚乳酸乙醇酸(mPEG-b-PLGA)具體合成過程如下：
將聚乙二醇單甲醚(mPEG113，1.0g，0.2mmol)、外消旋丙交酯(2.5g，17.4mmol)和乙交酯(0.76g，6.6mmol)在手套箱內加入到乾燥的圓底燒瓶中，130℃加熱至二者熔融，攪拌條件下加入異辛酸亞錫(24.1 mg，0.06mmol)，繼續反應2h。粗產物在二氯甲烷中溶解，並沉澱至冷的無水乙醚/甲醇(4/1，v/v)兩次。收集沉澱，真空乾燥至恆重，即得到聚乙二醇-聚乳酸嵌段聚合物。
對該聚合物進行核磁共振氫譜和凝膠滲透色譜分析，乳酸聚合度為165，乙醇酸聚合度為56，聚合物分子量分布為1.12，記為mPEG113-b-PLGA165/56。
(23)聚ε-己內酯(PCL)，參考文獻(Polymer，2009，50，5048-5054)合成和表徵，具體過程如下：
稱取ε-CL(0.92g，8mmol)，加入約15mL甲苯，攪拌約10分鐘後，加入85μL含0.188mmol Al(OiPr)3的甲苯溶液，於25℃下反應1小時，加入乙酸終止反應。將反應液中的甲苯用旋轉蒸發儀濃縮後，沉澱到冷的甲醇中，過濾，得到的聚合物在25℃下真空乾燥到恆重，即得到聚己內酯均聚物。
對該聚合物進行核磁共振氫譜和凝膠滲透色譜分析，己內酯聚合度為30，分子量分布為1.06，記為PCL30。
(24)羅丹明B標記聚己內酯(PCL-RhoB)，合成過程如下：
稱取PCL30(0.50g，0.14mmol)、RhoB(0.211g，0.42mmol)、DIC(0.055g，0.70mmol)和DMAP(0.055g，0.70mmol)並溶解於10mL N，N-二甲基甲醯胺中，在25℃、避光條件下反應48小時。反應結束後，在N，N-二甲基甲醯胺中透析以除去未參與反應的RhoB，真空乾燥至恆重即得PCL-RhoB。
(25)2-羧乙基-3-甲基馬來酸酐(CDM)，參考文獻(Angewandte Chemie International Edition，2013，52，6218-6221)合成和表徵，具體過程如下：
將低溫下經50mL無水四氫呋喃淋洗兩次的NaH(0.720g，0.030mol)懸浮於60mL無水四氫呋喃，在冰浴中攪拌。向懸浮液中緩慢滴加2-膦醯丙酸三乙脂(8.568g，0.036mol)，待體系不再產生氫氣後，加入α-酮戊二甲酯(6.960g，0.040mmol)，冰浴中反應0.5小時，然後加入30mL飽和NH4Cl溶液終止反應。產物用100mL無水乙醚萃取兩次，收集有機相，經無水MgSO4乾燥，濃縮，用200目矽膠柱層析分離純化，展開劑 為無水乙醚/正己烷(v/v，2/1)，收集Rf＝0.6的物質，乾燥，進一步溶解於80mL無水乙醇，加入KOH溶液(2.0M，80mL)，加熱回流1h。體系冷卻至室溫，加入鹽酸(6.0M)調節pH至2.0，用200mL乙酸乙酯萃取，收集有機相，乾燥，減壓蒸餾除去乙酸乙酯溶劑，粗產物在無水乙醚中重結晶，得CDM(3.892g，產率54.6％)。
對CDM進行電噴霧電離質譜分析，該物質理論分子量為184.15，而檢測到的m/z＝185.12即為[M+H]+的信號峰，證明產物結構與預期吻合。
(26)2-羧乙基馬來酸酐(CSM)，合成和表徵具體過程如下：
將低溫下經50mL無水四氫呋喃淋洗兩次的NaH(0.720g，0.030mol)懸浮於60mL無水四氫呋喃，在冰浴中攪拌。向懸浮液中緩慢滴加三乙基膦醯乙酸酯(8.064g，0.036mol)，待體系不再產生氫氣後，加入α-酮戊二甲酯(6.960g，0.040mmol)，冰浴中反應0.5小時，然後加入30mL飽和NH4Cl溶液終止反應。產物用100mL無水乙醚萃取兩次，收集有機相，經無水MgSO4乾燥，濃縮，用200目矽膠柱層析分離純化，展開劑為無水乙醚/正己烷(v/v，2/1)，收集Rf＝0.65的物質，乾燥，進一步溶解於80mL無水乙醇，加入KOH溶液(2.0M，80mL)，加熱回流1h。體系冷卻至室溫，加入鹽酸(6.0M)調節pH至2.0，用200mL乙酸乙酯萃取，收集有機相，乾燥，減壓蒸餾除去乙酸乙酯溶劑，粗產物在無水乙醚中重結晶，得CSM(3.496g，產率52.80％)。
對CSM進行電噴霧電離質譜分析，該物質理論分子量為170.12，而檢測到的m/z＝171.24即為[M+H]+的信號峰，證明產物結構與預期吻合。
實施例一：端基為甲基馬來酸酐的PEG衍生物的合成
端基為甲基馬來酸酐的PEG衍生物的化學結構及合成路線如附圖1所示。
在0℃下，將CDM(1.840g，0.010mol)在無水二氯甲烷(20mL)中完全溶解，依次加入N，N-二甲基甲醯胺(50μL)和草醯氯(3.810g，0.030mol)，反應10min後，25℃下繼續反應1h。使用旋轉蒸發儀除去二氯甲烷，在15.0Pa下蒸餾除去N，N-二甲基甲醯胺，獲得中間產物醯氯化CDM(1.96g，產率97％)。
將mPEG(或PEG)、吡啶、醯氯化CDM在0℃下按1.0∶6.0∶3.0 的摩爾比例依次加入到乾燥二氯甲烷(聚合物濃度為0.1M)中攪拌溶解，在0℃下反應30min後轉入25℃繼續反應2h。反應結束後，加入與CH2Cl2等體積的飽和NH4Cl溶液，充分萃取後收集有機相，將無水MgSO4乾燥後的有機相使用旋轉蒸發儀濃縮，並在0℃下用無水乙醚沉澱，真空乾燥固體至恆重。
對上述合成得到的端基為甲基馬來酸酐的PEG衍生物進行核磁共振氫譜(1H NMR)分析，測定其分子結構，1H NMR譜見圖2。對上述端基為甲基馬來酸酐的PEG衍生物進行核磁共振碳譜(13C NMR)分析，以對其分子結構進行進一步確認，13C NMR見圖3。核磁共振氫譜對不同分子量的端基為甲基馬來酸酐的PEG衍生物進行表徵，結果見圖4。
圖2(A)中，字母a所示信號歸屬於聚乙二醇單甲醚末端甲基的質子氫，位於3.67ppm處的信號峰b則歸屬於聚乙二醇骨架-CH2CH2O-的質子氫。由於CDM的鍵合，c、d均為新出現的信號峰，其中c歸屬於CDM中的兩個亞甲基的質子氫；而d則歸屬於CDM中甲基的的質子氫。CDM的鍵合效率通過3.67ppm的信號峰與2.13ppm處的信號峰的積分面積計算得到，反應效率高於98％。
在圖2(B)中，由於使用雙羥基為末端的聚乙二醇，因此不存在聚乙二醇單甲醚末端甲基的質子氫信號，而其它質子信號則與圖2(A)相似，積分面積計算顯示CDM的反應效率高於98％。
圖3中，端基為甲基馬來酸酐的PEG衍生物的所有碳原子均能在13CNMR中找到相應的信號歸屬。其中，70.4ppm附近信號峰歸屬於聚乙二醇主鏈的碳原子，而174.4ppm處的信號峰則是醯氯化反應生成的酯鍵中碳原子的信號峰，9.8ppm處的信號歸屬於酸酐取代基中的甲基碳原子， 13C NMR的結果進一步證實製備得到的端基為甲基馬來酸酐的PEG衍生物結構的正確性。
由圖4可見不同分子量的聚乙二醇單甲醚與CDM鍵合後產物的1H NMR圖譜，其各個質子信號峰均與圖2(A)相似，證明了該方法可以合成不同分子量的端基為甲基馬來酸酐的PEG衍生物。
實施例二：端基為馬來酸酐的PEG衍生物的合成
端基為馬來酸酐的PEG衍生物的化學結構及合成路線如附圖5所示。
端基為馬來酸酐的PEG衍生物具體合成方法和端基為甲基馬來酸酐的PEG衍生物相似，以2-羧乙基馬來酸酐(CSM)代替2-羧乙基-3-甲基馬來酸酐(CDM)進行。
在0℃下，CSM(3.080g，0.020mol)在無水二氯甲烷(35mL)中完全溶解，依次加入N，N-二甲基甲醯胺(45μL)和草醯氯(7.620g，0.060mol)，反應10min後，25℃繼續反應1h。使用旋轉蒸發儀除去二氯甲烷，在15.0Pa下蒸餾除去N，N-二甲基甲醯胺，獲得醯氯化CSM(3.420g，產率91％)。
將mPEG(或PEG)、吡啶、醯氯化CSM在0℃下按1.0∶6.0∶3.0的摩爾比例依次加入到乾燥二氯甲烷(mPEG或PEG濃度為0.1M)中攪拌溶解，在0℃下反應30min後轉入25℃繼續反應2h。反應結束後，加入與CH2Cl2等體積的飽和NH4Cl溶液，充分萃取後收集有機相，將無水MgSO4乾燥後的有機相使用旋轉蒸發儀濃縮，並在0℃下用無水乙醚沉澱，真空乾燥固體至恆重。
對上述合成得到的端基為馬來酸酐的PEG衍生物進行1H NMR分析，測定其分子結構，1H NMR譜見圖6。對上述端基為馬來酸酐的PEG衍生物進行13C NMR分析，以對其分子結構進行進一步確認，13C NMR見圖7。核磁共振氫譜對端基為馬來酸酐的不同分子量的PEG衍生物進行表徵，結果見圖8。
圖6(A)中，字母a所示信號峰歸屬於聚乙二醇單甲醚末端甲基的質子氫，位於3.65ppm處的單峰b則歸屬於聚乙二醇骨架-CH2CH2O-的質子氫。由於CSM的鍵合，c，d，e均為新出現的信號峰，其中d歸屬於CSM中的兩個亞甲基質子氫；而e則歸屬於馬來酸酐中的質子。CSM的鍵合效率通過3.65ppm的信號峰與2.74ppm處的多重峰的積分面積計算得到，反應效率高於97％。
在圖6(B)中，由於使用雙羥基聚乙二醇，因此不存在聚乙二醇單甲醚末端甲基的質子氫，而其它質子信號則與圖6(A)一致，積分面積計算顯示CSM的鍵合效率高於98％。
圖7中，端基為馬來酸酐的PEG衍生物的所有碳原子均能在13C NMR中找到相應的歸屬。其中，70.3ppm附近信號峰歸屬於聚乙二醇主鏈的 碳原子，而174.1ppm處的信號峰則是醯氯化反應生成的酯鍵中碳原子的信號峰，與核磁共振氫譜對應的是在9.8ppm處歸屬於CDM分子酸酐取代基中的甲基碳原子的信號並未出現，13C NMR的結果進一步證實製備得到的端基為馬來酸酐的PEG衍生物結構的正確性。
由圖8可見不同分子量的聚乙二醇單甲醚與CSM鍵合後產物1H NMR譜，其各個質子信號峰均與圖6(A)相似，證明了該方法可以合成不同分子量的端基為馬來酸酐的PEG衍生物。
實施例三：α-PEG-β-甲基-6-羥己基馬來醯胺酸的合成
α-PEG-β-甲基-6-羥己基馬來醯胺酸的化學結構及合成路線如附圖9所示，所得產物表示為mPEG-Dlinkm-OH或HO-Dlinkm-PEG-Dlinkm-OH。
在25℃下，將端基為甲基馬來酸酐的PEG衍生物與6-氨基-1-己醇共同在無水CH2Cl2中完全溶解攪拌反應(聚合物濃度為0.1M，6-氨基-1-己醇與聚乙二醇羥基摩爾量為3∶1)。反應12h後，連續加入飽和NaCl溶液進行兩次萃取，收集有機相，在0℃下用過量的無水乙醚進行沉澱，減壓抽濾後，真空乾燥固體至恆重。
對上述合成得到的α-PEG-β-甲基-6-羥己基馬來醯胺酸進行1H NMR分析，測定其分子結構，1H NMR譜見圖10。對上述α-PEG-β-甲基-6-羥己基馬來醯胺酸進行13C NMR分析，以對其分子結構進行進一步確認， 13C NMR見圖11。核磁共振氫譜對不同分子量的α-PEG-β-甲基-6-羥己基馬來醯胺酸進行表徵，結果見圖12。
圖10(A)中，字母a-k標記了所有核磁氫譜中的信號峰，並依次歸屬對應產物的各個質子信號。由於6-氨基-1-己醇的引入，3.23ppm以及1.30-1.60ppm處發現新的質子信號並能正確歸屬於反應後的6-氨基-1-己醇的質子；而原有端基為甲基馬來酸酐的PEG衍生物在2.13ppm處酸酐基團中甲基的單信號峰，則由於酸酐環狀結構打開而在1.85ppm及1.94ppm處出現兩個信號峰，證明了開環反應的成功進行。6-氨基-1-己醇與酸酐基團的反應效率則通過3.38ppm的聚乙二醇單甲醚的甲基信號峰與1.30-1.60ppm處的多重峰的積分面積計算得到，證實開環反應的效率大於96％。
在圖10(B)中，由於使用雙羥基聚乙二醇，因此不存在單甲醚聚乙二醇單甲醚末端甲基的質子氫信號，而其它質子信號則與圖10(A)一致，積分面積計算顯示馬來酸酐的開環效率高於96％。
圖11中，α-PEG-β-甲基-6-羥己基馬來醯胺酸的所有碳原子均能在13C NMR中找到相應的歸屬。其中，71.2ppm附近信號峰歸屬於聚乙二醇主鏈的碳原子，而173.9ppm處的峰則是醯氯化反應生成的酯鍵中碳原子的信號峰，7.9ppm處歸屬於酸酐取代基中的甲基碳原子的信號，20.0-40.0ppm處的新出現的信號歸屬於6-氨基-1-己醇中部分亞甲基碳原子，13C NMR的結果進一步證實製備得到的α-PEG-β-甲基-6-羥己基馬來醯胺酸結構的正確性。
由圖12可見不同分子量的α-PEG-β-甲基-6-羥己基馬來醯胺酸的1H NMR譜，其各個質子信號峰均與圖10(A)相似，證明了該方法對合成不同分子量的α-PEG-β-甲基-6-羥己基馬來醯胺酸均適用。
實施例四：α-PEG-6-羥己基馬來醯胺酸的合成
α-PEG-6-羥己基馬來醯胺酸的化學結構及合成路線如附圖13所示，所得產物表示為mPEG-Dlink-OH或HO-Dlink-PEG-Dlink-OH。
在25℃下，將端基為馬來酸酐的PEG衍生物與6-氨基-1-己醇共同在無水CH2Cl2中完全溶解攪拌反應(聚合物濃度為0.1M，6-氨基-1-己醇與聚乙二醇羥基摩爾量為3∶1)。反應12h後，連續加入飽和NaCl溶液進行兩次萃取，收集有機相，在0℃下用過量的無水乙醚進行沉澱，減壓抽濾後，真空乾燥固體至恆重。
對上述合成得到的α-PEG-6-羥己基馬來醯胺酸進行1H NMR分析，測定其分子結構，1H NMR譜見圖14。對上述α-PEG-6-羥己基馬來醯胺酸進行13C NMR分析，以對其分子結構進行進一步確認，13C NMR見圖15。核磁共振氫譜對不同分子量的α-PEG-β-甲基-6-羥己基馬來醯胺酸進行表徵，結果見圖16。
圖14(A)中，字母a-k標記了所有核磁氫譜中的信號峰，並依次歸屬對應產物的各個質子。由於6-氨基-1-己醇的引入，3.24ppm以及1.20-1.80ppm處發現新的質子信號並能正確歸屬於反應後的6-氨基-1-己醇的質子。6-氨基-1-己醇與酸酐基團的反應效率則通過3.37ppm的聚乙 二醇單甲醚的甲基信號峰與1.20-1.80ppm處的多重峰的積分面積計算得到，證實開環反應的效率大於96％。
在圖14(B)中，由於使用雙羥基聚乙二醇，因此不存在聚乙二醇單甲醚末端甲基的質子氫，而其它質子信號則與圖14(A)一致，積分面積計算顯示馬來酸酐的開環效率高於96％。
圖15中，α-PEG-6-羥己基馬來醯胺酸的所有碳原子均能在13C NMR中找到相應的歸屬。其中，71.1ppm附近信號峰歸屬於聚乙二醇主鏈的碳原子，而173.9ppm處的峰則是醯氯化反應生成的酯鍵中碳原子的信號峰，20.0-40.0ppm處的信號可歸屬於6-氨基-1-己醇中部分亞甲基碳原子。與圖11相比，7.9ppm處歸屬於酸酐取代基中的甲基碳原子的信號消失， 13C NMR的結果進一步證實製備得到的端基為馬來酸酐的PEG衍生物結構正確。
由圖16可見不同分子量的α-PEG-6-羥己基馬來醯胺酸1H NMR圖譜，各個質子信號峰均與圖14(A)相似，證明了該方法對合成不同分子量的α-PEG-6-羥己基馬來醯胺酸均適用。
實施例五：可酸催化水解醯胺鍵Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸共聚物的合成
可酸催化水解醯胺鍵Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸共聚物的化學結構及合成路線如附圖17所示。
具有不同分子量的Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸嵌段聚合物是以α-PEG-β-甲基-6-羥己基馬來醯胺酸為引發劑，在溶液條件下引發D，L-LA單體聚合而成。D，L-LA以及大分子引發劑在使用前經過真空乾燥過夜。通過調節反應過程中單體與大分子引發劑的投料比，可以得到不同分子量聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸嵌段聚合物。1，5，7-三疊氮雙環(4.4.0)癸-5-烯(TBD)屬於有機雜環非金屬催化劑，其催化效率較高，已經被證明較適用於內酯及交酯等環狀單體的開環聚合。合成的具體實驗步驟如下：
聚合反應在惰性氣體手套箱(購自：布勞恩惰性氣體系統(上海)有限公司)中進行(O2與H2O的濃度均小於0.1ppm)，以mPEG-Dlinkm-OH或HO-Dlinkm-PEG-Dlinkm-OH作為引發劑為例，合成的具體實驗步驟如 下：
1)將進行反應的圓底燒瓶經多次的抽真空火焰乾燥和充氮氣的處理後，放入手套箱。
2)按表1的配比進行投料：向燒瓶中加入mPEG-Dlinkm-OH(或HO-Dlinkm-PEG-Dlinkm-OH)、D，L-LA單體、CH2Cl2和TBD，在0℃攪拌下反應。
3)反應結束後，使用旋轉蒸發儀將體系濃縮，用0℃的乙醚甲醇混合溶劑(乙醚∶甲醇＝20∶1，v/v，100mL)沉澱兩次，收集沉澱物，用油泵抽乾至恆重為止，即得產物。
表1 不同投料比(質量比)合成Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm--聚乳酸共聚物
用凝膠滲透色譜(GPC)法以聚苯乙烯為標準分析聚乙二醇-聚乳酸嵌段聚合物的數均分子量和分子量分布寬度指數(PDI)，GPC譜見圖18，數均分子量和分子量分布PDI見表2。
由圖18可見，嵌段聚合物的GPC譜均為單峰，而且不存在拖尾現象即無大分子引發劑的信號峰，表明大分子引發劑已完全消耗且得到了預期的嵌段共聚物。
表2 Dlinkm橋聯的聚乙二醇-聚乳酸共聚物的分子量與組成
a由1H NMR得到；b由GPC得到；c由GPC得到。
對上述Dlinkm橋聯的聚乙二醇-聚乳酸共聚物進行1H NMR分析，測定其聚合度和數均分子量，1H NMR譜見圖19。對上述Dlinkm橋聯的聚乙二醇-聚乳酸共聚物進行13C NMR分析，以進一步對其結構進行確認， 13C NMR譜見圖20。
圖19中，mPEG-Dlink-PDLLA的1H NMR圖譜字母a到g標記了歸屬於兩嵌段聚合物的質子氫。聚乳酸的聚合度通過1.58ppm的多重峰(歸屬於聚乳酸的-CH3)與3.67ppm的單峰(歸屬於聚乙二醇的-OCH2CH2-)的積分面積比計算得到。
圖20為mPEG113-Dlinkm-PDLLA71的13C NMR圖譜，字母a到r標記了歸屬於嵌段聚合物的碳原子。其中，71.2ppm處信號峰歸屬於聚乙二醇主鏈中的碳原子，168.9ppm處的信號峰歸屬於大分子引發劑以及聚乳酸主鏈中的羰基信號峰，16.7ppm處為聚乳酸嵌段甲基碳原子信號，核磁共振碳譜的結果進一步驗證了嵌段聚合物的結構。
實施例六：可酸催化水解醯胺鍵Dlink橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚乳酸共聚物的合成
可酸催化水解醯胺鍵Dlink橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚乳酸共聚物的化學結構及合成路線如附圖21所示。
各種分子量Dlink橋聯的聚乙二醇聚-Dlink-乳酸嵌段聚合物是以α-PEG-6-羥己基馬來醯胺酸為引發劑，在溶液條件下引發D，L-LA單體聚合而成。D，L-LA以及大分子引發劑在使用前經過真空乾燥過夜。通過調節反應過程中單體與大分子引發劑的投料比，可以得到不同分子量聚乙二醇-Dlink-聚乳酸嵌段聚合物，合成的具體實驗步驟如下：
聚合反應在惰性氣體手套箱中進行(O2與H2O的濃度均小於0.1ppm)，以mPEG113-Dlink-OH或HO-Dlink-PEG136-Dlink-OH作為引發劑為例，合成的具體實驗步驟如下：
1)將進行反應的圓底燒瓶經多次的抽真空火焰乾燥和充氮氣的處理後，放入手套箱。
2)按表3的配比進行投料：向燒瓶中加入mPEG113-Dlink-OH(或HO-Dlink-PEG136-Dlink-OH)、D，L-LA單體、CH2Cl2和TBD，在0℃攪拌下反應。
3)反應結束後，使用旋轉蒸發儀將體系濃縮，用0℃的乙醚甲醇混合溶劑(乙醚∶甲醇＝20∶1，v/v，100mL)沉澱兩次，收集沉澱物，用油泵抽乾至恆重為止，即得產物。
表3 不同投料比(質量比)合成Dlink橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚乳酸共聚物
用凝膠滲透色譜法以聚苯乙烯為標準分析聚乙二醇-Dlink-聚乳酸嵌段聚合物的數均分子量和分子量分布寬度指數，GPC譜見圖22，數均分子量和分子量分布PDI見表4。
由圖22可見，嵌段聚合物的GPC譜均為單峰，而且不存在拖尾現象即無大分子引發劑的信號峰，表明大分子引發劑已完全消耗且得到了預期的嵌段共聚物。
表4 Dlink橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚乳酸共聚物的分子量與組成
a由1H NMR得到；b由GPC得到；c由GPC得到。
對上述Dlink橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚乳酸共聚物進行核磁共振氫譜分析，測定其聚合度和數均分子量，1H NMR譜見圖23。對上述Dlink橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚乳酸共聚物進行核磁共振碳譜分析，以進一步對其結構進行確認，13C NMR譜見圖24。
圖23中，mPEG-Dlink-PDLLA的1H NMR圖譜字母a到f標記了歸屬於兩嵌段聚合物的質子氫。聚乳酸的聚合度通過1.58ppm的多重峰(歸屬於聚乳酸的-CH3)與3.65ppm的單峰(歸屬於聚乙二醇的-OCH2CH2-)的積分面積比計算得到。
圖24為mPEG113-Dlink-PDLLA42的13C NMR圖譜，字母a到q標記了歸屬於兩嵌段聚合物的碳原子。與圖20相比，7.8ppm處酸酐取代基中的甲基碳信號峰消失而其它信號峰均較為相似，進一步驗證了嵌段聚合物的結構。
實施例七：Dlink(或Dlinkm)橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚己內酯(或聚乙二醇-Dlinkm-聚己內酯)共聚物的合成
Dlink(或Dlinkm)橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚己內酯(或聚乙二醇-Dlinkm-聚己內酯)共聚物化學結構及合成路線如附圖25所示。
各種分子量酸敏感化學鍵橋聯聚乙二醇和聚己內酯的嵌段聚合物是以α-PEG-β-甲基-6-羥己基馬來醯胺酸或α-PEG-6-羥己基馬來醯胺酸為引發劑，在溶液條件下引發ε-CL單體聚合而成。大分子引發劑在使用前經過真空乾燥過夜。通過調節ε-CL與引發劑的投料比，可以得到不同分子量的酸敏感化學鍵橋聯聚乙二醇和聚己內酯的嵌段聚合物。
聚合反應在惰性氣體手套箱中進行(O2與H2O的濃度均小於0.1ppm)，合成的具體實驗步驟如下：
1)將進行反應的圓底燒瓶經多次的抽真空火焰乾燥和充氮氣的處理後，放入手套箱。
2)按表5的配比進行投料：向燒瓶中加入大分子引發劑、ε-CL單體、CH2Cl2和TBD，在0℃攪拌下反應。
3)反應結束後，使用旋轉蒸發儀將體系濃縮，用0℃的乙醚甲醇混合溶劑(乙醚∶甲醇＝20∶1，v/v，100mL)沉澱兩次，收集沉澱物，用油泵抽乾至恆重為止，即得產物。
表5 不同投料比(質量比)合成Dlink(或Dlinkm)橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚己內酯(或聚乙二醇-Dlinkm-聚己內酯)共聚物
用凝膠滲透色譜法以聚苯乙烯為標準分析共聚物的數均分子量和分子量分布，GPC譜見圖26和27，數均分子量和分子量分布PDI見表6。
由圖26和27可見，沒有大分子引發劑存在產生的拖尾現象，表明大分子引發劑已完全消耗且得到了預期的兩嵌段共聚物。
表6 Dlink(或Dlinkm)橋聯的聚乙二醇-Dlink-聚己內酯(或聚乙二醇-Dlinkm-聚己內酯)共聚物的分子量與組成
a由1H NMR得到；b由GPC得到；c由GPC得到。
對上述Dlinkm和Dlink橋聯的共聚物進行核磁共振氫譜分析，測定其聚合度和數均分子量，1H NMR譜見圖28和29。對上述Dlinkm和Dlink橋聯的共聚物進行核磁共振碳譜分析，13C NMR譜見圖30和31。
圖28和29中，字母a到m標記了歸屬於嵌段聚合物的質子氫。聚己內酯的聚合度通過4.08ppm的多重峰(歸屬於聚己內酯的-OC(O)CH2)與3.65ppm的單峰(歸屬於聚乙二醇的-OCH2CH2-)的積分面積比計算得到。
圖30為mPEG77-Dlinkm-PCL95的13C NMR圖譜，字母a到u標記了歸屬於嵌段聚合物的碳原子。其中，72.1ppm處信號峰歸屬於聚乙二醇主鏈中的碳原子，174.2ppm和169.1ppm處的信號峰歸屬於大分子引發 劑以及聚己內酯主鏈中羰基的信號峰，20.0-40.0ppm處信號峰歸屬於聚己內酯嵌段亞甲基及6-氨基-己醇的亞甲基碳原子信號，9.9ppm處則為Dlinkm中甲基碳原子信號峰，核磁共振碳譜的結果進一步驗證了嵌段聚合物的結構。
圖31為mPEG77-Dlink-PCL70的13C NMR圖譜，字母a到t標記了歸屬於嵌段聚合物的碳原子。與圖30相比，7.84ppm附近歸屬於Dlinkm中的甲基的信號峰消失而其它信號峰相似。
實施例八：Dlinkm(或Dlink)橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸乙醇酸(或聚乙二醇-Dlink-聚乳酸乙醇酸)共聚物的合成
Dlinkm(或Dlink)橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸乙醇酸(或聚乙二醇-Dlink-聚乳酸乙醇酸)共聚物的化學結構及合成路線如附圖32所示。
各種分子量酸敏感化學鍵橋聯聚乙二醇和聚乳酸乙醇酸的嵌段聚合物是以α-PEG-β-甲基-6-羥己基馬來醯胺酸或α-PEG-6-羥己基馬來醯胺酸為引發劑，在溶液條件下引發D，L-LA和GA混合單體聚合而成，其中目標產物中聚乳酸和聚乙醇酸的重複單元比例為3比1。D，L-LA和GA單體以及大分子引發劑在使用前經過真空乾燥過夜。通過調節單體與引發劑的投料比，可以得到不同分子量的酸敏感化學鍵橋聯聚乙二醇和聚乳酸乙醇酸的嵌段聚合物。
聚合反應在惰性氣體手套箱中進行(O2與H2O的濃度均小於0.1ppm)，合成的具體實驗步驟如下：
1)將進行反應的圓底燒瓶經多次的抽真空火焰乾燥和充氮氣的處理後，放入手套箱。
2)按表7的配比進行投料：向燒瓶中加入大分子引發劑、D，L-LA和GA單體、CH2Cl2和TBD，在0℃攪拌下反應。
3)反應結束後，使用旋轉蒸發儀將體系濃縮，用0℃的乙醚甲醇混合溶劑(乙醚∶甲醇＝20∶1，v/v，100mL)沉澱兩次，收集沉澱物，用油泵抽乾至恆重為止，即得產物。
表7 不同投料比(質量比)合成Dlinkm(或Dlink)橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸乙醇酸(或聚乙二醇-Dlink-聚乳酸乙醇酸)共聚物
用凝膠滲透色譜法以聚苯乙烯為標準分析共聚物的數均分子量和分子量分布寬度指數，GPC譜見圖33和34，數均分子量和分子量分布PDI見表8。
由圖33和34可見，共聚物的GPC譜為單峰，而沒有大分子引發劑存在產生的拖尾現象，表明大分子引發劑已完全消耗且得到了預期的兩嵌段共聚物。
表8 Dlinkm和Dlink橋聯聚乙二醇和聚乳酸乙醇酸的嵌段共聚物的分子量與組成
a由1H NMR得到；b由GPC得到；c由GPC得到。
對上述Dlinkm和Dlink橋聯的聚乙二醇和聚乳酸乙醇酸的嵌段共聚物進行核磁共振氫譜分析，測定其聚合度和數均分子量，1H NMR譜見圖35和36。對上述Dlinkm和Dlink橋聯的聚乙二醇和聚乳酸乙醇酸的嵌段共聚物進行核磁共振碳譜分析，13C NMR譜見圖37和38。
圖35和36中，字母a到g標記了歸屬於嵌段聚合物的質子氫。1.59ppm、4.83ppm以及5.22ppm處的多重複歸屬於聚乳酸乙醇酸嵌段的質子，聚乳酸乙醇酸的聚合度通過1.59ppm的多重峰(歸屬於聚乳酸中-CH3)、4.83ppm處多重峰(歸屬於聚乙醇酸中-CH2-)與3.65ppm的單峰(歸屬於聚乙二醇的-OCH2CH2-)的積分面積比計算得到。
圖37為mPEG45-Dlinkm-PLGA112/39的13C NMR圖譜，字母a到t標記了歸屬於嵌段聚合物的碳原子信號。其中，72.4ppm處信號峰歸屬於聚乙二醇主鏈中的碳原子，20.0-40.0ppm處信號峰歸屬於聚己內酯嵌段亞甲基及6-氨基-己醇的碳原子信號，16.7ppm處信號峰歸屬於聚乳酸乙醇酸中甲基的碳原子，7.9ppm處則為Dlinkm中甲基信號峰，核磁共振碳譜的結果進一步驗證了嵌段聚合物的結構。
圖38為mPEG77-Dlink-PLGA20/7的13C NMR圖譜，字母a到s標記了歸屬於嵌段聚合物的碳原子。與圖37相比，7.9ppm附近歸屬於Dlinkm中的甲基的信號峰消失而其它信號峰相似。
實施例九：納米顆粒製備
兩親性聚乙二醇-脂肪族聚酯可以在一定條件下通過各種方法在水中形成膠束或囊泡狀納米顆粒，同時其疏水內核能夠對疏水性藥物分子或螢光染料進行包載，親水結構在陽離子脂質輔助下可結合siRNA。本實施例採用不同乳化方法製備以下納米顆粒。
製備空載的納米顆粒，以mPEG-Dlinkm-PDLLA為例，具體方法為：將質量為10mg的mPEG113-Dlinkm-PDLLA142溶解在200μL的乙酸乙酯中，向上述溶液中加入1mL的水，然後在冰浴下超聲1min(130W，工作4s停2s，共60s)，再加入2mL水，轉移至圓底燒瓶，立即減壓蒸發除去乙酸乙酯。
製備載藥的納米顆粒，以mPEG-Dlink-PDLLA為例，具體方法為：將質量為10mg的mPEG113-Dlink-PDLLA142以及1mg的多西紫杉醇(DTXL)溶解在200μL的乙酸乙酯中，向上述油相中加入1mL的水，然後在冰浴下超聲1min(130W，工作4s停2s，共60s)，再加入2mL水，轉移至圓底燒瓶，立即減壓蒸發除去乙酸乙酯，使用切向流超濾系統(頗爾過濾器(北京)有限公司)除去游離的DTXL。
製備螢光標記納米顆粒，以mPEG-Dlinkm-PDLLA為例，製備方法如下：將mPEG113-Dlinkm-PDLLA142與PCL-RhoB同時溶解於乙酸乙酯，其質量比例為100∶3。取上述聚合物儲液200μL(10mg)，向其中加入1mL的超純水，然後超聲1min(0℃，130W，工作4s停2s，共60s)，再向體系加入2mL超純水，轉移至圓底燒瓶立即減壓蒸發除去乙酸乙酯，使用切向流裝置除去游離的PCL-RhoB。
製備包載siRNA的納米顆粒，以mPEG-Dlinkm-PLGA為例，製備方法如下：取400μL的mPEG113-Dlinkm-PLGA161/54三氯甲烷儲液(62.5mg/mL)，加入100μL的BHEM-Chol儲液(10mg/mL，三氯甲烷)，再加入25μL的PLK1 siRNA儲液(8mg/mL)，超聲1min(0℃，130W，工作5s停2s，共60s)，再向體系加入5mL無RNase水，再次超聲1min(0℃，130W，工作10s停2s，共60s)，轉移至圓底燒瓶立即減壓蒸發除去三氯甲烷。
實施例十：納米顆粒降解測定
在弱酸性環境下，如圖39A所示，可酸水解化學鍵Dlinkm或Dlink中的醯胺鍵會發生降解，生成兩組均聚物，分別為聚乙二醇和相應的脂肪族聚酯。本實施例在不同pH條件下通過定量分析降解後得到的聚乙二醇，對Dlinkm或Dlink化學鍵的酸敏感性進行檢測。本實施例中的單乳化納米 顆粒製備方法如實施例九所示，選取組分為mPEG113-Dlinkm-PDLLA42、mPEG113-Dlinkm-PDLLA71、mPEG113-Dlinkm-PDLLA142和mPEG113-Dlink-PDLLA140。
採用單乳化方法製備納米顆粒後，利用磷酸鹽緩衝液調節顆粒溶液pH至5.50、6.50和7.40(磷酸鹽緩衝液濃度為20mM)，將溶液在37℃、60rpm轉速下處理，在不同的時間間隔，將含有100mg納米顆粒的磷酸鹽緩衝溶液取出，100000g離心30min後，將上層液體凍幹，通過高效液相色譜檢測其PEG釋放量，結果見圖39。
由圖39可見，在pH 6.5條件下，Dlinkm橋聯的嵌段聚合物在24h內約有超過50％的PEG分子被釋放，而在對照條件下(pH 7.4)僅有不足20％的釋放量；與此同時，Dlink橋聯兩嵌段聚合物在模擬胞內環境的pH 5.5條件下同樣響應性地釋放了大於60％的PEG分子，證明了兩種酸水解化學鍵橋聯的聚乙二醇脂肪族聚酯組裝形成的納米顆粒能夠在不同的腫瘤微環境刺激下，相對快速地釋放PEG分子。
實施例十一：納米顆粒在微酸性環境下降解PEG以增強細胞攝取
在本實施例中，通過流式細胞術檢測細胞對於RhoB標記的納米顆粒的攝取情況來研究酸性環境下降解PEG前後納米顆粒的行為。本實施例以mPEG113-Dlinkm-PDLLA142和mPEG113-b-PDLLA140製備螢光標記納米顆粒，製備方法如實施例九所述，顆粒命名為Dm-NPPDLLA和NPPDLLA。
在24孔板中種入5×104個MDA-MB-231細胞，加入0.5mL的Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM)完全培養基，置於CO2培養箱中培養過夜，吸去舊的培養基，向每個孔中加入含有Dm-NPPDLLA以及NPPDLLA的新鮮培養基溶液(pH 6.5和7.4分別處理不同時間)，於37℃的CO2培養箱中培養2h。實驗結束後，將細胞消化用PBS洗滌兩遍並用1％多聚甲醛溶液重懸(200μL)，用流式細胞分析儀(Becton Dickinson)進行檢測，其結果如圖40。
由圖40可見，對於NPPDLLA而言，由於在兩種不同pH條件下，其納米顆粒組分不存在變化，因此其攝取行為沒有明顯區別；而對於Dm-NPPDLLA，其在pH 7.4條件下的細胞內吞量與NPPDLLA相比有少量增加， 但在pH 6.5條件下細胞攝取行為明顯增強，參考實施例十中納米顆粒的降解行為，認為在模擬腫瘤環境的pH條件下的顆粒降解下調了納米顆粒表面PEG密度，解決了PEG對顆粒攝取的障礙。
實施例十二：單乳化納米顆粒在體內的循環情況
在本實施例中，通過高效液相色譜檢測納米顆粒在小鼠血液中的循環情況，研究酸水解化學鍵橋聯的嵌段共聚物組裝形成的納米顆粒與非酸水解化學鍵橋聯的嵌段共聚物組裝形成的納米顆粒的血液循環性能。螢光標記的顆粒製備方法如實施例九所述。在本實施例中，聚合物組分選取為mPEG113-Dlinkm-PDLLA142和mPEG113-b-PDLLA140，製備得到的納米顆粒記為Dm-NPPDLLA和NPPDLLA。
本實施例在ICR小鼠體內進行，首先通過尾靜脈注射Dm-NPPDLLA以及NPPDLLA，RhoB的每次給藥劑量為60μg。在注射後不同時間點經眼底靜脈叢摘取血，得到的血液樣本在加入肝素鈉後10000rpm離心5min獲取血漿，將血漿通過有機溶劑萃取並經高效液相色譜檢測分析其中RhoB的含量，結果見圖41。由圖可見，Dm-NPPDLLA以及NPPDLLA兩種納米顆粒在血液中的循環情況基本一致，沒有顯著性差異，說明在體內循環過程中PEG層能夠保護納米顆粒，延長血液循環時間。
實施例十三：納米顆粒攜載化療藥物對乳腺癌生長的抑制
在本實施例中，使用MDA-MB-231原位乳腺癌小鼠腫瘤模型，模型建立具體過程如下：在DMEM完全培養基中培養MDA-MB-231細胞，在建立模型前6小時用無血清DMEM培養細胞，胰酶消化，經過1000rpm離心收集細胞，用PBS重懸細胞使細胞密度達到2×107cells/mL。將100μL細胞懸液注射在裸鼠右側第二個乳腺中。本實施例以mPEG113-b-PDLLA72、mPEG113-Dlinkm-PDLLA70和mPEG113-Dlink-PDLLA75以及製備載藥納米顆粒，製備方法如實施例九所述，顆粒命名為NPPDLLA/DTXL、Dm-NPPDLLA/DTXL以及D-NPPDLLA/DTXL。
原位注射乳腺癌細胞的裸鼠在SPF級動物房中飼養7天左右可以形 成可見腫瘤。腫瘤的體積按照公式：V＝0.5*a*b*b計算，其中a是指腫瘤較長的直徑，b是指腫瘤較短的直徑。在裸鼠的腫瘤體積達到60mm3左右開始進行治療，將接種了MDA-MB-231腫瘤的20g裸鼠按照下述處理方式分為5組，每組5隻裸鼠。分別使用200uL PBS、200μL溶解70μg 的PBS溶液、200μL NPPDLLA/DTXL的PBS溶液、200μL Dm-NPPDLLA/DTXL和200μL D-NPPDLLA/DTXL的PBS溶液，其中納米顆粒所包載的DTXL量為70μg。每7天為一個治療周期共進行三次給藥，每3天測量一次腫瘤體積。圖42顯示了腫瘤生長情況，圖中的縱坐標為測量得到的腫瘤體積相對治療第一天腫瘤體積的比例。從圖中可以看出，PBS以及低劑量的DTXL對腫瘤的生長沒有抑制作用。相比於無法降解的聚乙二醇-聚乳酸組裝形成的NPPDLLA/DTXL，Dm-NPPDLLA/DTXL以及D-NPPDLLA/DTXL載藥納米膠束抑制MDA-MB-231乳腺癌的效果更強。
實施例十四：Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸共聚物製備的納米顆粒在不同pH條件下的siRNA釋放測定
本實施例選取mPEG113-Dlinkm-PLGA161/54和mPEG113-b-PLGA165/56，在雙乳化方法下(實施例9)輔以BHEM-Chol製備攜載FAM-siNC的納米顆粒，分別命名為Dm-NPPLGA/FAM-siNC和NPPLGA/FAM-siNC。將納米顆粒溶液分別用pH為5.50、6.50和7.40的緩衝溶液稀釋至5mL(10mg/mL)，37℃、60rpm下培養。在不同時間間隔，取100μL納米顆粒溶液，離心2h(20000g)，高效液相色譜檢測上層清液中FAM-siNC含量，結果見圖43。
由圖43可見，在pH 7.4三種條件下，Dm-NPPLGA/FAM-siNC和NPPLGA/FAM-siNC兩種納米顆粒的siRNA釋放行為基本一致。在偏酸環境下(pH 6.5和pH 5.5)，兩種納米顆粒的siRNA釋放量在40％-60％，Dm-NPPLGA/FAM-siNC的siRNA釋放略快於NPPLGA/FAM-siNC，說明Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸乙醇酸共聚物製備的納米顆粒與非酸水解化學鍵橋聯的聚乙二醇脂肪族聚酯組裝形成的納米顆粒在細胞內外多種pH條件下對siRNA具有相似的釋放行為。此外，在24h時有一半的siRNA釋放出來，有利於快速沉默胞內基因表達。
實施例十五：聚乙二醇-脂肪族聚酯納米顆粒在微酸性環境下增強細胞攝取
在本實施例中，分別通過半定量流式細胞術、定量高效液相色譜和定性雷射共聚焦顯微鏡分別檢測觀察細胞對於包載Cy5-siNC的納米顆粒的攝取情況。本實施例選取mPEG113-Dlinkm-PLGA161/54和mPEG113-b-PLGA165/56，在雙乳化方法下輔以BHEM-Chol製備攜載Cy5-siNC的納米顆粒，分別命名為Dm-NPPLGA/Cy5-siNC和NPPLGA/Cy5-siNC。
首先通過流式細胞術半定量檢測酸性環境下細胞對納米顆粒的攝取情況。在24孔板中種入5×104個MDA-MB-231細胞，加入0.5mL的DMEM完全培養基，置於CO2培養箱中培養過夜。吸去舊的培養基，向每個孔中加入含有Dm-NPPLGA/Cy5-siNC和NPPLGA/Cy5-siNC的新鮮培養基溶液(pH 6.5和7.4分別處理不同時間)，於37℃的CO2培養箱中培養4h。實驗結束後，將細胞消化用PBS洗滌兩遍並用4％多聚甲醛溶液重懸(200μL)，用流式細胞分析儀(Becton Dickinson)進行檢測，其結果如圖44。由圖44可見，對於NPPLGA/Cy5-siNC，由於在兩種不同pH條件下，其納米顆粒組分不存在變化，因此其攝取行為沒有明顯區別；而對於Dm-NPPLGA/Cy5-siNC，其在pH 7.4條件下的細胞內吞量與NPPLGA/Cy5-siNC相比有少量增加，但在pH 6.5條件下細胞攝取行為明顯增強，可以認為在模擬腫瘤環境的pH條件下的顆粒降解下調了納米顆粒表面PEG密度，增強了細胞對於攜載siRNA納米顆粒的攝取。
通過高效液相色譜定量檢測酸性環境下降解PEG前後細胞對納米顆粒的攝取情況。在6孔板中種入2×105個MDA-MB-231細胞，加入2mLDMEM完全培養基，置於CO2培養箱中培養過夜，吸去舊的培養基，向每個孔中加入含有Dm-NPPLGA/Cy5-siNC和NPPLGA/Cy5-siNC的新鮮培養基溶液(pH 6.5和7.4分別處理)，於37℃的CO2培養箱中培養4h。實驗結束後，將細胞消化用PBS洗滌兩遍後裂解細胞，通過高效液相色譜檢測胞內攝取的Cy5-siNC含量，其結果如圖45。由圖45可見，對於NPPLGA/Cy5-siNC而言，在pH 7.4和pH 6.5條件下，每百萬細胞的Cy5-siNC內吞量都在15pmol左右；而對於Dm-NPPLGA/Cy5-siNC，經過pH 6.5條件處理，其每百 萬細胞的Cy5-siNC內吞量由pH 7.4條件下的16pmol上升到25pmol，這一結果也表明在模擬腫瘤酸性環境下的Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸共聚物製備的納米顆粒能夠增強細胞的攝取。
通過雷射共聚焦定性檢測酸性環境下降解PEG前後細胞對納米顆粒的攝取情況。在24孔板中放入細胞爬片，種入5×104個MDA-MB-231細胞，加入0.5mL的DMEM完全培養基，置於CO2培養箱中培養過夜，吸去舊的培養基，向每個孔中加入含有Dm-NPPLGA/Cy5-siNC以及NPPLGA/Cy5-siNC的新鮮培養基溶液(pH 6.5和7.4分別處理不同時間)，於37℃的CO2培養箱中培養4h。實驗結束後，用4％多聚甲醛溶液固定細胞，0.1％Triton X-100穿膜後通過Alexa Fluor 488標記細胞骨架，DAPI標記細胞核，通過雷射共聚焦(蔡司LSM 710)進行觀察，其結果如圖46。由圖46可見，Dm-NPPLGA/Cy5-siNC組細胞內的Cy5螢光信號明顯強於NPPLGA/Cy5-siNC，這也間接證明了在模擬腫瘤酸性環境下的顆粒降解了PEG後能夠增強細胞對顆粒的攝取。此外，細胞內兩種顆粒的都是均勻分布在細胞質，胞內定位沒有明顯差異。
實施例十六：Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸乙醇酸共聚物製備的包載小幹擾RNA的納米顆粒在微酸性環境下對乳腺癌細胞PLK1基因mRNA表達的抑制
在本實施例中，通過定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測細胞攝取包載PLK1 siRNA的納米顆粒後PLK1 mRNA表達水平變化來研究酸性環境下降解PEG前後納米顆粒攝取對PLK1表達水平的影響。包載PLK1 siRNA的納米顆粒的製備方法如實施例九所述。選取組分為mPEG113-Dlinkm-PLGA161/54和mPEG113-b-PLGA165/56，製備得到顆粒記為Dm-NPPLGA/siPLK1和NPPLGA/siPLK1。
在6孔板中種入2×105個MDA-MB-231細胞，加入2mL的DMEM完全培養基，置於CO2培養箱中培養過夜，吸去舊的培養基，向每個孔中分別加入含有Dm-NPPLGA/siPLK1、NPPLGA/siPLK1，以及包載對照siRNA的納米顆粒Dm-NPPLGA/siNC、NPPLGA/siNC新鮮培養基溶液(培養基的pH值分 別設置為6.5和7.4)，於37℃的CO2培養箱中培養6h，吸去包含納米顆粒的培養基，更換為新鮮培養基，繼續於37℃的CO2培養箱中培養24h。實驗結束後，將細胞消化用PBS洗滌兩遍，然後使用Takara公司RNAiso plus提取細胞總RNA，通過定量PCR的方法檢測PLK1 mRNA表達水平的變化，其結果如圖47。
由圖47可見，pH 7.4條件下，由於Dm-NPPLGA/siPLK1納米顆粒未發生大量的PEG降解，與NPPLGA/siPLK1的表面PEG密度沒有明顯差異，因此Dm-NPPLGA/siPLK1和NPPLGA/siPLK1對細胞PLK1 mRNA表達的抑制水平沒有顯著差異；而pH 6.5條件下，由於Dm-NPPLGA/siPLK1納米顆粒在微酸性環境下降解PEG以增強細胞攝取，因此Dm-NPPLGA/siPLK1對細胞PLK1 mRNA表達的抑制強於NPPLGA/siPLK1，與對照組相比，PLK1 mRNA的表達量僅在20％。
實施例十七：Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸乙醇酸共聚物製備的包載小幹擾RNA的納米顆粒在微酸性環境下對乳腺癌腫瘤細胞PLK1基因蛋白表達的抑制
在本實施例中，通過蛋白質印跡法(Western blot)的方法檢測細胞攝取包載PLK1 siRNA的納米顆粒後PLK1蛋白表達水平變化來研究酸性環境下降解PEG前後納米顆粒攝取對PLK1表達水平的影響。包載PLK1 siRNA的納米顆粒的製備方法如實施例九所述，選取組分為mPEG113-Dlinkm-PLGA161/54和mPEG113-b-PLGA165/56，製備得到顆粒記為Dm-NPPLGA/siPLK1和NPPLGA/siPLK1。
在6孔板中種入2×105個MDA-MB-231細胞，加入2mL的DMEM完全培養基，置於CO2培養箱中培養過夜。吸去舊的培養基，向每個孔中分別加入含有Dm-NPPLGA/siPLK1、NPPLGA/siPLK1以及包載對照siRNA的納米顆粒Dm-NPPLGA/siNC、NPPLGA/siNC新鮮培養基溶液(培養基的pH值設置為6.5)，於37℃的CO2培養箱中培養6h，吸去含有納米顆粒的培養基，更換為新鮮培養基，繼續於37℃的CO2培養箱中培養48h。實驗結束後，將細胞消化用PBS洗滌兩遍，然後使用碧雲天公司NP40蛋白裂解液提取細胞總蛋白，通過Western blot的方法檢測PLK1蛋白表達水平的變化， 其結果如圖48。
由圖48可見，在pH 6.5條件下，與實施例十六中RT-PCR實驗結果一致，由於Dm-NPPLGA/siPLK1發生降解，增強了細胞攝取和胞內PLK1基因沉默，因此Dm-NPPLGA/siPLK1對細胞PLK1蛋白表達的下調強於NPPLGA/siPLK1。
實施例十八：Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸乙醇酸共聚物製備的包載小幹擾RNA的納米顆粒在微酸性環境下對乳腺癌細胞增殖的抑制
在本實施例中，使用MTT法檢測檢測細胞攝取包載PLK1 siRNA的納米顆粒後細胞活力的變化來研究酸性環境下降解PEG前後納米顆粒攝取對細胞增殖的影響。包載PLK1 siRNA的納米顆粒的製備方法如實施例九所述，選取組分為mPEG113-Dlinkm-PLGA161/54和mPEG113-b-PLGA165/56，製備得到顆粒記為Dm-NPPLGA/siPLK1和NPPLGA/siPLK1。
在96孔板中種入5×103個MDA-MB-231細胞，加入0.1mL的DMEM完全培養基，置於CO2培養箱中培養過夜。吸去舊的培養基，向每個孔中分別加入含有Dm-NPPLGA/siPLK1、NPPLGA/siPLK1以及包載對照siRNA的納米顆粒Dm-NPPLGA/siNC、NPPLGA/siNC新鮮培養基溶液(培養基的pH值設置為6.5)於37℃的CO2培養箱中培養6h，吸去含有納米顆粒的培養基，更換為新鮮培養基，繼續於37℃的CO2培養箱中培養72h。實驗結束後，向每個孔中加入25μL 5mg/mL噻唑藍，於37℃的CO2培養箱中培養2h，向每個孔中加入100μL細胞裂解液，在37℃避光孵育4h，用酶標儀(Bio-rad)進行檢測，其分析結果如圖49。
由圖49可見，在pH 6.5條件下，由於Dm-NPPLGA/siPLK1能夠更好地誘導PLK1基因沉默，從而造成了細胞增殖能力下降，因此Dm-NPPLGA/siPLK1對細胞增殖的抑制能力強於NPPLGA/siPLK1。
實施例十九：Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸乙醇酸共聚物製備的包載小幹擾RNA的納米顆粒在體內的分布
在本實施例中，通過高效液相色譜定量檢測納米顆粒攜載siRNA後在荷瘤小鼠體內各臟器的分布情況。包載Cy5-siNC的顆粒製備方法如實 施例九所述。在本實施例中，聚合物組分選取為mPEG113-Dlinkm-PLGA161/54和mPEG113-b-PLGA165/56，製備得到的納米顆粒記為Dm-NPPLGA/Cy5-siNC和NPPLGA/Cy5-siNC。本實施例使用MDA-MB-231原位乳腺癌小鼠腫瘤模型，模型建立具體過程如實施例十三所述。
通過尾靜脈注射Dm-NPPLGA/Cy5-siNC以及NPPLGA/Cy5-siNC，Cy5-siNC的給藥劑量為0.5OD/injection。注射24h後，處死小鼠，取小鼠各個臟器，萃取組織內的Cy5-siRNA用高效液相色譜檢測臟器內的siRNA含量，結果見圖50。由圖50可見，Dm-NPPLGA/Cy5-siNC和NPPLGA/Cy5-siNC兩種納米顆粒在各個臟器都有不同程度的富集，其中在腦、心、肺等器官富集較少，而在肝、腎和脾等與體內代謝清除機制相關的器官富集較多。除腫瘤外的其他臟器中，兩種納米顆粒的富集沒有明顯差異。而在腫瘤部位，Dm-NPPLGA/Cy5-siNC的富集明顯高於NPPLGA/Cy5-siNC，說明腫瘤酸性微環境中Dm-NPPLGA/Cy5-siNC降解PEG後增強腫瘤細胞攝取能夠增加siRNA在腫瘤部位的富集。
實施例二十：Dlinkm橋聯的聚乙二醇-Dlinkm-聚乳酸乙醇酸共聚物製備的包載小幹擾RNA的納米顆粒對乳腺癌腫瘤生長的抑制
在本實施例中，使用MDA-MB-231原位乳腺癌小鼠腫瘤模型，模型建立具體過程如實施例十三所述。本實施例以mPEG113-Dlinkm-PLGA161/54和mPEG113-b-PLGA165/56製備攜載PLK1 siRNA的納米顆粒，製備方法如實施例九所述，顆粒命名為Dm-NPPLGA/siPLK1和NPPLGA/siPLK1。
原位注射乳腺癌細胞的裸鼠在SPF級動物房中飼養7天左右可以形成可見腫瘤。腫瘤的體積按照公式：V＝0.5*a*b*b計算，其中a是指腫瘤較長的直徑，b是指腫瘤較短的直徑。在裸鼠的腫瘤體積達到60mm3左右開始進行治療，將接種了MDA-MB-231腫瘤的20g裸鼠按照下述處理方式分為7組，每組5隻裸鼠。按照PLK1 siRNA的給藥劑量作為計算標準，實驗組設置為：PBS組、Free siPLK1 1mg/kg、NPPLGA/siPLK1 1mg/kg、Dm-NPPLGA/siPLK1 1mg/kg、NPPLGA/siPLK1 0.5mg/kg、Dm-NPPLGA/siPLK1 0.5mg/kg、Dm-NPPLGA/siPLK1 0.25mg/kg，通過400uL PBS配置以上藥物進行給藥。每2天為一個治療周期共進行10次給藥，每2天測量一次腫瘤體 積。圖51顯示了腫瘤體積的變化，圖中的縱坐標為測量得到的腫瘤體積。從圖中可以看出，在1mg/kg和0.5mg/kg的給藥劑量下，Dm-NPPLGA/siPLK1對腫瘤生長的抑制效果明顯優於同等劑量下的NPPLGA/siPLK1。
儘管出於說明和描述的目的在此給出本發明，但並非意在窮舉或限制。許多修改和變化對本領域技術人員來說將是顯而易見的。為了解釋原則和實際應用而選擇和描述所述技術方案，並且使本領域技術人員理解具有各種修改的本發明不同的實施方案適合於預期的具體用途。