人皮膚表皮細胞增殖促進劑、包含該促進劑的皮膚外用組合物及化妝品的製作方法

2023-07-08 05:47:46

專利名稱：人皮膚表皮細胞增殖促進劑、包含該促進劑的皮膚外用組合物及化妝品的製作方法
技術領域：
本發明涉及以燕窩的酶解物作為有效成分的人皮膚表皮細胞增殖促進劑。此外本發明涉及包含作為該有效成分的燕窩的酶解物的皮膚外用組合物以及化妝品。
背景技術：
肌膚粗糙、皺紋、肌膚的鬆弛、張力的降低等肌膚問題特別對於女性而言是重大關 心事情。可以認為這些肌膚問題通常是由環境因素、與老化等年齡增長相伴隨的因素、以及壓力等心理因素等引起的。特別是，可以說與近年來的紫外線的增大、空調的大量使用等相伴隨的生活環境的乾燥化等所造成的對肌膚帶來不良影響的環境因素不斷增大。皮膚組織包含表皮、真皮、皮下組織。已知表皮為形成皮膚的最外層的構成要素，而且基本由角質層、顆粒層、棘層、基底層構成。在表皮中，在作為最下層的基底層分裂產生新的角質形成細胞(表皮細胞)，細胞逐漸向上方改變功能和形態，同時上升，形成角質層的角質細胞後，最後從皮膚的表面剝落。在人的健康皮膚中，在基底層表皮細胞分裂，它們上升而形成角質細胞，從皮膚表面剝落，可以說需要28天左右。將這樣的從表皮細胞的分裂開始到細胞在細胞表面剝離為止的一連串流程稱為更新(turnover)，通過在表皮反覆進行這樣的更新，從而在皮膚中進行新陳代謝而形成正常健康的皮膚。然而，已知隨著年齡增長，該更新的周期變慢，由於更新周期慢，因而皮膚表面殘留老的角質等，導致肌膚的暗淡、肌膚粗糙的狀態等。因此，通過推進皮膚表皮細胞增殖促進，使皮膚的新陳代謝活化，維持更新的周期，形成正常健康的皮膚表面，這會使肌膚的溼潤提高，調理肌膚的紋理，可以說帶來生活質量(QOL)的提聞。表皮(上皮)細胞生長因子(Epidermal growth factor (EGF))為已知存在於包括人的動物的體內的上皮細胞再生因子，是從小鼠的顎下腺的提取物中作為蛋白質的一種首次發現的(mEGF (小鼠EGF))。EGF在每種動物種類中分別不同，小鼠EGF直接在人中不顯示細胞增殖促進效果。關於人EGF也已經被發現，已知EGF對位於皮膚表面的細胞起作用，促進細胞的增殖。另一方面，例如，日本特開2009 - 234980號公報中記載了，人隨著年齡增大，EGF的分泌量減少(Life Sciences vol. 31，pp679_683，1982)，這是肌膚的老化現象的一個原因。因此，認為通過對肌膚補給EGF，可以促進人表皮中的細胞的新生(增殖)，可以使肌膚的狀態良好。已知燕窩是穴燕使自己的唾液成為絲狀而作成的巢，作為其成分，大量包含糖蛋白，幾乎不含脂質。以往，在中國菜的食用原材料、中藥的原料等中使用燕窩。近年來，還開發了將燕窩用作原料的健康食品等，但仍僅僅知道極少數外用劑、化妝品那樣的在外用用途中的適用例。日本特開2003- 095961號公報中公開了使用了燕窩的酶解物的經口用的美膚促進劑。然而，這裡，只不過僅示出了經口用途，對於在外用用途中的利用可能性沒有任何記載和暗示。此外這裡的效果為提高皮膚的保水性，形成溼潤的紋理細的肌膚，而關於通過促進表皮中的細胞增殖來維持更新周期，實現肌膚的紋理細等肌膚的狀態的維持、提高，沒有任何記載。W099/022709中公開了包含燕窩的含水溶劑提取物、特別是熱水提取物的化妝品。該化妝品可以用於皮膚護理用途，在外用用途中使用。然而，這裡所使用的提取物為將燕窩進行熱水提取，除去固體成分而得的提取物，與將燕窩整體進行酶處理而直接使用的燕窩酶解物明顯不同。此外關於效果，也與基於促進表皮中的細胞增殖的本發明的效果不同。日本特開2009 - 234980號公報中涉及包含EGF相關物質和神經氨酸類的美容組合物，這裡公開了利用燕窩作為神經氨酸類的補給源之一。然而，這裡，神經氨酸類是為了 活化EGF相關物質而被使用的，EGF相關物質為必須的成分，另一方面，燕窩不是必須成分，只不過作為雞蛋、牛乳和神經氨酸類的供給源而被期待。本發明人等此次發現，燕窩的酶解物具有人EGF樣的優異的人表皮細胞增殖促進效果。令人預料不到的驚訝的是，來源於與人無關的穴燕的燕窩的酶解物顯示人EGF樣的細胞增殖促進效果。此外，酶解物中可見的效果與燕窩的水提取物的情況相比是顯著的，這點也是令人驚訝的。本發明是基於這些認識而提出的。因此，本發明的目的是提供可以有效率地生產，並且安全性高的優異的人皮膚表皮細胞增殖促進劑，以及包含該人皮膚表皮細胞增殖促進劑的外用劑和化妝品。本發明的人皮膚表皮細胞增殖促進劑以燕窩的酶解物作為有效成分。根據本發明的一個優選方式，上述酶解物為利用蛋白酶得到的分解物。根據本發明的一個更優選方式，上述酶解物的分子量為70 200，000。根據本發明的一個進一步優選方式，上述酶解物的平均分子量為300 50，000。根據本發明的另一方式，提供一種皮膚外用組合物，其包含本發明的人表皮細胞增殖促進劑。該組合物優選用於皮膚護理，更優選用於調理肌膚的紋理，改善肌膚或皮膚的狀態。根據本發明的另一更優選方式，本發明的皮膚外用組合物為化妝品。根據本發明的另一進一步優選方式，本發明的皮膚外用組合物為洗劑(lotion)、乳液、皮膚護理用膏(cream)、保溼液、唇膏(lip cream)、美容液面膜、或洗顏料。根據本發明的另一方式，提供燕窩的酶解物在製造人皮膚表皮細胞增殖促進劑中的應用。根據本發明的另一個方式，提供燕窩的酶解物在製造皮膚護理用的皮膚外用組合物中的應用。根據本發明的再另一方式，提供一種人皮膚表皮細胞的增殖促進方法，其包含將有效量的作為本發明的有效性成分的酶解物應用於人的皮膚。根據本發明的再另一個方式，提供一種皮膚護理方法，其包含將有效量的本發明的有效成分應用於人的皮膚。同樣地，提供一種調理肌膚的紋理、提高或改善肌膚的狀態的方法，其包含將有效量的本發明的有效成分應用於人的皮膚。
根據本發明，通過使用燕窩的酶解物作為有效成分，與以往相比可以顯著地促進人皮膚表皮細胞增殖。此外通過基於該人皮膚表皮細胞增殖促進能力，將酶解物用於皮膚外用用途或化妝品用途，可以維持皮膚中的更新周期或恢復周期的延遲，調理肌膚的紋理，維持或改善肌膚或皮膚的狀態。這樣根據本發明，可以實現消費者的QOL的提高。此外，由於所使用的酶解物使用也作為食用原材料眾所周知的燕窩，因此安全性高，消費者也易於接受。此外由於可以將燕窩直接進行酶處理來獲得酶解物，因此可以有效率地製造，並且製造成本也可以抑制地低。


圖I為顯示燕窩樣品中的唾液酸量的測定結果的圖。圖2為顯示燕窩樣品中的蛋白質的量的測定結果的圖。圖3為顯示由GPC - HPLC得到的燕窩酶解物I的測定結果的圖。
圖4為顯示由GPC - HPLC得到的燕窩酶解物2的測定結果的圖。圖5為顯示實施例(3)的結果的圖。圖6為顯示實施例(4)的結果的圖。
具體實施例方式人皮膚表皮細胞增殖促進劑和有效成分關於本發明的人皮膚表皮細胞增殖促進劑，如上所述，以燕窩的酶解物作為有效成分。作為酶解物的原料的燕窩是穴燕使自己的唾液成為絲狀而作成的巢，作為其成分，大量包含糖蛋白，幾乎不包含脂質。這裡所謂穴燕，是指屬於雨燕科(Apodidae)的金絲燕屬(Collocalia)的燕類,可舉出例如，小灰腰金絲燕(Apodidae Collocalia francica)、苔巢金絲燕(Apodidae Collocalia salanRana)、爪睡金絲燕(Apodidae CollocaliafuciphaRa)、灰腰金絲燕(Apodidae Collocalia inexpectata)、褐腰金絲燕(ApodidaeCollocalia vestita)、白腹金絲燕(Apodidae Collocalia esculenta)、大金絲燕(Apodidae Collocalia maximus)等。在本發明中，燕窩可以使用市售品。在一般市售的燕窩中，具有從僅除去毛、糞等汙物再洗滌而得的燕窩到收集燕窩的碎料進行反覆漂白和洗滌而成形的燕窩等多個種類，但本發明中所用的燕窩優選使用在前處理中沒有進行過度的洗滌、漂白等的燕窩。所謂燕窩的酶解物，是指應用酶反應將燕窩分解而得的物質，可以通過使用蛋白酶、包含蛋白酶的複合酶等對燕窩或其處理物進行分解來獲得。這裡作為分解處理中使用的酶，優選為蛋白酶，更優選為胰酶。燕窩的酶解物通常可以如下獲得首先實施加熱殺菌處理，然後在水中進行酶處理。殺菌處理的條件可以適當參考慣用的加熱殺菌條件來設定，酶處理的條件也可以根據所使用的酶的種類、燕窩的狀態來適當設定。如果舉出更具體的例子，則燕窩的酶解物可以如下調製。例如，向粉碎後的燕窩中添加其質量的10 50倍的水並使其膨脹，然後在60 130°C加熱殺菌處理5秒 30分鐘。然後，直接添加適量的酶，在酶的最適pH、最適溫度進行O. 5 48小時酶反應。酶反應結束後，通過加熱處理等使酶失活，過濾反應液而除去不溶物，從而可以獲得燕窩的酶解物。此外，該酶解物可以根據需要乾燥而粉末化。另外，在上述的各工序中，可以進行適當PH調整、脫色、脫臭等操作。作為其它例，在將燕窩的處理物進行酶解的情況下，向粉碎成粒徑2mm以下、優選150 μ m以下的燕窩中添加其質量的10 100倍的水，在I 60°C靜置或攪拌O. 5 48小時使其膨脹，然後在60 130°C加熱殺菌處理5秒 30分鐘，根據需要進行過濾，將所得的溶液與上述同樣地操作進行酶處理，從而可以獲得燕窩的酶解物。在酶解物的調製法中，酶反應的時間越長，則蛋白質的分解越進展，獲得包含更低分子的蛋白質的酶解物。在本發明中，使酶反應時間為O. 5 48小時、優選為O. 5 36小時、更優選為3 36小時、進一步優選為約24小時左右，優選進一步進行了酶反應的酶解物。這樣獲得的燕窩的酶解物的分子量優選為70 200,000，更優選為70 180，000。進一步優選分子量為70 150，000，進一步更優選為70 120，000。 此外期望燕窩的酶解物的平均分子量(重均分子量)為300 100，000，優選為300 70，000。更優選平均分子量為300 50，000。皮膚外用組合物本發明的人皮膚表皮細胞增殖促進劑可以單獨地直接使用，但也可以作為添加劑包含於化妝品、藥品、準藥品等各種皮膚外用組合物中，可以獲得具有人皮膚表皮細胞的增殖促進效果的組合物。所得的組合物可以有效地用於皮膚護理，優選調理肌膚的紋理，改善或維持肌膚或皮膚的狀態。作為本發明的有效成分的燕窩的酶解物具有實際上使EGF - R表達皮膚構成細胞增殖的效果，該效果與燕窩的酶解物的非添加組和燕窩的熱水提取物組相比是顯著的(後述的實施例I的試驗結果)。此外作為本發明的有效成分的燕窩的酶解物顯示將EGF受體(EGF - R)實際上磷酸化的效果(後述的實施例2的試驗結果)。EGF — R被磷酸化，表示燕窩的酶解物實際上保持作為EGF - R的配體的作用，即，實際上保持EGF樣的作用。因此，在本發明中，所謂人皮膚表皮細胞增殖促進活性，是指可以使人皮膚表皮細胞實際上增殖。可以認為燕窩的酶解物中包含可以作為EGF受體的配體起作用的成分，並認為其結果是促進EGF活性，促進表皮細胞的增殖。另外這是理論，並不限定本發明。因此，根據本發明，通過使用燕窩的酶解物，可以期待EGF樣的效果，其結果是可以促進表皮中的細胞增殖，可以維持表皮中的更新的周期或恢復周期的延遲而提高人皮膚的新陳代謝。由此，明確了對於調理肌膚的紋理，改善和提高肌膚、皮膚的狀態而言是有效的。此外可以說也能夠達到皮膚的狀態的惡化的預防效果。另外，在本說明書中，所謂肌膚或皮膚的狀態的「改善或維持」，以包含該狀態的提聞、調節、狀態惡化的延遲或緩和等的意思使用。因此如上所述，根據本發明的另一方式，提供包含本發明的人皮膚表皮細胞增殖促進劑的皮膚外用組合物。優選皮膚外用組合物作為藥品、準藥品、或化妝品被提供，更優選作為化妝品被提供。在本發明的皮膚外用組合物(特別是化妝品)中，作為有效成分的燕窩酶解物的含量(乾物換算)沒有特別限制，根據組合物的形態的不同而不同，但是一般作為固體成分，為O. OOl 20重量％、優選為O. 005 5重量％的範圍，可以根據組合物的形態進行適
當變更。或者，本發明的皮膚外用組合物中的燕窩酶解物的含量(乾物換算)優選以可以以每I日O. OOlmg以上、更優選為O. OOlmg Img應用於每I平方cm的皮膚的方式包含。只要本發明的皮膚外用組合物包含有效成分，並且不損害人皮膚表皮細胞增殖促進效果，則本發明的促進劑可以進一步包含其它任意成分。作為這樣的任意成分，可舉出例如，皮膚外用劑、化妝品中慣用的各種成 分，例如，保溼劑、低級醇、多元醇、糖類、表面活性齊U、緩衝劑、乳化劑、穩定劑、增稠劑、抗氧化劑、防腐防菌劑、螯合劑、PH調節劑、香料、色素、紫外線吸收劑、紫外線散射劑、維生素類、胺基酸類、抗炎劑、水、肽、糖醇類、酶類、植物提取物類、抗氧化物質類、滑石、粘土、花粉、珍珠等。這裡作為保溼劑，可舉出例如，聚乙二醇、聚丙二醇、甘油、丙二醇、山梨糖醇、透明質酸、硫酸軟骨素等酸性粘多糖類、胺基酸、膠原、膠原肽、彈性蛋白等。作為低級醇，可舉出例如，乙醇、丙醇、異丙醇等。作為多元醇，可舉出例如，甘油、季戊四醇、二季戊四醇、乙二醇、丙二醇、聚丙二醇、1，3 —丁二醇等。作為糖類，可舉出例如，葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖、木糖、D 一葡糖醛酸、蔗糖、葡糖胺、半乳糖胺、D —山梨糖醇、失水山梨糖醇、纖維素、澱粉等糖類、寡糖類、多糖類和它們的衍生物等。關於本發明的皮膚外用組合物，通過將包含燕窩酶解物的人皮膚表皮細胞增殖促進劑和上述那樣的任意成分根據公知的方法適當配合進行調整，可以製成洗劑、乳液、皮膚護理用膏(例如，雪花膏、營養膏、燒傷膏)、保溼液、面膜劑(例如，美容液面膜)、化妝水、洗顏料、爽身水(body lotion)、潤體霜(body cream)等各種化妝品中慣用的製品形態。本發明的皮膚外用組合物還可以用作粉底(foundation)類、唇膏(lip cream)、口紅(lipstick)、眼影(eye shadow)、腮紅等彩妝化妝品、防曬用製品、防臭化妝品等藥用化妝品、香波(shampoo)、護髮素(hair rinse)、整發料等頭髮用化妝品、皮膚洗滌劑、浴用製劑的浴用化妝品等。根據本發明的再另一個方式，如上所述，提供人皮膚表皮細胞的增殖促進方法，其包含將有效量的作為本發明的有效成分的酶解物應用於人的皮膚。另外這裡所謂「有效量」，是指根據應用，對於在體內的所期望區域中能夠發揮人皮膚表皮細胞增殖促進活性而言充分的量。此外，根據本發明的再另一個方式，如上所述，提供皮膚護理方法，其包含將有效量的本發明的有效成分應用於人的皮膚。同樣地，還提供調理肌膚的紋理、提高或改善肌膚的狀態的方法，其包含將有效量的本發明的有效成分應用於人的皮膚。另外這裡所謂「有效量」，是指對於獲得所期望的效果而言充分的量。另外在本說明書中，使用了「約」和「左右」的值的表達意味著，在達成設定該值的目的的基礎上，包含本領域技術人員可以容許的值的變化。意味著例如，可以容許規定的值或範圍的20%以內、優選為10%以內、更優選為5%以內的變化。實施例基於以下的例子具體地說明本發明，但本發明不限定於這些例子。
(I)燕窩樣品的調製(1-1)燕窩酶解物I將市售的無漂白的燕窩用粉碎機進行粉碎，獲得100目通過(粒徑150μπι以下)的燕窩粉末，向該燕窩粉末中添加約50倍量(質量)的水，在5°C膨脹20小時，然後在121°C加熱殺菌處理15分鐘。將所得的處理液冷卻，然後調整pH,添加相對於燕窩粉末為2質量％的量的含有蛋白酶的酶(商品名「 ^ ^ > 7 f > F」，天野製藥株式會社制)，在45°C反應3小時。將該酶反應液調整至pH7. 0，然後在90°C加熱5分鐘，使酶失活，過濾，回收濾液(水溶性組分)。濃縮該濾液，然後冷凍乾燥，獲得「燕窩酶解物I 」。(1-2)燕窩酶解物2 除了使酶反應的時間為24小時以外，與上述(1-1)項的酶解物I同樣地進行，獲得「燕窩酶解物2」。(1-3)燕窩熱水提取物(比較例I將市售的無漂白的燕窩(乾燥物)40g用粉碎機進行粉碎，將該粉碎物添加至IOOOml的蒸餾水中，在加熱回流下進行提取處理2小時。加熱回流後，靜置，然後分取上清液並過濾，回收濾液。對於殘渣進一步與上述同樣地添加至IOOOml的蒸餾水中，在加熱回流下進行再提取處理，然後將固體物質殘渣通過過濾而除去，回收濾液。合併所得到的濾液(提取液)，在減壓下濃縮，冷凍乾燥所得的濃縮物，獲得黃白色的「燕窩熱水提取物」(比較例)。(2)燕窩樣品的分析如下測定所得的各燕窩樣品(燕窩酶解物I、燕窩酶解物2和燕窩熱水提取物)中的唾液酸量和蛋白質的量。關於唾液酸的量，在將各試樣酸水解後，採用高效液相色譜作為游離N —乙醯神經氨酸進行測定。關於蛋白質的量,使用基於Brad ford法的Bio Rad社的蛋白質測定試劑盒進行測定。結果如圖I和圖2所示。接下來，為了測定燕窩酶解物I和燕窩酶解物2所包含的蛋白質的分子量及其分布，採用下述那樣的條件利用GPC進行分析。[HPLC的測定條件]·柱Shodex Asahipak GS320HQ(Φ 7. 6 X 300mm)·柱溫度35°C·流動相50mM CH3COONH3 pH6. 7·流速0. 4ml/ 分鐘·試樣進樣量10 μ I·檢測器紫外分光檢測器(在UV220nm測定)[使用的分子量標準(marker)]· BSA MW 66，000· Gly-gly MW 132. I
· Gly-gly-gly MW 189.17· L-天冬氨酸 MW133. I· DL-天冬氨酸 MW 150. I· N-乙醯神經氨酸MW 309. 3測定結果如圖3和圖4所示。此外，關於燕窩酶解物所包含的蛋白質的分子量，使用蛋白質印跡法進行評價。具體而言，首先，按照上述的測定法，確認了燕窩酶解物中的蛋白質的量。將來源於燕窩酶解物的蛋白質(100 μ g)，使用SDS - PAGE，通過10 15%的聚丙烯醯胺進行分離。將凝膠中展開的蛋白質轉印至免疫印跡PVDF膜(聚1，I-二氟乙烯，由Bio-Lad Lab社獲得)。將PVDF膜在包含3%脫脂奶和O. l%Tween-20的PBS中封閉I小時，進行視覺判定。
另夕卜，在蛋白質的分子量的評價時，公知文獻(Guo, C. T.，Suzuki Y.，etal. ,Antiviral Res. 70, pp. 140-146(2006)中顯示的數據也作為參考。由這些結果可知，燕窩酶解物中所包含的蛋白質分子量在約70 120，000左右(另外根據評價條件，有時上限值為200，000左右)的範圍存在。此外，由所得的結果可知，燕窩酶解物I中的蛋白質的平均分子量為約55，000。此外可知，燕窩酶解物2中的蛋白質的平均分子量為約33，000。(3)酶處理燕窩的細胞增殖促進活性使用EGF - R表達皮膚構成細胞來研究酶處理燕窩的EGF樣作用，即，細胞增殖促進活性。(i)材料細胞使用由ATCC購入的來源於人表皮(皮膚)的EGF — R表達細胞A431細胞。作為燕窩酶解物，使用按照上述(I)獲得的燕窩酶解物I (酶處理3小時)、燕窩酶解物2 (酶處理24小時)以及燕窩熱水提取物。(ii)實驗方法利用添加了 3%FCS的DME培養基，在調整至5X IO4個細胞/ml的A431細胞中，以下述各種濃度添加燕窩酶解物或燕窩熱水提取物，利用96孔平底板以5X IO3個細胞/lml/孔進行培養。最終添加濃度·燕窩熱水提取物(heart) :1%、0· 1%、0· 01%·燕窩酶解物 I (Enzl) :1%、0· 1%、0· 01%·燕窩酶解物 2 (Εηζ2) :1%、0· 1%、0· 01%此外，作為對照，準備既未添加燕窩酶解物也未添加r - EGF的非添加組，進行培養。經時地使用Cell Counting Kit 一 8(同仁化學研究所社制)(氣胸腺卩密唳核苷(tritium thymidine)的攝取試驗的代替法)研究細胞的增殖，調查EGF樣作用的有無。結果是，作為在460nm附近具有極大吸收的水溶性甲臢的色素量，以ABS (吸光度，absorbance)顯不。結果如圖5所示。由結果可知，明確劃分成與非添加對照組(A431/3%FCS)相比細胞的增殖被抑制的組和被增殖的組。燕窩酶解物I和燕窩酶解物2的添加組(特別是O. 1%和O. 01%的濃度)中都確認了明確的增殖促進效果。另一方面，對於燕窩熱水提取物的1%添加組，即使與非添加對照組相比，細胞增殖也被極端地抑制。即使在燕窩熱水提取物的O. 1%添加組和O. 01添加組中，細胞增殖與非添加對照組相比也低。因此，燕窩酶解物促進細胞增殖，另一方面，關於燕窩熱水提取物，反而確認了抑制或阻害細胞增殖的傾向。(4)燕窩酶解物的EGF樣作用的驗證^GF — R磷酸化的研討)將EGF - R表達皮膚構成細胞的EGF受體磷酸化作為指標研討燕窩酶解物的EGF樣作用。 ⑴材料細胞使用由ATCC購入的來源於人表皮(皮膚)的EGF — R表達細胞A431細胞。作為燕窩酶解物，使用按照上述(I)獲得的燕窩酶解物I (酶處理3小時)和燕窩酶解物2 (酶處理24小時)。作為陽性對照，使用人重組型EGF(r 一 EGF)(由Protein Express獲得)。EGF — R的磷酸化使用Active EGF receptor EIA試劑盒(Takara社)進行測定。(ii)細胞培養利用添加了 3%FCS的DME培養基，分別在調整至5X IO4個細胞/ml的A431細胞中，以下述各種濃度添加燕窩酶解物和作為陽性對照的r 一 EGF，利用24孔平底板以5X IO4個細胞/lml/孔進行培養。最終添加濃度·燕窩酶解物 I (Enzl) 0. 1%、0· 01%·燕窩酶解物 2 (Εηζ2) :0· 1%、0· 01%· r — EGF 0. 15ng/ml此外，作為對照，準備既未添加燕窩酶解物也未添加r - EGF的非添加組，進行培養。(iv)檢體的調整和測定在從培養10小時至50小時(數據為10 34小時)期間，經時地回收細胞，使用附屬於測定試劑盒的受體提取用緩衝液，調整檢體。除去培養上清液，然後以50 μ I/孔添加受體提取用緩衝液，使用細胞刮刀(Cell Scraper)刮取細胞，將2孔份的細胞提取液集中在I. 5ml用的微量離心管中。在4°C、IOOOOrpm的條件下離心5分鐘，使細胞不溶物沉澱，將提取上清液在一 80°C冷凍保存直至測定。將冷凍保存的提取上清液溶解，使用檢體稀釋液分別稀釋至10倍，按照ActiveEGF receptor EIA試劑盒的測定法進行測定。結果利用由磷酸化EGF受體標準液得到的標準曲線算出，以EGF受體中的磷酸化酪氨酸數(fmol/L)表示。結果如圖6所示。在直至培養34小時的研討中，與非添加對照組(Cont)相比，EGF — R的磷酸化都增強了。燕窩酶解物2的O. 1%和O. 01%添加濃度組(分別為Enz20. 1%，Enz20. 01%)的EGF - R的磷酸化數與作為陽性對照的r - EGF的O. 15ng/ml添加組(r 一 EGFO. 15ng)相比，都顯示高的值。在燕窩酶解物I的O. 1%添加組(EnzlO. 1%)中，非常早地(10小時)確認了 EGF - R的磷酸化的增強。 由結果暗示了，燕窩酶解物I和燕窩酶解物2都以O. 1%和O. 01%的添加濃度促進EGF - R的磷酸化，對於表皮細胞(A431細胞)的增殖帶來影響。
權利要求
1.一種人皮膚表皮細胞增殖促進劑，其以燕窩的酶解物作為有效成分。
2.根據權利要求I所述的人表皮細胞增殖促進劑，酶解物為利用蛋白酶得到的分解物。
3.根據權利要求I或2所述的人表皮細胞增殖促進劑，酶解物的分子量為70 200，000。
4.根據權利要求I 3的任一項所述的人表皮細胞增殖促進劑，酶解物的平均分子量為 300 50，000。
5.一種皮膚外用組合物，其包含權利要求I 4的任一項所述的人表皮細胞增殖促進劑。
6.根據權利要求5所述的組合物，其用於皮膚護理。
7.根據權利要求5或6所述的組合物，其用於調理肌膚的紋理，改善肌膚或皮膚的狀態。
8.根據權利要求5 7的任一項所述的組合物，其為化妝品。
9.根據權利要求5 7的任一項所述的組合物，其為洗劑、乳液、皮膚護理用膏、保溼液、唇膏、或美容液面膜、洗顏料。
10.燕窩的酶解物在製造人皮膚表皮細胞增殖促進劑中的應用。
11.燕窩的酶解物在製造皮膚護理用的皮膚外用組合物中的應用。
12.根據權利要求11所述的應用，皮膚外用組合物用於調理肌膚的紋理，提高或改善肌膚的狀態。
13.根據權利要求10 12的任一項所述的應用，酶解物為利用蛋白酶得到的分解物。
14.根據權利要求10 13的任一項所述的應用，酶解物的分子量為70 200，000。
15.根據權利要求10 14的任一項所述的應用，酶解物的平均分子量為300 50，OOO0
16.根據權利要求11 15的任一項所述的應用，皮膚外用組合物為化妝品。
17.一種人皮膚表皮細胞的增殖促進方法，其包含將有效量的酶解物應用於人的皮膚。
18.一種皮膚護理方法，其包含將有效量的酶解物應用於人的皮膚。
19.一種調理肌膚的紋理、提高或改善肌膚的狀態的方法，其包含將有效量的酶解物應用於人的皮膚。
20.根據權利要求17 19的任一項所述的方法，酶解物為利用蛋白酶得到的分解物。
全文摘要
本發明的人皮膚表皮細胞增殖促進劑以燕窩的酶解物作為有效成分。根據本發明，提供可以有效率地生產，並且安全性高的優異的人皮膚表皮細胞增殖促進劑，以及包含該人皮膚表皮細胞增殖促進劑的外用劑和化妝品。
文檔編號A61P17/00GK102821751SQ201180014048
公開日2012年12月12日 申請日期2011年3月15日 優先權日2010年3月15日
發明者武川和琴, 藤村響男 申請人:康貝株式會社, 學校法人 北裡研究所