B肝病毒表面抗原的免疫增強型基因疫苗及其製備方法

2023-07-23 18:39:01

專利名稱：B肝病毒表面抗原的免疫增強型基因疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，特別涉及B肝病毒表面抗原的免疫增強型基因疫 苗，還涉及該疫苗的製備方法。
背景技術：
B肝病毒(HBV)是一種嗜肝的DNA病毒。B型肝炎是由HBV引起，主要通過血液、 體液及母嬰傳播，具有慢性攜帶狀態的傳染病。目前世界上有3億多人為慢性HBV感染，我 國約佔半數。此種感染容易發展為慢性肝炎和肝硬化，少數病例可轉變為原發性肝細胞癌， 是當前WHO公布的人類疾病死亡原因中居第9位的疾病。大量研究證明，B肝病毒表面抗 原(HBsAg)所誘導產生的抗HBSAg抗體是一種保護性抗體，具有阻斷HBV感染的能力。因 此，運用HBsAg疫苗免疫機體，能有效防止HBV感染的風險，可以顯著降低肝炎、肝硬化和原 發性肝細胞癌等肝臟疾病的發生率。B細胞激活因子(BAFF)是B細胞存活與成熟的必需因子，為腫瘤壞死因子(TNF) 家族成員。其能夠增強B細胞、CD4T細胞、NK細胞的活性，使機體的免疫應答增強；還可作 為T細胞激活的共刺激因子，刺激T細胞分泌幹擾素-Y (IFN- Y )和白介素_2 (IL-2)，上調 ⑶25(IL-2受體α鏈)表達，並以IL_2依賴方式促進T細胞增生。免疫刺激複合物(ISCOM)是由抗原、皂苷Quil A、膽固醇及磷脂混合後自發形成 的一種直徑為30 40nm的球形籠狀顆粒，具有佐劑和抗原遞呈的雙重功能，可大幅度提高 抗原的免疫原性。文獻報導，以ISCOM為佐劑製得的DNA疫苗誘導的中和抗體水平和免疫 保護力明顯高於裸DNA，可能的機制是經ISCOM包裹的DNA能免受體內核酸酶的降解，從而 保證該DNA在機體內持續表達。另外，ISCOM的結構特性使其更易於定居在淋巴組織內，從 而有利於抗原遞呈細胞的吞噬。

發明內容
有鑑於此，本發明的目的之一在於提供一種HBsAg的免疫增強型基因疫苗；目的 之二在於提供所述HBsAg的免疫增強型基因疫苗的製備方法。為達到上述目的，本發明採用如下技術方案UHBsAg的免疫增強型基因疫苗，該疫苗是由HBsAg和BAFF雙基因共表達重組真 核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂組成的ISCOM型疫苗。進一步，所述HBsAg和BAFF雙基因共表達重組真核載體是在含有內部核糖體進 入位點(IRES)的雙基因共表達真核載體的IRES上遊和下遊分別插入HBsAg全長cDNA和 BAFF 全長 cDNA ；進一步，所述HBsAg和BAFF雙基因共表達重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵 磷脂的質量比為5 10 1 1。2、所述HBsAg的免疫增強型基因疫苗的製備方法，包括以下步驟a、HBsAg和BAFF雙基因共表達重組真核載體的構建將HBsAg全長cDNA插入含有
3IRES的雙基因共表達真核載體的IRES上遊，再將BAFF全長cDNA插入該真核載體的IRES 下遊，即得HBsAg和BAFF雙基因共表達重組真核載體；b、ISCOM的製備將HBsAg和BAFF雙基因共表達重組真核載體用磷酸鹽緩衝液 (PBS)溶解後，加入皂苷Quil A，再加入膽固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBsAg和 BAFF雙基因共表達重組真核載體0. 5mg、皂苷Quil A lmg、膽固醇0. Img和卵磷脂0. Img, 冰浴超聲處理使溶液充分混勻並乳化，再用PBS透析，所得微絮狀物即為形成的ISC0M。進一步，所述步驟a的具體方法為al、HBsAg全長cDNA的克隆提取HBV轉基因小鼠的肝臟細胞總RNA，逆轉錄得到 cDNA，再以該總cDNA為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示序列為上下遊引物，PCR 擴增兩端分別帶有Pst I和EcoR I酶切位點的HBsAg全長cDNA，PCR條件為94°C預變性 3分鐘，然後94°C變性1分鐘、58 °C退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，共30個循環，最後72°C延 伸7分鐘；PCR產物經純化後克隆入pGEM-T Easy載體，得重組載體pT_HBsAg ；a2、BAFF全長cDNA的克隆提取人脾臟組織總RNA，逆轉錄得到總cDNA，再以該總 cDNA為模板，以SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示序列為上下遊引物，PCR擴增兩端分別帶 有BamH I和Sal I酶切位點的B細胞激活因子全長cDNA，PCR條件為94°C預變性5分鐘； 然後94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環；最後72°C延伸10分 鍾；PCR產物經純化後克隆入pGEM-T Easy載體，得重組載體pT_BAFF ；a3、重組真核載體的構建自步驟al所得重組載體pT-HBsAg中用Pst I和EcoR I 雙酶切出HBsAg全長cDNA，經純化後與同樣用Pst I和EcoR I雙酶切的真核載體pStar連 接，得重組載體pStar-HBsAg ；再自步驟a2所得重組載體pT_BAFF中用BamH I和Sal I雙 酶切出BAFF全長cDNA，經純化後與同樣用BamH I和Sal I雙酶切的重組載體pStar-HBsAg 連接，即得HBsAg和BAFF雙基因共表達重組真核載體pStar-HBsAg-IRES_BAFF。本發明的有益效果在於本發明的HBsAg的免疫增強型基因疫苗能夠顯著增強 HBsAg的免疫原性，促進抗HBSAg抗體的生成，且製備方法簡單、成本低廉，在抗HBV感染領 域具有良好的應用前景。


為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進 一步的詳細描述，其中圖1為PCR擴增HBsAg全長cDNA的瓊脂糖凝膠電泳結果；圖2為PCR擴增BAFF全長cDNA的瓊脂糖凝膠電泳結果；圖3為透射電鏡檢測HBsAg的免疫增強型基因疫苗的結構；圖4為免疫組織化學檢測HBsAg的表達；圖5為ELISA法測定血清抗體效價。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未註明 具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
一、HBsAg的免疫增強型基因疫苗的製備及鑑定1、HBsAg和BAFF雙基因共表達重組真核載體的構建(1) HBsAg 全長 cDNA 的克隆根據GenBank登錄號為NP_647605的HBsAg基因序列，設計併合成如下引物以PCR 擴增兩端帶有酶切位點的 HBsAg全長 cDNA :F1 5『-aatcttgcagatgcaactttttcacctctgc-3『 (SEQ ID No. 3),下劃線部分為 Pst I 酶切位點R1 :5，tacgaattcctaacattgagattcccgagat tg-3』(SEQ ID No. 4)，下劃線部分為EcoR I酶切位點；分離HBV轉基因小鼠的肝臟細胞，用 RPMI 1640培養基常規培養，調節細胞密度為2 X IO7個/mL，收集細胞，PBS洗滌3次，用總 RNA提取試劑盒提取細胞總RNA ；將所得細胞總RNA逆轉錄為總cDNA，再以該總cDNA為模 板、Fl和Rl為上下遊引物進行PCR擴增，PCR條件為94°C預變性3分鐘，然後94°C變性1 分鐘、58 °C退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，共30個循環，最後72°C延伸7分鐘；PCR產物經瓊 脂糖凝膠電泳鑑定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化後，與PGEM-TEasy載體連接，連接產物 轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，用含有氨苄青黴素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，委 託上海生工生物工程技術服務有限公司測序驗證，將插入了 HBcAg全長cDNA序列(SEQ ID No. 1)的陽性克隆質粒命名為pT-HBcAg ；PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示，其中M泳道為DNA分子量標準，1泳 道為PCR產物，可見PCR產物在約650bp處呈單一特異性條帶，與目的片段大小相符。(2) BAFF 全長 cDNA 的克隆根據GenBank登錄號為NM_006573的BAFF基因序列，設計併合成如下引物以PCR 擴增兩端帶有酶切位點的BAFF全長cDNA 上遊引物F2 :5』 -RatcRRatccatRRatRactccaca gaaagg-3，(SEQ ID No. 5)，下劃線部分為 BamH I 酶切位點；下遊引物 R2 :5』 -acgctcgcgac tcacagcagtttcaatgcac-3『 (SEQ ID No. 6)，下劃線部分為 Sal I 酶切位點；按 Trizol 試劑 盒說明書提取人脾臟組織總RNA，反轉錄得到總cDNA，再以該總cDNA為模板，採用上下遊引 物F2和R2進行PCR擴增，PCR條件為94°C預變性5分鐘；然後94°C變性50秒，58°C退火 50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環；最後72°C延伸10分鐘。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳 鑑定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化後，與PGEM-T Easy載體連接，連接產物轉化大腸桿菌 DH5a感受態細胞，用含有氨苄青黴素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，委託上海生工生 物工程技術服務有限公司測序驗證，將插入了 BAFF全長cDNA序列(SEQ ID No. 2)的陽性 克隆質粒命名為重組載體pT-BAFF。PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示，其中M泳道為DNA分子量標準，1泳 道為PCR產物，可見PCR產物在約850bp處呈單一特異性條帶，與目的片段大小相符。(3) HBsAg和BAFF雙基因共表達重組真核載體的構建根據HBsAg和BAFF全長cDNA兩端所設計的酶切位點，先將HBsAg全長cDNA插入 含有IRES的雙基因共表達真核載體pStar的IRES上遊，再將BAFF全長cDNA插入pStar載 體的IRES下遊。具體方法為先將重組載體pT-HBsAg用Pst I和EcoR I雙酶切，雙酶切產 物經凝膠回收試劑盒切膠回收純化後，與同樣經Pst I和EcoR I雙酶切的真核載體pStar 連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，用含有氨苄青黴素的LB平板篩選陽性克 隆，提取質粒，Pst I和EcoR I雙酶切鑑定，將陽性克隆質粒命名為重組載體pStar-HBsAg; 再將重組載體pT-BAFF用BamH I和Sal I雙酶切，雙酶切產物經凝膠回收試劑盒切膠回收純化後，與同樣經BamH I和Sal I雙酶切的重組載體pStar-HBsAg連接，連接產物轉化大 腸桿菌DH5ci感受態細胞，用含有氨苄青黴素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，BamH I 和Sal I雙酶切鑑定，陽性克隆質粒即為HBsAg和BAFF雙基因共表達重組真核載體，將其 命名為 pStar-HBsAg-IRES-BAFF。2、ISCOM 的製備將HBsAg和BAFF雙基因共表達重組真核載體pStar-HBsAg-IRES-BAFF用PBS溶 解後，加入皂苷Quil A，再加入膽固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBsAg和BAFF雙基因 共表達重組真核載體0.5mg、皂苷Quil A lmg、膽固醇0. Img和卵磷脂0. lmg，冰浴超聲處理 使溶液充分混勻並乳化，再用PBS透析，所得微絮狀物即為形成的ISC0M，也即HBsAg的免疫 增強型基因疫苗。3、透射電鏡分析將新鮮製備的ISCOM滴於200目銅網上，吸附3分鐘，吸水紙吸乾，晾乾30秒，以 濃度為(w/v)的水溶性醋酸鈾負染30秒，吸水紙吸乾，晾乾30秒，80kV透射電鏡觀察。 結果如圖3所示，所得ISCOM呈大小均一的近圓形顆粒，絕大多數顆粒長徑小於25nm。二、HBsAg的免疫增強型基因疫苗的體內免疫及檢測將雄性BALB/c小鼠隨機分為實驗組、對照組和空白對照組，每組10隻；實驗組以 本發明的HBsAg的免疫增強型基因疫苗為免疫原，對照組以HBsAg基因疫苗(HBsAg單基因 重組表達載體的ISC0M)為免疫原，空白對照組以PBS為免疫原；三組小鼠按100 μ L的劑量 行雙側股四頭肌免疫，每隔2周免疫1次，連續免疫3次；末次免疫後第14天取股四頭肌組 織，採用免疫組化檢測HBsAg的表達；同時尾靜脈採血，採用間接ELISA法測定血清抗體效 價，Ρ/Ν彡2判為陽性。(1)免疫組化檢測HBsAg的表達取小鼠股四頭肌組織(0. 5cmX0. 5cmX0. 5cm)置中性福馬林溶液中，4°C固定 12小時，脫水後石蠟包埋、切片(5mm)，將蠟切片脫蠟至水，用體積分數為3%的過氧化氫溶 液室溫孵育5 10分鐘，蒸餾水衝洗，PBS浸泡5分鐘，再用體積分數為5 10%的正常山 羊血清的PBS稀釋液封閉，室溫孵育10分鐘，傾去封閉液，滴加適當比例稀釋的抗HBSAg抗 體工作液，37°C孵育1 2小時，PBS衝洗，再滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗，37°C孵 育10 30分鐘，PBS衝洗，再滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈黴卵白素，37°C孵育10 30分鐘，PBS衝洗，DAB顯色，自來水充分衝洗，復染，封片，置顯微鏡下觀察，拍片。結果如圖4所示，A為實驗組，B為對照組，C為空白對照組，可見HBsAg的免疫增 強型基因疫苗能在肌肉組織中高效表達HBsAg，而空白對照組中無抗原表達。(2) ELISA法測定血清抗體效價在96孔板中，每孔加入用濃度為0. 05mol/L、pH為9. 0的碳酸鹽緩衝液稀釋至濃 度為1 μ g/mL的HBsAg溶液0. lmL，4°C包被過夜，次日棄去孔內溶液，用洗滌緩衝液洗滌後， 再加入適當比例稀釋的血清樣品0. lmL，37°C孵育1小時，用洗滌緩衝液洗滌後，再加入新 鮮稀釋的酶標抗體0. lmL，37°C孵育0. 5 1小時，用洗滌緩衝液洗滌後，加入TMB底物溶液 0. lmL，37°C反應10 30分鐘，加入濃度為2mol/L的硫酸溶液0. 05mL終止反應。結果如圖5所示，實驗組的血清抗體平均效價為16 1，而對照組的血清抗體平均 效價為4 1，說明本發明的HBsAg免疫增強型基因疫苗能夠顯著增強HBsAg的免疫原性，促進抗HBsAg抗體的產生。 最後說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過參 照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可 以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明 的精神和範圍。
權利要求
B肝病毒表面抗原的免疫增強型基因疫苗，其特徵在於該疫苗是由B肝病毒表面抗原即HBsAg和B細胞激活因子即BAFF雙基因共表達重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂組成的免疫刺激複合物型疫苗。
2.根據權利要求1所述B肝病毒表面抗原的免疫增強型基因疫苗，其特徵在於所述 HBsAg和BAFF雙基因共表達重組真核載體是在含有內部核糖體進入位點即IRES的雙基因 共表達真核載體的IRES上遊和下遊分別插入HBsAg全長cDNA和BAFF全長cDNA。
3.根據權利要求1或2所述B肝病毒表面抗原的免疫增強型基因疫苗，其特徵在於 所述HBsAg和BAFF雙基因共表達重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂的質量比為 5 10 1 1。
4.權利要求1所述B肝病毒表面抗原的免疫增強型基因疫苗的製備方法，其特徵在 於包括以下步驟a、HBsAg和BAFF雙基因共表達重組真核載體的構建將HBsAg全長cDNA插入含有IRES 的雙基因共表達真核載體的IRES上遊，再將BAFF全長cDNA插入該真核載體的IRES下遊， 即得HBsAg和BAFF雙基因共表達重組真核載體；b、免疫刺激複合物的製備將HBsAg和BAFF雙基因共表達重組真核載體用磷酸鹽緩衝 液即PBS溶解後，加入皂苷Quil A，再加入膽固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBsAg和 BAFF雙基因共表達重組真核載體0. 5mg、皂苷Quil A lmg、膽固醇0. lmg和卵磷脂0. lmg， 冰浴超聲處理使溶液充分混勻並乳化，再用PBS透析，所得微絮狀物即為形成的免疫刺激 複合物。
5.根據權利要求4所述B肝病毒表面抗原的免疫增強型基因疫苗的製備方法，其特徵 在於所述步驟a的具體方法為al、HBsAg全長cDNA的克隆提取B肝病毒轉基因小鼠的肝臟細胞總RNA，逆轉錄得到 cDNA，再以該總cDNA為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4所示序列為上下遊引物，PCR擴 增兩端分別帶有Pst I和EcoR I酶切位點的HBsAg全長cDNA，PCR條件為94°C預變性3 分鐘，然後94°C變性1分鐘、58 °C退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，共30個循環，最後72°C延 伸7分鐘；PCR產物經純化後克隆入pGEM-T Easy載體，得重組載體pT_HBsAg ；a2、BAFF全長cDNA的克隆提取人脾臟組織總RNA，逆轉錄得到總cDNA，再以該總cDNA 為模板，以SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示序列為上下遊引物，PCR擴增兩端分別帶有 BamH I和Sal I酶切位點的BAFF全長cDNA，PCR條件為94°C預變性5分鐘；然後94°C變 性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環；最後72°C延伸10分鐘；PCR產物 經純化後克隆入pGEM-T Easy載體，得重組載體pT_BAFF ；a3、重組真核載體的構建自步驟al所得重組載體pT-HBsAg中用Pst I和EcoR I雙 酶切出HBsAg全長cDNA，經純化後與同樣用Pst I和EcoR I雙酶切的真核載體pStar連 接，得重組載體pStar-HBsAg ；再自步驟a2所得重組載體pT_BAFF中用BamH I和Sal I雙 酶切出BAFF全長cDNA，經純化後與同樣用BamH I和Sal I雙酶切的重組載體pStar-HBsAg 連接，即得HBsAg和BAFF雙基因共表達重組真核載體pStar-HBsAg-IRES_BAFF。
全文摘要
本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及一種B肝病毒表面抗原(HBsAg)的免疫增強型基因疫苗，該疫苗是由HBsAg和B細胞激活因子(BAFF)雙基因共表達重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂組成的免疫刺激複合物(ISCOM)型疫苗，能夠顯著增強HBsAg的免疫原性，促進抗HBsAg抗體的生成，在抗B肝病毒感染領域具有良好的應用前景；本發明還涉及該疫苗的製備方法，操作簡便，成本低。
文檔編號C12N15/79GK101884792SQ20101021319
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月29日 優先權日2010年6月29日
發明者吳玉章, 楊曌 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學