從中藥王不留行中分離獲得的三萜類化合物及它們的用途的製作方法

2023-07-27 09:01:11 1

專利名稱：：從中藥王不留行中分離獲得的三萜類化合物及它們的用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及醫藥
技術領域：
，更具體地說涉及從中藥王不留行中分離獲得的三萜類化合物及它{i、]的l矢:藥用途。技術背景王不留行為石竹科植物麥藍菜(Vaccariasegetalis(Neck.)Garcke)的乾燥成熟種子。具有活血通經，下乳消腫的作用。用於乳汁不下，經閉，痛經，乳癰腫痛的治療。該植物廣泛存在於亞洲、歐洲及世界其它地方。富含有大量三萜皂苷類和具有雌激素活性的環肽化合物。到目前為止，三萜類化合物已有在黃體細胞(Lutealcell)抑制(SegetosideF,anewtriterpenoidsaponinwithinhibitionoflutealcellfromtheseedsofVaccariasegetalis,Tetrahedronletters,2000,41(48):9205-9207.)和促子宮收縮能力(VaccaroidA,anewtriterpenoidsaponinwithcontractilityofratuterinefromVaccariasegetalis,Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,1997,7(8):1095-1096.)方面的報導。此外，國際上己有了王不留行藥材在體外抗月中瘤方面的石開究(InvitroanticanceractivityoftwelveChinesemedicinalherbs,Phytotheraphyresearch,2005,19(7):649-651.)，但針對其中的三砲皂苷類，還沒有這方面的報導。王不留行中皂苷類成分的已有提取分離方法主要是有機溶劑提取、DiaionHP-20、矽膠層析和RP-18高效液相色譜技術(Trite卬enoidsaponinsandsapogeninsfromVaccariasegetalis,Phytochemistry,1998，48,529-536.TriterpenoidsaponinsfromVaccariasegetalis,Phytochemistry,1998,47,1343-1349.ThreenewtriterpenoidsaponinsfromtheseedsofVaccariasegetalis,2000,J.AsianNat.Prod.Res"2,187-193.)。而本發明則沒有採用DiaionHP-20技術，只用了有機溶劑提取、矽膠層析和RP-18高效液相色譜技術，使分離的方法進一步簡單化。
發明內容本發明目的是提供一類從中藥王不留行中分離獲得的三萜皂苷類化合物，尋找具有醫藥用途的化合物。本發明的另一目的為提供該類化合物在製備治療腫瘤的藥物中的用途。本發明的化合物結構如下12:Rl=a-OH,R2=H;3:Rl=a-H,R2=H;5:Rl=(3-H，R2=Ac;6:Rl=卩-OH,R2=Ac;4上述化合物是通過如下的過程獲得的1.化合物提取分離從中藥王不留行中提取分離出六個三萜皂苷類化合物，它的提取分離步驟如下(1)提取經炮製後的王不留行樣品，用5090%的415倍量工業乙醇回流提取三次，每次15小時，合併提取液，減壓蒸餾回收乙醇得總浸膏。(2)分離王不留行總浸膏經矽膠柱層析，分別以含4個碳以下的有機溶劑洗脫，收集洗脫液。經減壓濃縮及D101大孔樹脂脫糖後，採用半製備型的高效液相色譜(InertsilODS-3柱，10X250毫米，2070%乙腈或甲醇-水(含0.065.50%三氟乙酸)為流動相，流速為0.86.0毫升/分鐘，紫外檢測器，210納米)分離，從中得到了六個三萜皂苷類化合物王不留行次皂甙I(vaccarosideI)(1)、王不留行次皂甙E(vaccarosideE)(2)、王不留行次皂武G(vaccarosideG)(3)、王不留行次皂武B(vaccarosideB)(4)、segetosideH(5)禾口segetosideI(6)。2.化合物的結構鑑定從王不留行分離得到一個新抗腫瘤三萜皂苷類化合vaccarosideI(1)，其波譜數據如下VaccarosideI(1)白色無定型粉末，[c^fl-16.0°(c0.668,甲醇/水=1/1);ESIMS(positivemode)m/z1579[M+Na]+and1557[M+H]+.ESIMS(negativemode)m/z1555[M-H]-;HRESIMS(positivemode)m/z1579.6778[M+Na]+得出其分子式為C7lH1I2037，IRvmaxcm":3407,2931,1731,1677:1384,1205,1137,1072;'HNMR(C5D5N,400MHz):S0.86,1.03,1.06,1.13,1.47和1.85(各3H,s，C-25,C-29,C-30,C-26,C-24和C-27上的甲基氫)，3.42(1H,dd,J=13.2，4.3Hz,H-18)，4.13(1H,m,H-3),5.22(1H，brt,H-16),5.61(1H,brs,H-12),9.92(1H,s,H-23).其它NMR數據見表2。其它五個化合物vaccarosideE(2)、vaccarosideG(3)、vaccaroidB(4)、SegetosideH(5)和SegetosideI(6)的結構鑑定是通過與文獻中所報導的波譜數據比車文得出的(TriterpenoidsaponinsandsapogeninsfromVaccariasegetalis，Phytochemistry，1998,48,529-536.TriterpenoidsaponinsfromVaccariasegetalis,Phytochemistry,1998,47,1343-1349.ThreenewtriterpenoidsaponinsfromtheseedsofVaccariasegetalis,J.AsianNat.Prod.Res"2000,2,187-193.)。表2化合物Vaccaroside1(1)的'H(400MHz)和L,C(10OMHz)核磁共振數據(C5D5N，JinHz)atableseeoriginaldocumentpage7葡萄糖，其中碳原子編號請參見如下結構式:formulaseeoriginaldocumentpage83.藥理試驗本發明對vaccarosideI(1)、vaccarosideE(2)、vaccarosideG(3)、vaccarosideB(4)、segetosideH(5)禾口segetosideI(6)進行了體夕卜抗月中瘤試驗，表明它們具有明顯的腫瘤抑制效果。試驗所用的細胞株為國際通用的腫瘤細胞株，S卩LNcap(人前列腺癌)、P-388(小鼠白血病)、A-549(人肺癌)。將腫瘤細胞培養在10%小牛血清的RPMI1640培養基中，內含100U/mL青、鏈黴素和2mmol/L穀氨醯銨(GIBCO，GrandIsland,NY)，在5%(]02和37"C條件下培養。化合物對前列腺癌細胞株LNcap和肺癌細胞株A549的細胞毒活性採用SRB法篩選(Newcolorimetriccytotoxicityassayforanticancer-dmgscreening,/#a/7.Cawcer/mt"1990，82(13):11071112)。實驗前將細胞按一定密度接種於96孔培養基(6000細胞/L)中，24小時後換用含有不同濃度受試藥物(用PBS配成1pg/ml工作液，使用時按所需濃度用培養基稀釋並加入細胞)的新鮮培養基，繼續培養72小時。終止培養，每孔加入10%三氯乙酸(TCA，終濃度為10%)，靜置5分鐘後移放於4'C環境1小時。蒸餾水洗滌5次，空氣乾燥，加入100^SRB染液(用1%醋酸配製成0.4%溶液)，染色處理細胞15分鐘，用1%醋酸溶液洗滌細胞4次，除去未結合燃料，空氣乾燥。最後加入150pl10mmol/L非緩衝Tris溶液溶解結合染料，充分混勻後，經酶標儀(modelVERSAMax,MolecularDevices)在515nm波長下測定並計算IC5。。化合物對小鼠白血病細胞株P388的細胞毒作用是通過Methyl-Thiazol-Tetrazolium(MTT,Sigma)方法觀lj定的(Feasibilityofdrugscreeningwithpanelsofhumantumorcelllinesusingamicroculturetetrazoliumassay,C鼎ceries.，1988,48:589-601)。將細胞按8000細胞/孔的密度接種於96孔培養基中，然後換用含有不同濃度受試藥物的新鮮培養基繼續培養72小時。培養結束時，每個孔中分別加入MTT(5mg/ml)，將培養板置於37°C環境中4小時。然後向其中加入'triplexsolution'(10%十二烷基硫酸鈉-5%異丁醇-12mM鹽酸)，細胞繼續在37。C環境中培養過夜。光密度可以在570nm處通過分光光度計上檢測出。細胞的生長抑制率可以通過如—卩公式計算[1-(A515藥物組/A515空白組)]x1000/0結果亦可以用ICsq表小，該數值通過Logit法計算得出，實驗結果見表3。表3化合物1-6的細胞毒活性測試(ICso值，^M)tableseeoriginaldocumentpage9aIC5Q:半數有效抑制濃度值。b拓撲替康(Topotecan)和多烯紫杉醇(decotaxel)作為陽性對照。上述實驗結果表明，三萜皂苷類化合物vaccarosideI(1),vaccarosideE(2)，vaccarosideG(3),vaccarosideB(4),segetosideH(5)禾口segetosideI(6)對3種不同的腫瘤細胞株均顯示明顯的抑制作用。本發明的有益效果本發明提供的從中藥王不留行中分離得到的化合物以及這些化合物的醫藥用途為研製新的抗癌藥物提供了新的思路，對深度開發中藥資源具有重要價值。具體實施方式下面通過實施例進一步描述三萜皂苷類化合物vaccarosideI(1),vaccarosideE(2),vaccarosideG(3),vaccarosideB(4)，segetosideH(5)禾口segetosideI(6)的分離製備，但實施例不限制本發明的保護範圍。實施例1:選擇經炮製後的王不留行藥材5公斤，用60升85。/。(V/V)的工業乙醇回流提取三次，每次2小時，合併提取液，減壓蒸餾回收乙醇得浸膏250克。浸膏經與300克100-200目矽膠拌樣後，通過矽膠柱層析分別以丙酮和甲醇洗脫分離。收集甲醇洗脫液，減壓回收溶劑至幹，並經過D101大孔樹脂柱脫糖後，得浸膏45克。取2克該浸膏配製成1克/毫升的水溶液，採用半製備型的高效液相色譜(InertsilODS-3柱1.0X25釐米；30-38%CH3CN々K(含0.6%三氟乙酸)為洗脫體系；流速3.5毫升/分鐘；紫外檢測器(210納米)；進樣量200微升)進行分離，收集相應流份，多次重複操作，從中分離得到了六個三萜皂苷類化合物vaccarosideI(1,12mg),vaccarosideE(2,51mg)，vaccarosideG(3,68mg),vaccarosideB(4,18mg),segetosideH(5,22mg)禾口segetosideI(6,24mg)。它們在HPLC圖譜上的保留時間分別為7.638、8.533、19.875、17.596、21.250和13.392分鐘(如圖14所示)。實施例2:選擇經炮製後的王不留行藥材5公斤，用40升60。/。(V/V)的工業乙醇回流提取三次，每次2小時，合併提取液，減壓蒸餾回收乙醇得浸膏260克。浸膏經與250克200-300目矽膠拌樣後，通過矽膠柱層析分別以丙酮和甲醇洗脫分離。收集甲醇洗脫液，減壓回收溶劑至幹，並經過D101大孔樹脂柱脫糖後，得浸膏50克。取2克該浸膏配製成1克/毫升的水溶液，採用半製備型的高效液相色譜(lne啦ilODS-3柱1.0X25釐米；6065%CH30H-水(含1.6%三氟乙酸)的洗脫體系；流速1.5毫升/分鐘；紫外檢測器(210納米)；進樣量200微升)進行分離，收集相應流份，多次重複操作，從中分離得到了六個三萜皂苷類化合物vaccarosideI(1，15mg),vaccarosideE(2,50mg),vaccarosideG(3,70mg),vaccarosideB(4，18mg)，segetosideH(5，20mg)禾口segetosideI(6,25mg)。權利要求1.從中藥王不留行中分離獲得的三萜皂苷類化合物，它們的化學結構式如下2.如權利要求1所述三萜皂苷類化合物的製備方法，由如下歩驟組成提取經炮製後的王不留行樣品，用5090%的415倍量工業乙醇回流提取三次，每次15小時，合併提取液，減壓蒸餾回收乙醇得總浸膏；王不留行總浸膏經矽膠柱層析，分別以含dC4的有機溶2)刀洗脫，收集洗脫液，經減壓濃縮及D101大孔樹脂脫糖後，採用:InertsilODS-3柱，10X250毫米；半製備型的高咱色譜分流動相流速為0.86.0毫升/分鐘；紫外檢測器；210納米，從中得到如權利要求1中所述的三萜皂苷類化合物。3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟2)中的流動相為2070°/。乙腈或甲醇-水，其中含0.065.50%三氟乙酸。4.如權利要求1所述的三萜皂苷類化合物在製備治療腫瘤的藥物中的應ffi。全文摘要本發明公開了從中藥王不留行中分離獲得的六個三萜皂苷類化合物王不留行次皂甙I(vaccarosideI)(1)、王不留行次皂甙E(vaccarosideE)(2)、王不留行次皂甙G(vaccarosideG)(3)、王不留行次皂甙B(vaccarosideB)(4)、segetosideH(5)和segetosideI(6)。經體外抗腫瘤試驗表明，該類化合物對LNcap、P-388和A-549細胞株具有明顯的抑制作用，為研製新的抗腫瘤藥物提供了思路，對深度開發中藥資源具有重要價值。文檔編號A61P35/00GK101333238SQ20071004256公開日2008年12月31日申請日期2007年6月25日優先權日2007年6月25日發明者健丁,唐意紅,孫兆林,李志雄,樓麗廣,範明松,馬春輝,黃成鋼申請人:中國科學院上海藥物研究所