脊柱髓核植入物的製作方法

2023-07-28 02:22:36

專利名稱：：脊柱髓核植入物的製作方法脊柱髓楊植入物本申請是申請日為2007年10月5日、申請號為200780042201.6的同名申請的分案申請。描述本發明涉及用於治療椎間盤的脊柱髓核植入物和因此特別地涉及CD-RAP蛋白的用途。椎間盤(IVD)的退變是牽涉機械、遺傳和生物因素的多因素過程。儘管病理生理學機制仍然不清楚，但已對所產生的椎間盤的結構和功能的變化進行了詳盡的描述。與關節軟骨不同，IVD由不同的組織組成。健康的IVD是包含由纖維性纖維環(annulusfibrosus)(AF)圍繞的果凍樣髓核(NP)的良好包覆的無血管器官，其提供椎骨之間的可動性和緩衝。髓核位於各椎間盤的中央並且由軟骨細胞組成，所述軟骨細胞在成人中產生包含高百分比的蛋白聚糖(PG)和II型膠原的細胞外基質。髓核由纖維環圍繞，所述纖維環由高度組織的、在同心性骨板(concentricIameIlae)中定向的定向排列的膠原纖維和細胞外基質組成。內纖維環比外纖維環厚並且具有缺少片層結構的纖維軟骨基質(fibrocartilaginousmatrix)。薄的不同區域(過渡區(transitionzone)(TZ))將內纖維環與髓核分開。在衰老過程中，髓核的蛋白聚糖含量的減少導致減少的水合作用和退變的跡象，包括椎間盤高度的減少和脊柱外圍結構上載荷的增加。在生物學水平上，其反映髓核細胞的正常合成代謝和分解代謝功能之間的不平衡。在退變性椎間盤疾病(DDD)的一些病例中，IVD的逐漸退變由機械不穩定性引發。髓核上增加的載荷和壓力使細胞或侵入的巨噬細胞產生更大量的細胞因子或毒性量的金屬蛋白酶(MMP)。隨著DDD的發展，毒性水平的細胞因子和MMP降解細胞外基質和導致蛋白聚糖的破壞，從而減少持水力，導致髓核脫水。隨後，髓核的彈性減少，結果可能產生纖維環的分層，最後發生內裂縫(internalfissure)向外周展開。這些改變引起甚至更大的機械不穩定性和誘導細胞因子產生，這促進了DDD，椎間盤開始凸出(椎間盤脫出疾病)，最終破裂，導致神經刺激和腰痛。不幸的是，與椎間盤相關的腰痛的大多數現有療法關注於獲得症狀緩解而非修復根本的退變過程(degenerativeprocess)。保守性治療由物理手段、止痛藥、肌肉鬆馳藥、非類固醇抗炎藥、全身性糖皮質激素的使用、細胞因子拮抗劑的硬膜外注射和注射組成。在療法的更後期，退變性椎間盤的治療是除去退變的椎間盤和在椎間盤的任一側融合相鄰的椎骨或用合成的椎間盤材料替換椎間盤。椎間盤替換或融合不恢復正常的椎間盤高度、生理或機械性質，這很可能在手術部位或相鄰的椎間盤處導致其他症狀。因此，需要抑制或逆轉退變背後的細胞平衡失調和恢復椎盤生物學功能的其他治療方法。全世界許多研究者正在尋找修復退變的椎間盤(degeneratedintervertebraldisc)的生物學方法。化學髓核溶解劑(Chemonucleolyticagent)例如木瓜凝乳蛋白酶在過去一直用作治療脫出的IVD(herniatedIVD)的方法。疼痛的減輕與降解PG(從而減少椎間盤內壓力和減輕受累神經根的壓迫)的能力相關。然而，相關的併發症例如過敏反應、神經損傷和感染減少了木瓜凝乳蛋白酶的用途。更近以來，軟骨素酶ABC(C-ABC)被建議用作化學髓核溶解術的備選，因為其缺少蛋白酶活性並且具有更窄的底物譜。儘管軟骨基質的再生在使用C-ABC治療後比使用木瓜凝乳蛋白酶更早發生，但椎間盤高度和PG含量沒有充分恢復，給IVD留下改變的最適度以下的生物化學性質，從而加速事件的退變性級聯反應(Takegami等人,2005;Masuda等人,2004;Masuda和An,2004)。W02005/000283和其中的參考文獻描述了治療退變性椎間盤疾病的方法，包括將拮抗劑例如MMP的高親和力拮抗劑、高特異性細胞因子拮抗劑、高特異性P38激酶抑制劑、抗炎藥、環化素(cycline)化合物、抗增殖劑或抗凋亡劑注射入患病的椎間盤。這些化合物據認為通過促炎細胞因子、MMP的抑制、前列腺素的調控或促炎效應的減少來抑制DDD中的分解代謝過程或抑制軟骨細胞增殖或凋亡，但未描述合成代謝活性。W02006/086105描述了使用轉錄因子抑制劑治療和/或逆轉椎間盤的病症的方法，所述抑制劑靶向轉錄因子例如NF-kB、E2F、GATA-3和STAT。W02006/031376描述了治療退變性椎間盤疾病的方法，包括將抗氧化劑單獨地或·與另外的治療劑例如血纖蛋白、透明質酸、幹細胞、骨髓或生長因子一起施用入椎間盤。在其他研究中，已將外源生長因子如轉化生長因子i3-l(TGF_i3I)、胰島素樣生長因子-I(IGF-I)、骨形態發生蛋白-2(BMP-2)、生長和分化因子_5(⑶F-5)以及成骨蛋白(0P-1)施用至椎間盤內細胞或進行椎間盤內注射以刺激蛋白聚糖和膠原的合成，從而減慢或逆轉IVD的退變(Levicoff等人，2005;Sobajima等人，2004;Takegami等人，2005;Kawakami等人，2005)。然而，這些生長因子具有相當的非特異性，具有誘導成骨基因的風險，從而可誘導不希望的骨形成。該生長因子技術的應用的另一個限制是外源生長因子的相對短的生物學半衰期，這使得在它們遞送後只能夠產生短暫的生物學效應。因此，本發明的目的是提供改善或恢復椎盤(vertebraldisc)的生物機械性質和/或抑制影響椎盤的疾病的進一步發展的脊柱髓核植入物。本發明的另一個目的是提供包含能夠逆轉影響椎盤的疾病過程、恢復椎盤的性質或抑制疾病的進一步發展的軟骨分化和維持因子的髓核植入物。本發明的另一個目的是通過在犧牲IVD內的分解代謝過程的情況下刺激合成代謝過程來改變軟骨動態平衡以提供用於治療慢性病況例如DDD的新方法。本發明的另一個目的是提供包含用於治療椎盤的局部退變的軟骨分化和維持因子的髓核植入物，其中軟骨分化和維持因子為患者提供治癒、減緩疾病發展和/或改善患者健康的更好的機會。另一個目的是提供脊柱髓核植入物以增加IVD組織中的椎間盤高度和蛋白聚糖含量。本發明的另一個目的是提供髓核植入物，所述植入物包含用於在人中提供，除了軟骨維持外，特定細胞因子的作用的壓制和抑制以治療慢性病況例如DDD的軟骨分化和維持因子。本發明的另一個目的是提供可通過微創法(minimalinvasiveprocedure)或內窺鏡植入或注射的脊柱髓核植入物。本發明的另一個目的是提供髓核植入物遞送系統，所述遞送系統能夠提供治療劑的更長水平或持續控制釋放，從而確保所述治療劑在退變的IVD的部位可使用更長的時間範圍(timeframe)。本發明的另一個目的是提供脊柱髓核植入物，所述植入物是能夠提供更長水平的治療劑的遞送系統。為實現本發明的目的，提供包含作為非抗體或非受體分子的軟骨分化和維持因子的脊柱髓核植入物或配製劑。所述植入物特別地是經椎間盤可注射的或可植入的(injectableorimplantabletransdiscally)。為了清楚起見，非抗體是指軟骨分化和維持因子不是抗體例如抗TNFa的單克隆抗體、多克隆抗體或嵌合抗體。受體分子是指具有抗促炎細胞因子例如TNFa的高特異性的受體分子、其截短形式或其功能等同物。本發明者已開發了許多通過對病理脊柱病症(例如DDD)施用有效量的功能性生物分子來治療病理脊柱病症例如退變性椎間盤疾病的方法。根據本發明，一個實施方案包括治療椎間盤的方法，其中優選通過一次或重複注射經椎間盤施用治療有效量的軟骨分化和維持因子。在一個實施方案中，軟骨分化和維持因子選自能夠刺激IVD細胞的分化和維持同時抑制不希望的骨形成的高度軟骨特異性蛋白例如CD-RAP或其活性片段。這樣的軟骨分化和維持因子如⑶-RAP抑制細胞因子和MMP的活性和/或減少此類細胞因子和MMP的表達，同時刺激導致退變組織例如纖維軟骨的部分或完全恢復的合成代謝過程，從而能夠逆轉或終止疾病過程。因此，軟骨分化和維持因子的注射幫助阻止退變性椎間盤的衰老過程。因此，本發明使得能夠在較早的階段治療退變性椎間盤，從而阻止細胞外基質的降解。此外，軟骨分化和維持因子減輕或阻止軟骨降解以及保持或改善IVD的結構和功能，優選沒有不希望的骨形成。本發明的另一個實施方案涉及軟骨決定和維持因子在製備用於治療需要該治療的哺乳動物的脊柱病症的藥物組合物中的用途。在優選實施方案中，脊柱病症是特發性腰痛、椎間盤脫出、椎間盤內破裂或裂縫的椎間盤、神經根病、椎管狹窄、脫出的髓核-誘導的坐骨神經痛、坐骨神經痛、特發性脊柱側凸或脊髓病。本發明的另一個方面包括脊柱核(spinalnucleus)植入物或配製劑(其包含作為非抗體或非受體分子的軟骨分化和維持因子，優選其中植入物或製劑是經椎間盤可注射的或可植入的)在製備用於治療需要該治療的哺乳動物的脊柱病症的藥物組合物中的用途。為了本發明的目的，術語「脊柱髓核植入物」是指將被施用至椎間盤，特別地施用入椎間盤的髓核(NP)的裝置或製劑。優選，可通過AF將植入物直接施用入椎間盤或將其直接置於椎間盤的NP內。可通過針或微創法的其他方法將其注射入椎間盤。其還指脊柱髓核植入物是可注射入髓核、椎間盤內間隙(intradisealspace)或椎間隙的藥物製劑。植入物可以是包含軟骨分化和維持因子的固體，例如海綿或固體載體。優選，植入物是允許其容易施用的液體。植入物例如可以是包含軟骨分化和維持因子(任選與其他藥物、配製助劑(formulationaid)或載體一起)的液體。在使用更大大小的載體材料的情況下，椎間盤的部分或完全去除可以是優選的。為了本發明的目的，術語「經椎間盤施用(transdiscaladministration)」包括但不限於脊柱髓核植入物至椎間盤內，特別地至椎間盤的NP內的注射，所述椎間盤包括完整的椎間盤、不同階段的退變的椎間盤、脫出的椎間盤(herniateddisc)、破裂的椎間盤(ruptureddisc)、分層的椎間盤(delaminateddisc)或裂縫的椎間盤(fissureddisc)。如果待注射的體積可能對NP造成壓力，可在注射或施用用於脊柱的植入物之前去除至少部分NP。在一些情況下，去除的材料的體積為大約待施用的體積±20%的量。術語經椎間盤施用還包括脊柱髓核植入物至退變的或完整的椎間盤(如上面對於NP所描述的)的AF內的注射。在使用更大大小的載體材料的情況下，在施用脊柱髓核植入物之前，部分或完全去除椎間盤可能是必需的。其還包括將植入物提供入位於外部的但與相鄰椎體的AF壁或終板(endplate)緊密相鄰的位置，這可以避免AF的穿刺，從而避免椎間盤上的潛在負荷。術語「退變性椎間盤疾病(DDD)」是特徵部分在於髓核的蛋白聚糖和水含量的逐漸喪失的慢性過程，其可表現在多種病症例如特發性腰痛、椎間盤脫出、椎間盤內破裂或裂縫的椎間盤、神經根病、椎管狹窄、脫出的髓核-誘導的坐骨神經痛、坐骨神經痛、特發性脊柱側凸和/或脊髓病中。椎間盤退變級別可通過手術前MRI的分析來分級。術語「軟骨分化和維持因子」是指一種或多種軟骨分化因子，所述因子可具有促有絲分裂能力，但特徵在於它們增加和/或保持細胞的軟骨細胞特異性表型(例如合成代謝活性)而無不希望的骨形成的能力。軟骨細胞特異性特徵是例如聚集蛋白聚糖(aggrecan)、·II型膠原、S0X-9和蛋白聚糖的產生。軟骨形成形態發生素(Chondrogenicmorphogen)可將椎間盤細胞的去分化或纖維變性表型逆轉至與更年輕的和正常成人的椎間盤的椎間盤髓核細胞(discnucleuscell)相當的纖維軟骨細胞表型。其還可對椎間盤的纖維環細胞(annuluscell)和/或終板細胞具有合成代謝作用。軟骨分化和維持因子優選是分泌分子，從而可以以自分泌、旁分泌或內分泌的形式潛在地起作用。根據本發明的「間充質幹細胞(MSC)」是作為未定型的間充質祖細胞存在於許多成熟骨骼組織中的原始細胞或靜止細胞群體。MSC是可變化的(flexible)並且具有向幾種成熟組織類型包括軟骨、骨、脂肪和其他組織(取決於提供給這些靜止細胞的環境和生物學信號)分化的能力。MSC可從許多自體來源包括骨髓、血液、肌肉組織和脂肪獲得，所述自體來源可經收穫來分離這些細胞而無顯著的供體部位發病率或免疫原性潛力。MSC可以是NP細胞或AF細胞、軟骨細胞或可如AF或NP細胞那樣起作用的或可以分化成細胞或建立功能性NP和/或AF的其他活細胞的前體細胞。本文中所使用的「治療或醫治」是指與病症或疾病相關的症狀的減輕、症狀的進一步發展或惡化的停止、疾病或病症的防治或預防。本發明基於這樣的發現，即軟骨分化和維持因子例如MIA(黑素瘤抑制活性因子)家族的成員如CD-RAP可通過合成代謝作用(例如脊柱中的纖維軟骨的再生或恢復)影響或改變脊柱病症，同時阻止或抑制脊柱椎間盤內的分解代謝退變過程(例如細胞外基質的退變)。軟骨分化和維持因子對脊柱病症的這樣的效應是令人吃驚的，因為椎間盤(IVD)的軟骨與其他普通軟骨相當不同。與稱為透明軟骨的關節軟骨相反，IVD的軟骨由其為特殊類型的軟骨的纖維軟骨組成。特別地，IVD的AF被認為是纖維軟骨性的並且主要由高度定向的膠原纖維組成的片層組成。NP包含更高含量的隨機定向的II型膠原，和更高濃度的蛋白聚糖。AF的細胞已顯示沿著片層的佔優勢的膠原纖維方向定向排列。最裡面的AF和NP區域的細胞更圓並且累積更多的II型和VI型膠原以及蛋白聚糖。在纖維軟骨和其他類型軟骨例如關節/透明軟骨之間存在顯著的物理和化學差異(W02005/091960和其中的參考文獻)。例如，纖維軟骨的不同在於在其主要存在於纖維環中的基質中具有許多I型膠原。來自纖維軟骨例如IVD軟骨的II型膠原比來自關節軟骨的II型膠原具有顯著更高水平的羥基化和糖基化並且聚集蛋白聚糖具有更多的取代。這些翻譯後修飾影響纖維軟骨膠原和IVD的結構和物理功能。纖維軟骨IVD的出生前分化(Antenataldifferentiation)也與滑膜關節中的關節軟骨的出生前分化不同。IVD具有複雜的發育史並且包含脊索來源的細胞，所述脊索來源的細胞在關節軟骨中不具有等同物。在本發明之前，未曾顯示本發明的軟骨分化和維持因子例如CD-RAP具有在體外或體內阻止纖維軟骨或纖維軟骨細胞退變的生物學效應。本發明的軟骨分化和維持因子誘導和維持IVD中的軟骨合成代謝(例如蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖的合成)，同時退變和軟骨分解代謝(包括基質的分解、異常蛋白聚糖和膠原的合成)的發病機理部分或完全被阻止、抑制或甚至逆轉。異常椎間盤退變、增加的凋亡和減少的基質分子合成至少部分由細胞因子例如IL-I介導，所述細胞因子顯示將軟骨細胞從合成代謝轉換至分解代謝，包括分子和形態學水平上的軟骨分解。由本發明介導的細胞因子和MMP(已知其參與椎間盤退變)的活性的抑制和/或此類細胞因子和MMP的表達的減少有助於正常椎間盤基質的再合成並且影響椎間盤細胞功能。因此，軟骨分化和維持因子的注射幫助阻止或逆轉退變性椎間盤的老化或退變過程。因此，本發明使得能夠在較早階段治療退變性椎間盤，從而阻止細胞外基質的降解和保持IVD的結構和功能。優選，本發明的軟骨分化和維持因子是非抗體和非受體分子。這表示根據本發明使用的因子既不是抗體分子也不是受體分子。軟骨分化和維持因子優選是非轉錄因子(例如，不是S0X-9)或優選是細胞外蛋白質。更優選，軟骨分化和維持因子不選自轉化生長因子β(TGF-β例如TGF-βI)-、骨形態發生(BMP)-和胰島素樣生長因子(IGF)-家族蛋白(例如IGF-1)。BMP蛋白由Wozney等人(Wozney和Rosen,1998)描述並且包括例如BMP-2、BMP-7以及生長和分化因子例如⑶F-5、⑶F-6和⑶F-7。優選，軟骨分化和維持因子是軟骨形成形態發生素，更優選是這樣的軟骨形成形態發生素，其為具有軟骨再生(合成代謝因子)和維持的合成代謝活性的蛋白質(優選軟骨特異性蛋白)。合成代謝因子，與誘導髓核區域降解的分解代謝因子例如金屬蛋白酶、凋亡因子、白細胞介素、前列腺素、蛋白質水解和降解酶、氧自由基、一氧化氮和纖連蛋白片段相反，在椎盤內增加細胞的軟骨細胞特異性表型。優選，軟骨形成形態發生素是優選對於軟骨組織是特異性的控制軟骨形成和維持同時又避免或抑制骨形成的軟骨決定因子(cartilagedeterminationfactor)。在一個實施方案中，軟骨分化因子具有小於80kDa，優選彡30kDa,更優選(15kDa，最優選10至15kDa的分子量。根據本發明使用的軟骨分化和維持因子特別地是誘導細胞外基質蛋白例如蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖和/或膠原的合成的因子。另外，優選，所述因子導致細胞因子和MMP的量減少。在一個實施方案中，軟骨分化和維持因子選自具有SH3-結構域或具有採用SH3-樣結構域摺疊的結構域的蛋白質例如CD-RAP。SH3-結構域或SH3-樣結構域描述於例如Stoll等人(Stoll等人,2001b)中並且可通過用Kelley等人(Kelley等人,2000)中公布的3D-PSSMWeb伺服器預測SH3-摺疊來確定。SH3-結構域(也稱為Src同源結構域)是在許多細胞內蛋白中發現的蛋白質分子。到目前為止，還未描述過SH3-結構域蛋白質用於治療脊柱病症。在另一個實施方案中，軟骨分化和維持因子是可特異性結合纖連蛋白、纖連蛋白片段和/或富含脯氨酸的序列的蛋白質，如例如文獻(Stoll等人，2001a;Homandberg和Hui,1996;Homandberg等人，1997)中所述。在一個實施方案中，軟骨分化和維持因子包含纖連蛋白或整聯蛋白結合結構域。軟骨分化和維持因子與細胞外蛋白例如纖連蛋白或纖連蛋白片段以及整聯蛋白的結合可以例如通過ELISA來確定。可將纖連蛋白、其片段或整聯蛋白塗鋪在塑料表面上並且暴露於軟骨分化和維持因子。結合的量可通過過氧化物酶偶聯的抗軟骨分化和維持因子單克隆抗體來測定。整聯蛋白結合還可如Bauer等人(通過引用合併入本文)所述來測定。優選，軟骨分化和維持因子選自a)包含或具有⑶-RAP的成熟序列(SeqIDNo.I)的軟骨細胞蛋白和其功能性片段或變體，b)與CD-RAP的C端4個半胱氨酸骨架(SeqIDNoI的胺基酸12至107)具有至少63%、優選80%、更優選90%的胺基酸序列同源性的蛋白質，或c)具有本文中定義的通式序列(genericsequence)I至3(SeqIDΝο·2、3和4)中的任一個的蛋白質。具有與⑶-RAP相同的生物學功能的功能性片段優選具有SeqIDNoI中所示的序列的至少20，特別地至少40和更優選至少50，最優選80個連續胺基酸的長度。優選，功能性片段包含SeqIDNo.I的位點I至50、I至70、I至80、20至80、20至107的胺基酸。成熟的CD-RAP序列(SeqIDNo.I)GPMPKLADRKLCADQECSHPISMAVALQDYMAPDCRFLTIHRGQVVYVFSKLKGRGRLFWGGSVQGDYY⑶LAARLGYFPSSIVREDQTLKPGKVDVKTDKWDFYCQ通式序列I(SeqIDNo.02)CX4CX17CX12VXn_13WX7_18FX4VX21CX通式序列2(SeqIDNo.03)KXCXDXECXnDX3PDCX12VX2KLX7_9WXGSX5_13GYFPX3VX18DFXCX通式序列3(SeqIDNo.04)KXCXDX2CX8AX2DX3PDCRFX5GXVX5KLX7WXGSVX12GYFPX22DFXCQ其中各獨立出現的「X」代表任何胺基酸，小寫的數字表示任何胺基酸的數目。優選，「X」獨立地代表天然存在的胺基酸，特別是A、R、N、D、B、C、Q、E、Z、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V。特別優選，軟骨分化和維持因子是CD-RAP(軟骨源性視黃酸敏感蛋白)(也稱為MIA(黑色素瘤抑制活性))、0T0R(纖維細胞來源的蛋白、FDP、MIA-樣、MIAL)和屬於分泌蛋白種類的TANGO130(Bosserhoff等人，2004;Bosserhoff和Buettner,2003;Bosserhoff等人，1997;W000/12762)。⑶-RAP或MIA是作為軟骨樣分化的高度特異性標記的130個胺基酸的蛋白質(EP0710248，EP1146897，全部通過引用合併入本文)。基因表達在軟骨形成開始時至整個軟骨發育過程中被激活(Dietz和Sandell,1996;Sakano等人，1999)。在由骨關節炎引起的軟骨損傷的情況下，CD-RAP在疾病開始發生時表達水平增加，此時觀察到強合成代謝作用，一旦疾病惡化其表達下降(Saito等人，2002)。本文中涉及的蛋白質可在原核或真核宿主細胞中從完整的或截短的基因組DNA或cDNA或從合成的DNA表達。蛋白質可從培養基或內含體分離和/或再摺疊，從而形成生物學活性組合物。關於⑶-RAP的重組蛋白純化的示例性方案，參見例如EP0710248和Lougheed等人(Lougheed等人,2001)。在Tscheudschilsuren等人和Stoll等人(Tscheudschilsuren等人，2005;Stoll等人，2003)(其公開內容通過引用合併入本文)中描述了如何檢測此類分離的蛋白質的活性(例如軟骨形成)的詳細描述。軟骨誘導的生物測定法描述於EP1146897的實施例2至5中，其通過引用合併入本文。實施例5描述了用於軟骨誘導的小鼠異位植入測定法。可選地，軟骨誘導和維持可在部分或完全厚度的關節軟骨修復模型中進行測定。在本發明的一個實施方案中，脊柱髓核植入物還包含一種或多種另外的活性劑，優選抗分解代謝劑(anticatabolic)(例如ΜΡ-1和ΜΡ-2)、促有絲分裂劑(例如IGF-1、PDGF,EGF、FGF)、骨形態發生蛋白例如⑶F_5、BMP拮抗劑例如頭蛋白或脊索發生素和/或細胞內調節劑(例如LMP-I、S0X-9)或其組合。抗分解代謝劑的加入還例如通過抑制降解酶來增加由軟骨分化和維持因子或軟骨形成形態發生素介導的基質合成。促有絲分裂分子是這樣的生長因子，其增加細胞的有絲分裂速率並且還可能增加PG合成至不同程度(取決於細胞所來源的椎間盤的區域)，從而進一步支持軟骨分化和維持因子或軟骨形成形態發生素的作用。通過將軟骨分化和維持因子與細胞內調節劑組合，可在體外實驗中實現軟骨分化和維持因子和/或PG合成的上調。在另一個實施方案中，脊柱髓核植入物還包含一種或多種抗金屬蛋白酶、環化素化合物、細胞因子拮抗劑、TNF抑制劑、IL抑制劑、抗血管生成物質(anti-angiogenicsubstance)、蛋白水解酶的抑制劑、抗炎藥物包括英利昔單抗、依那西普(etanercerpt)、阿達木單抗(8(^1；[1]1111313)、奈瑞莫單抗(116代1；[1]10111]^13)、來那西普(lenercerpt)等，或其組合。在另一個實施方案中，為了防止椎間盤的長期結構性損傷，將脊柱髓核植入物與化學髓核溶解劑例如C-ABC或US2005/0031666中描述的化學髓核溶解劑一起共施用或在注射或施用所述化學髓核溶解劑後再施用脊柱髓核植入物。優選，脊柱核植入物是經椎間盤可注射或可植入的。優選，注射是局部或非全身性注射。經椎間盤注射或植入的有利方面是可使用更高濃度的軟骨分化和維持因子同時引起最小的全身性毒性。可將軟骨分化和維持因子或IVD椎間盤修復劑於可接受的溶劑或媒介物例如但不限於生理鹽水溶液、無菌水、林格氏液中直接進行植入或注射。優選，將其施用入椎間盤內或NP間隙。可通過單次或重複注射，優選通過經皮注射或經由導管經皮進行施用。軟骨形成蛋白優選CD-RAP的椎間盤內注射將通過刺激椎間盤細胞上調蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖和/或膠原合成來增加椎間盤的高度。因此可通過微創技術來進行臨床應用，從而顯著地節省費用和與其他方法例如部分間盤切除術(disectomy)或椎體融合相比減少併發症的可能性。可以將本發明的脊柱髓核植入物加入至椎間盤，還可以去除椎間盤的部分並用本發明的植入物替代它。因此，本發明還提供了使用本發明的髓核植入物替代一定量的例如在髓核摘除術(nucleotomy)或部分髓核摘除術中被除去的NP或補充由於年齡、損傷等原因而退變的NP。正在退變或已退變的椎間盤或其部分可用標準技術，使用雷射、刮刀或其他手術器械來去除。正在退變的椎間盤可以是完整的椎間盤或破裂的椎間盤。正在退變的椎間盤可被分層，可具有裂縫或可脫出。脊柱髓核植入物可與微創穩定術結合。在其中持續刺激導致不希望的因子例如分解代謝因子產生的晚期椎間盤退變(advanceddiscdegeneration)的嚴重病例中，微創穩定術可進一步支持再生或抑制退變的椎間盤的發展。在本發明的一個實施方案中，植入物或配製劑還可包含載體或藥物遞送裝置。本發明中使用的載體或藥物遞送裝置是生物相容的，因為其是無毒的並且在身體內不引起炎症反應。載體可包括基質或支架結構。載體可以是固體、液體、凝膠、糊劑或其他可注射形式。優選，載體包括水凝膠例如W02005/113032中描述的水凝膠，特別地可注射的水凝膠、硫酸化的透明質酸、高度取代的羧甲基纖維素和其鹽、藻酸鹽、褐藻酸丙二醇酯(hydroxypropylalginate)、殼聚糖、輕乙基澱粉(hydroxethylstarch)、膠原、明膠、reversethermal凝膠(例如PluronicF128)、基於殼聚糖的熱敏共聚物(例如chitosan-Pluronic水凝膠)、多孔絲支架、多個微球體、脂質體配製劑和羥基磷灰石纖維網。載體是適合IVD細胞的向內生長、增殖和駐留(residence)的細胞的適當底物。載體可包括聚合物例如Pluronics例如pluronicl68,環氧乙燒和環氧丙燒的嵌段共聚物，例如W02005/034800中描述的嵌段共聚物。優選，載體包括硫酸軟骨素、明膠、乙醯透明質酸和/或透明質酸鈉或其混合物，包括三-共聚物例如明膠/軟骨素-6-硫酸/乙醯透明質酸三-共聚物。三-共聚物的製備描述於Yang等人(Yang等人，2005),其完全合併入本文作為參考。載體可包括由富含血小板的血漿組成的血纖蛋白凝膠、與生物可降解明膠水凝膠一起的富含血小板的血眾、血纖蛋白/透明質酸複合物(composite)、封裝有因子的明膠水凝膠微球體、可注射的生物可降解的水凝膠複合物(其包含例如聚合物例如寡(聚(乙二醇)延胡索酸酯、聚乳酸(PLA)/聚乙醇酸(PGA)和聚ε己內酯(polyepsiIoncapronolactone))。優選，載體包括殼聚糖-甘油磷酸酯或原位血凝塊或用殼聚糖-甘油磷酸酯溶液穩定的血凝塊。在本發明的一個實施方案中，脊柱髓核植入物還包含持續釋放裝置，例如包括水凝膠、聚陰離子水凝膠、多個微球體、脂質體配製劑和羥基磷灰石纖維網的持續釋放裝置。持續釋放裝置特別地使得能夠進行受控釋放。在一個實施方案中，持續釋放裝置提供了連續不斷的釋放，在另一個實施方案中，持續釋放裝置提供間歇性釋放。在一個實施方案中，軟骨分化和維持因子封裝在脂質體中。脂質體具有優於晶體溶液的有利方面，因為可避免椎間盤中的機械刺激，從而除了延長治療劑的持續時間和減慢在施用部位的清除之外可避免治療誘導的炎症。用於提高治療化合物和其他試劑的遞送效率的一個方法是在脂質結構例如脂質體中進行封裝。脂質體通常包含具有核心(所述核心通常在水性介質中包含化合物)的封閉脂滴。在某些實施方案中，將化合物化學結合至脂質組分或僅將其包含在脂質體的水性內腔中。優選以乾燥的脂質體組合物(其可進行重構以產生封裝軟骨分化和維持因子的脂質體)的形式提供根據本發明的包含軟骨分化和維持因子的藥物組合物或脊柱髓核植入物。優選，脂質體製劑是乾燥的重構媒介物(DRV)，其在水性溶液中重構後，形成封裝有軟骨分化和維持因子的脂質體。本文中使用的脂質體組合物是例如乾燥的顆粒狀產物，其在加入水後分散，從而形成包含生物活性成分的多層脂質體配製劑。有利地，通過使用乾燥的脂質體來避免活性劑和/或脂質體的穩定性問題例如聚集或氧化。適合用於配製劑的單獨地或以混合物形式存在的脂質包括中性或帶正電荷的脂質例如膽固醇、磷脂醯膽鹼、氫化磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯膽鹼、鞘磷脂、磷脂醯膽鹼二油酯(dioleylphosphatidylcholine)、磷脂醯甘油二油酯(dioleylphosphatidyIglycerol)、磷脂醯甘油、二肉豆蘧醯磷脂醯膽鹼(dimyristoyIphos口1^1^(171(31101;[116)、二棕櫚醯膽鹼((1丨。31111;[1071(31101;[116)、神經節苷脂、神經醯胺、磷脂醯肌醇、磷酸、雙十六燒基磷酸酯、dimyrylstoylphosphatidylcholine、硬脂醯胺、二棕櫚醯磷脂醯甘油(dipalmitoylphosphatidylgycerol)和其它相似脂質。優選脂質混合物帶電荷。脂質體配製劑通常是至少兩種脂質例如膽固醇和磷脂醯膽鹼的混合物，更常見三種或更多種脂質的混合物。在另一個實施方案中，將本發明的軟骨分化和維持因子PEG化(pegylated)。該經修飾的軟骨分化和維持因子具有大於未經修飾的試劑的生物學半衰期，從而可提高試劑用於脊柱病症的醫學治療(medicaltreatment)的功效。PEG化可增加蛋白質的大小、提高穩定性、增加蛋白質的溶解性、減少蛋白質水解和減少給藥頻率。此外，可減少朝向蛋白質聚集的傾向。PEG化可通過蛋白質上的氨基或巰基與聚乙二醇(PEG)上的化學反應基團(碳酸酯、酯、醛或三氟乙基磺酸單甲氧基(tresylate))之間的穩定的共價鍵實現。所得的結構可以是線性的或分支的。PEG試劑例如描述於Roberts等人(Roberts等人，2002)中。其他PEG化試劑是但不限於甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)、甲基PEO12馬來醯亞胺PEG、包含胺反應性、加甲基帽的(methyl-capped)聚環氧乙燒(PEO)的修飾試劑(甲基PEOn-NHS酯，n=4、8,12)。在另一個實施方案中，本發明的脊柱核植入物包含髓核組織或細胞，優選來源於間充質幹細胞(MSC)的細胞。在軟骨分化和維持因子單獨地或與其他形態發生素或生長因子如IGF-I成員或BMP—起存在的情況下，可將從供體組織(例如骨髓基質)分離的MSC或自體幹細胞培養在三維的生物可降解的支架材料例如透明質酸、絲、膠原、膠原/乙醯透明質酸支架、水凝膠、殼聚糖、殼聚糖凝膠、可注射的可交聯的聚合物製劑、可降解的聚合物凝膠或支架、聚乳酸、明膠/軟骨素-6-硫酸/乙醯透明質酸支架、透明質酸的酯或衍生物例如Hyaff11、羥基磷灰石纖維網和血纖蛋白膠中或其上，所述形態發生素或生長因子支持此類細胞分化成髓核-樣細胞並且優選在氧張力下刺激PG合成。用於培養的方法例如描述於Honda等人，2000，其通過引用合併入本文(Honda等人，2004)。然後將所得的培養的細胞或新組織，優選，與支架材料一起，移植入或注射入受累椎間盤以達到NP的再生。還可以在單層培養物中例如在體外低氧條件下分離和擴增MSC，如在椎間盤的NP區域中發生的一樣。進行移植的MSC可用刺激IVD癒合所需的一種或多種軟骨分化和維持因子進行轉染或可用包含此類軟骨分化和維持因子(例如CD-RAP或其活性片段)的軟骨形成誘導培養基進行刺激。優選，可通過編碼此類軟骨分化和維持因子如⑶-RAP蛋白或其活性片段的表達載體進行轉染。可通過注射例如胰島素微量注射器(Sakai等人，2005)或另一種施用裝置將優選包埋在生物材料例如膠原、去端肽膠原凝膠、藻酸鹽、褐藻酸丙二醇酯、羧甲基纖維素或羥乙基澱粉中的已轉染的和/或已刺激的MSC或培養的MSC移植入退變性椎間盤。細胞密度可以是例如IxlO4個細胞/ml至IxlO7個細胞/ml，優選IxlO5個細胞/ml至IxlO6個細胞/ml。還可在軟骨分化和維持因子單獨或與其他形態發生素或生長因子如TGF-β成員和/或BMP(例如ΒΜΡ-2)—起存在的情況下將MSC培養在藻酸鹽、小丸(pellet)、微團或聚集的細胞培養物中，所述形態發生素或生長因子支持此類細胞分化成NP樣細胞。·在一個實施方案中，遞送系統包含MSC或AF細胞與3-D多孔絲支架。多孔絲支架可來源於從家蠶提取的絲心蛋白。細胞可在未分化的情況下進行擴增和可通過用軟骨分化和維持因子培養來將其誘導成軟骨細胞。可將MSC或AF細胞直接接種於絲支架或接種於裝載有軟骨分化和維持因子的絲支架，並且可培養在補充或未補充單獨的或與上述其他因子一起的軟骨分化和維持因子的培養基中。來自家蠶蠶繭的絲心蛋白支架可以如Sofia等人和Karageorgiou等人(Sofia等人，2001;Karageorgiou和Kaplan,2005)中所述進行提取。在一個實施方案中，可用至少一種軟骨分化和維持因子的基因離體轉染AF、NP或MSC細胞以提供刺激IVD癒合所需的細胞和蛋白質，然後在於例如單層培養物、藻酸鹽珠粒或三維生物可降解支架材料中培養或不培養的情況下將其再植入被靶向的宿主組織。例如，以單層的形式接種分離的NP細胞，然後使用轉染劑例如FuGene6試劑，用例如包含軟骨分化和維持因子的表達載體或病毒基因治療載體例如腺病毒或腺相關病毒(AAV)進行轉染。在數天的培養(例如，7天)後，將細胞傳代和封裝在藻酸鹽中，例如優選大約O.5至2%的藻酸鹽中。基因的表達可通過標準方法例如RT-PCR或ELISA來分析。可將藻酸鹽珠粒中的此類轉染的髓核細胞用於IVD的組織工程和用於退變性椎間盤疾病的治療。其他的基因療法描述於例如Wells,2004;Paul等人，2003和Sobajima等人，2004中。在一個實施方案中，使用例如編碼刺激IVD癒合所需的軟骨分化和維持因子的重組猿猴病毒40腺病毒載體或杆狀病毒載體暫時永生化細胞例如優選人來源的NF細胞、MSC或自體軟骨細胞。在另一個實施方案中，可用攜帶外源因子例如軟骨分化和維持因子的腺病毒載體轉染退變性人IVD細胞(例如NP細胞)。然後，隨後的步驟是將這些經修飾的細胞注射回患病的IVD。本發明還涉及本發明的軟骨分化和維持因子在培養用於製備藥物組合物的間充質幹細胞中的用途，所述藥物組合物用於治療需要該治療的哺乳動物特別是人中的脊柱病症。本發明通過附圖和實施例進一步說明。圖I舉例說明了包含CD-RAP的脂質體配製劑在數天中的穩定性(三角形)。按照實施例3測定脂質體配製劑的穩定性。上面的曲線(正方形)顯示⑶-RAP在37°C下在緩衝液中的穩定性，從而測定蛋白質在這些條件下的穩定性。圖2顯示在37°C下24小時後50μgCD-RAP在血纖蛋白凝塊(fibrinclot)系統中的固定作用。A:Tachotop,14mm的直徑，4mm的高度，來自Nycomed;B:豬I型膠原海綿，BiomUp;C:再水化的Hyalofi11-F。圖3舉例說明與未加入⑶-RAP和BMP-2的陰性對照相比，在用⑶-RAP(100ng/ml)刺激後，培養的兔IVD細胞的百分比(%)蛋白聚糖(GAG)誘導(n=3)。實施例實施例I:纖維環穿刺模型在本實施例中，在兔纖維環穿刺模型中，CD-RAP的注射有效地部分恢復椎間盤高度。可使用確定的針規通過椎間盤的纖維環的穿刺來在青少年期的紐西蘭白兔(NewZealandWhiteRabbit)中誘導椎間盤退變(Singh等人，2005)。在通過向椎間盤的背部區域注射利多卡因提供局部麻醉後，獲得側平面射線照片以測定IVD高度的注射前基線值。然後將兔置於側伏臥位，並且使用後外側腹膜後手術(posterolateralretroperitonealapproach)暴露腰IVD。在每一隻兔中，使用18G針對AF穿刺。在4、8和10周後，動物接受緩衝鹽溶液(磷酸精氨酸或PBS)或媒介物脂質體(作為對照)或2.5mg/ml至10mg/mlCD-RAP(於PBS中)的蛋白質溶液或脂質體封裝的CD/RAP(2.5mg/ml)至髓核的注射。然後觀察動物8或12周(誘導和治療期)。臨床前結果通過腰脊骨的磁共振成像(MRI)掃描來分析，使用成像軟體通過用定製程序測量的放射學觀察來監測IVD高度，並計算％DHI(手術後DHI/手術前DHIxlOO)。關於IVD的組織學分析，切片用蘇木精伊紅和番紅O染色。通過使用單因素方差分析法(one-wayanalysisofvariance)(ANOVA)分析組間差異的統計顯著性。椎間盤退變治療的可選的緩慢進行性和重現性動物模型是如Sobajima等人(Sobajima等人，2005)中所描述的Lipson和Muir的經典「刺傷模型」。關於刺傷方法，可在紐西蘭白兔的AF中產生切口。對於每一隻兔，將用⑶-RAP處理一個椎間盤，用鹽溶液或媒介物處理另一個椎間盤。纖維環針穿刺模型導致椎間盤在12周的觀察期中變窄。鹽溶液處理的椎間盤展示椎間盤的大面積退變。然而，%DHI顯示與注射鹽溶液或媒介物的椎間盤相比，CD-RAP組具有保持椎間盤高度的傾向。組織學分析顯示與對照組相比，蛋白聚糖合成和抗退變性變化的保護增加。實施例2:包含⑶/RAP的脂質體的製備為了製備持續的脂質體製劑，將750mg磷脂醯膽鹼和250mg膽固醇在圓底燒瓶中溶解於20ml乙醇中。在旋轉式蒸發器中定量除去溶劑。通過在室溫下溫和攪拌，使產生的薄脂質膜在IOml水中再水化，從而獲得脂質體(10%(w/v)脂質)。通過隨後的超聲處理製備直徑大約IOOnm的單層囊泡(SUV)。將300μISUV與250μICD-RAP溶液(3mg/ml於420mM/lArg/P04pH7.5中)混合，然後進行凍幹。在即將使用乾燥的重構囊泡之前通過用蒸餾水重構Iyocake來產生封裝蛋白質的多層脂質體(MLV)。該再水化導致大約50%或更大的至MLV(具有大約I.5μm或更大的平均直徑)中的捕獲效率而無被捕獲的藥物的化學變化。實施例3:包含⑶-RAP的脂質體配製劑的穩定性本實施例舉例說明包含CD-RAP的脂質體配製劑在數天內的穩定性。如下測定脂質體配製劑的穩定性如上所述將120μg⑶-RAP封裝在300μI脂質體懸浮液中。將100μI的等分用300μI雙蒸水稀釋，然後通過在ieooorcf下離心15分鐘來對其進行分離。為了測定封裝效率，使用標準曲線，通過RP-HPLC定量未封裝的CD-RAP。重懸浮和離心步驟的6次重複未顯不涵^尚CD-RAP增加。通過在7天的時間內測量通過離心(在16000rcf下進行15分鐘)分離的上清液中CD-RAP的游離濃度來描述釋放。在各時間點上，使用標準曲線通過RP-HPLC測量游離CD-RAP的量。圖I中顯示的結果顯示高於50%的高封裝效率(時間第O天)。在隨後於37°C下長達7天的觀察期中，獲得保持大約45%的封裝的平臺，從而指示重構的包含CD-RAP的脂質體的穩定性。實施例4:固定⑶-RAP的植入物本實施例舉例說明在基於膠原或透明質酸的支架中的固定CD-RAP的植入物。將50ygCD-RAP配製於125μI20mMKH2PO4U50mMKC1、KOH、pH7.5,0.01%Tween80中。使溶液滲入膠原海綿(A:Tachotop(A)，14mm直徑，4mm高度，來自Nycomed;⑶豬I型膠原海綿，BiomUp);或與500μIHyaff凝膠(再水化的Hyalofill-F(C)，30mg於0.5ml雙蒸水中，3h，5°C)混合以吸附CD-RAP。隨後通過冷凍乾燥除去水。為了測定吸附至膠原或Hyaff上的⑶-RAP的固定動力學，將⑶-RAP浸透的樣品固定在500μI牛血纖蛋白凝塊(4.9mg血纖蛋白原、0.3U凝血酶於50mM檸檬酸鈉、150mM氯化鈉、IOmM氯化I丐,pH6.4中)中，如由Meyenburg等人(Meyenburg等人，2000)所述。然後用2ml接受體培養基(acceptormedium)(磷酸鹽緩衝液，0.02%Tween80)完全覆蓋凝塊。使用標準曲線，通過RP-HPLC在24小時後定量游離⑶-RAP的量。圖2中顯示的結果顯示不同生物材料的固定功效的差異，材料A和C顯示對重組⑶-RAP蛋白的強結合性質。這些結合性質可用於軟骨決定和維持因子在缺陷部位例如退變的椎間盤中的局部靶向和保留，從而避免CD-RAP的高起始發生並在再生部位提供長期的維持。實施例5:人和動物椎間盤細胞的分離本實施例舉例說明製備IVD細胞的方法，所述IVD細胞用於分析CD-RAP對細胞外基質組分(其對於軟骨細胞的刺激和CD-RAP的合成代謝活性是特異性的)的產生的影響。人椎間盤細胞可從通過在患有退變性椎間盤疾病的患者的治療中進行的間盤切除術回收的人椎間盤組織分離。樣品(髓核或纖維環)用PBS漂洗以除去殘留的血液或細胞外基質。在組織切碎後，使用膠原酶溶液(0.5mg/ml於PBS中)在37°C下進行45分鐘以從細胞外基質釋放細胞,然後可通過離心分離細胞(參見Klagsburn,"MethodsinEnzymology",第VII卷)。在除去上清液後,將收穫的細胞在6孔板上培養於具有或不具有胎牛血清的Eagle最小必需培養基中。來自動物組織的牛IVD細胞通過連續酶促消化來分離。在增溼的大氣中於37°C，5%C02下培養細胞(每天更換補充有10%胎牛血清、25μg/ml抗壞血酸、360μg/mlL-穀氨醯胺和50μg/ml慶大黴素的DMEM/F12培養基)直至它們達到大約80%的匯合。來自動物組織的兔IVD細胞通過連續的酶促消化來分離。在增溼的大氣中於37°C，5%C02下在補充有10%FCS、1%青黴素/鏈黴抗生物素蛋白和50ng/ml抗壞血酸的DMEM培養基中培養細胞直至它們達到大約90%的匯合。此後，將它們傳代，再培養另外7天。實施例6:椎間盤細胞在藻酸鹽珠粒中的培養通過將60μII.2%的藻酸鹽(於O.15NaCl中)和實施例5中的IVD細胞一起快速遞送至102mmol/L氯化I丐溶液中形成半固體珠粒來形成藻酸鹽珠粒。清洗珠粒兩次,將其置於具有Iml培養基的12孔板中(Aota等人，2005)。所得的藻酸鹽珠粒可用於分析在加入或不加入CD-RAP的情況下，纖連蛋白片段(120kDa片段(Chemicon，Cat.No.F1904),來自人血漿的70kDa的纖連蛋白的蛋白水解片段(Sigma，Cat.No.F0287))對蛋白聚糖合成和聚集蛋白聚糖表達的影響。實施例7:CD_RAP介導的IVD細胞中聚集蛋白聚糖和蛋白聚糖合成的誘導本實施例舉例說明脊柱植入物用於證明⑶-RAP(當加入至IVD細胞時)在培養期間顯著增加IVD細胞的蛋白聚糖合成和聚集蛋白聚糖的表達的用途。在第7天，將實施例5的IVD細胞置於24孔板中以研究蛋白聚糖合成和聚集蛋白聚糖的表達。將細胞在含有0.5μΜ和O.IyM的70kDa的纖連蛋白片段(F0297Sigma)的無血清培養基中再培養7天。為了分析CD-RAP對蛋白聚糖合成和聚集蛋白聚糖的表達的影響，在用纖連蛋白培養後2天加入不同濃度的⑶-RAP(I、5、10、20ug/ml)。7天後，通過Lightcycler分析(SybrGreen)分析聚集蛋白聚糖的表達。為了從珠粒釋放細胞，將珠粒溶解在含有55mmol/L檸檬酸鈉、30mmol/LNa2EDTA,O.15M氯化鈉pH6.8的緩衝液中。清洗細胞沉澱並將其重懸浮於裂解緩衝液中以進行RNA提取(Qiagen)。使用RNeasyMiniKit(Qiagen)進行RNA分離。按照Invitrogen的SuperscriptIIRT試劑盒的說明書進行⑶NA合成。β-肌動蛋白用作對照。用於擴增的引物如下a)牛β_肌動蛋白引物5'GGAAATCGTCCGTGACATCAA3';5/AAGGAAGGCTGGAAGAGAGC3';聚集蛋白聚糖引物是5'AAGAGAGCCAMCAGCCGA3';5/CTGGTAGTCCTGGGCATTGT3'。按照Farndale等人(Farndale等人，1982)中描述的方法，使用二甲基亞甲藍(DMMB)比色測定法測量蛋白聚糖合成。可使用離心過濾裝置(centriconfilter)以5000rev/分鐘進行10至20分鐘來濃縮培養基。GAG含量可通過將20μI濃縮的或稀釋的培養基與200μIDMMB溶液混合，然後測量525-530nm處的光密度來測定。為進行標準化，可使用硫酸軟骨素(硫酸軟骨素A94%,牛氣管，ICN)。計算每微克DNA或細胞數目的所有測量值的平均值。實施例8:兔椎間盤細胞中蛋白聚糖的誘導當按照實施例5分離的兔IVD細胞達到90%匯合時，將細胞置於6孔板中以研究蛋白聚糖合成。將細胞再培養5天。為了分析CD-RAP對蛋白聚糖合成的影響，將培養基改變成1%FCS，並且將BMP-2(100ng/ml)單獨地或與CD-RAP(100ng/ml)—起加入至培養物。5天後，使用實施例7中描述的二甲基亞甲藍(DMMB)比色測定法在細胞培養上清液中測量蛋白聚糖的合成。3個獨立實驗的GAG剌激的結果總結於圖3中。這些數據表明向經BMP-2剌激的IVD細胞中加入CD-RAP在培養的兔IVD細胞中導致GAG增加。本文中公開的所有參考文獻明確地以它們的全文通過引用合併入本文。儘管已舉例說明和描述了優選實施方案，但應當理解，可根據本領域普通技術進行改變而不在其由權利要求界定的更廣泛的方面背離本發明。文獻目錄Aota,Y.，An，H.S.，Homandberg,G.，Thonar，E.J.，Andersson,G.B.，Pichika,R.，andMasuda，K.(2005).Differentialeffectsoffibronectinfragmentonproteoglycanmetabolismbyintervertebraldisccellsacomparisonwitharticularchondrocytes.Spine30，722-728.Bauer,R.，Humphries，M.，Fassler,R.，Winklmeier,A.，Craig,S.E.，andBosserhoff,A.K.(2006).RegulationofintegrinactivitybyMIA.JBiolChem281,11669-11677.Bosserhoff,A.K.andBuettner,R.(2003)·EstablishingtheproteinMIA(melanomainhibitoryactivity)asamarkerforchondrocytedifferentiation.Biomaterials24，3229-3234.Bosserhoff,A.K.，Kondo，S.，Moser,M.，Dietz,U.H.，Copeland，N.G.，Gilbert,D.J.，Jenkins，N.A.，Buettner,R.，andSandelI,LJ.(1997).MouseCD-RAP/MIAgene!structure，chromosomallocalization,andexpressionincartilageandchondrosarcoma.Dev.Dyn.208，516-525.Bosserhoff，A.K.，Moser,M.，andBuettner,R.(2004).CharacterizationandexpressionpatternofthenovelMIAhomologTANGO.GeneExpr.Patterns.4,473-479.Dietz,U.H.andSandelI,L.J.(1996).Cloningofaretinoicacid-sensitivemRNAexpressedincartilageandduringchondrogenesis.J.Biol.Chem.271，3311-3316.Farndale,R.W.，Sayers,C.A.，andBarrett,A.J.(1982)·AdirectspectrophotometricmicroassayforsuIfatedglycosaminoglyeansinc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caffold.Artif.Organs29，806-814。權利要求1.包含軟骨分化和維持因子的脊柱髓核植入物或配製劑，所述軟骨分化和維持因子為非抗體或非受體分子。2.權利要求I的脊柱髓核植入物或配製劑，其中所述植入物是經椎間盤可注射的或可植入的。3.權利要求I或2的脊柱髓核植入物或配製劑，其中所述軟骨分化和維持因子是軟骨形成形態發生素。4.權利要求I至3的任一項的脊柱髓核植入物或配製劑，其中所述軟骨分化和維持因子具有用於軟骨再生的合成代謝活性。5.權利要求I至4的任一項的脊柱髓核植入物或配製劑，其中所述軟骨分化和維持因子是MIA(黑色素瘤抑制活性)家族的成員。6.權利要求I至5的任一項的脊柱髓核植入物或配製劑，其中所述軟骨分化和維持因子選自a)包含根據SeqIDNo.I的⑶-RAP的成熟序列的軟骨細胞蛋白或其具有至少20個胺基酸的連續序列，b)與⑶-RAP的C端4個半胱氨酸骨架，Seq.IDNo.I的胺基酸12至107，具有至少70%的胺基酸序列同源性的蛋白質，或c)具有根據SeqIDNo2、3和4的通式序列I至3中的任一個的蛋白質。7.權利要求I至6的任一項的脊柱髓核植入物或配製劑，其中所述植入物或配製劑包含載體。8.權利要求I至7的任一項的脊柱髓核植入物或配製劑，其中所述植入物或配製劑包括持續釋放裝置。9.權利要求I至8的任一項的脊柱髓核植入物或配製劑，其中所述軟骨分化和維持因子封裝在脂質體中。10.權利要求I至9的任一項的脊柱髓核植入物或配製劑，其中所述脊柱髓核植入物包含髓核組織或細胞。11.其為非抗體或非受體分子的軟骨分化和維持因子在製備用於治療脊柱病症的藥物組合物中的用途。12.權利要求11的用途，其中所述軟骨分化和維持因子如權利要求3至6的任一項中所定義。13.權利要求11或12的用途，其中所述脊柱病症是特發性腰痛、椎間盤脫出、椎間盤內破裂或裂縫的椎間盤、神經根病、椎管狹窄、脫出的髓核-誘導的坐骨神經痛、坐骨神經痛、特發性脊柱側凸或脊髓病。14.權利要求11至13的任一項的用途，其中所述藥物組合物具有權利要求7至10的任一項中所定義的特徵。15.用於治療哺乳動物的脊柱病症的方法，該方法包括對需要該治療的哺乳動物施用有效劑量的軟骨分化和維持因子，所述軟骨分化和維持因子為非抗體或非受體分子。全文摘要本發明涉及用於治療椎間盤的脊柱髓核植入物和因此特別地涉及CD-RAP蛋白的用途。文檔編號A61K38/18GK102940878SQ20121045570公開日2013年2月27日申請日期2007年10月5日優先權日2006年10月6日發明者C·東尼,K·海勒布蘭迪,E·哈斯特爾特,S·皮皮戈,R·希格爾申請人:Scil技術股份有限公司