一種精密度好線性相關性強的肌鈣蛋白檢測試劑盒的製作方法
2023-08-04 16:24:01 1
一種精密度好線性相關性強的肌鈣蛋白檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種精密度好線性相關性強的肌鈣蛋白檢測試劑盒，包括體積比為3:1的試劑R1和試劑R2，其組分分別為：試劑R1由PIPES(哌嗪-N，N-雙(2-乙磺酸))緩衝液、聚乙二醇、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉試劑、乙醇胺組成；試劑R2由PIPES緩衝液、結合有肌鈣蛋白單克隆抗體的微球顆粒、吐溫-20、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白組成；本發明提供的檢測試劑盒靈敏度和線性相關性要優於現有的檢測試劑盒。
【專利說明】一種精密度好線性相關性強的肌鈣蛋白檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種精密度好線性相關性強的肌鈣蛋白檢測試劑盒，屬體外診斷【技術領域】。
【背景技術】
[0002]肌鈣蛋白是調節橫紋肌和心肌收縮相關的結構蛋白。肌鈣蛋白由肌鈣蛋白T(TnT)、肌鈣蛋白I (TnI)及肌鈣蛋白C(TnC)三種亞單位所組成。其中，TnI是肌原纖維AFP酶的抑制性亞單位，分子量18kD。肌鈣蛋白I包繞著TnC的中央螺旋，成為Ca2+結合位點的組成部分。三種亞單位組合與原肌球蛋白一起構成複合體，調節肌細胞的收縮力和速度。心肌I丐蛋白I (cardiactroponinl, CTnI)是惟一的不同於骨骼肌中發現的肌I丐蛋白I。心肌鈣蛋白I在N端具有一個附加的31個胺基酸順序，使CTnI具有心肌的特異性，因而被廣泛地研究作為心肌損傷的敏感的和特異的血清標誌物。
急性心肌梗死病人CTn動態變化曲線和CK-MB很相近,急性心肌梗死後4?8h在血清中高於決定值，出現晚於肌紅蛋白，但其升高持續時間(窗口期)長，CTn 一旦升高往往持續4?1d,甚至可達3周。和CK-MB比較，正常人血清中幾乎測不到CTn，因而它對急性心肌梗死有較高的分辨能力。CTn是心肌特有的，具有在血中出現時間早、敏感度高、特異性強和診斷窗口期長等特點，是診斷急性心肌梗死的理想指標。此外，CTnT還可用於評估溶栓療法的成功與否，觀察冠狀動脈是否復通，研究表明，用CTnT評估復通90min時優於CK-MB和肌紅蛋白，如果結合其他診斷AMI指標，如12導聯心電圖的S-T段變化，效果更好。
目前已知的測定肌鈣蛋白的方法有電化學發光免疫檢測法(ECLIA)、酶聯免疫法吸收法、酶聯螢光分析法(ELFA)，但由於具有操作繁瑣、耗時長、過度浪費資源的缺點，不適於常規檢驗。目前比較常用的是膠體金免疫層析法，但此方法敏感性不好，重複性不好，只能用於定性檢測，對於臨床病人的療效觀察有局限性。膠乳顆粒增強比濁法是目前較準確，穩定的檢測方法。其原理是當交聯有抗體的微球與抗原反應凝集時，改變反應液的透光性能，但也存在著靈敏度不高的問題。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種乳膠包被的肌鈣蛋白檢測試劑盒。該試劑盒應用於全自動生化分析儀上，結果準確性強，靈敏度較高便於大規模推廣。
[0004]為實現上述目的，本發明提供的試劑盒包括體積比為3:1的試劑Rl和試劑R2，其組分分別為:
試劑Rl:
PIPES (哌嗪-N，N-雙(2-乙磺酸))緩衝液聚乙二醇200-220mmol/L
疊氮鈉5-10 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉試劑 1-5 mmol/L 乙醇胺 2-3 mmol/L ；
試劑R2:
PIPES緩衝液
結合有肌鈣蛋白單克隆抗體的微球顆粒 200-220mmol/L 吐溫-205%
疊氮鈉l-5mmol/
乙二胺四乙酸鈉0.5-3 mmol/L
牛血清白蛋白l_5mmol/L。
[0005]本試劑盒的製備方法及操作步驟如下:
(a)按下列比例配製好試劑
試劑 Rl:PIPES 緩衝液、200-220mmol/L 聚乙二醇、5-10 mmol/L 疊氮鈉、1-5 mmol/L 乙二胺四乙酸鈉、2-3 mmol/L乙醇胺；
試劑R2 =PIPES緩衝液，200-220mmol/L結合有肌鈣蛋白單克隆抗體的微球5% (v/v)吐溫-20、l_5mmol/L疊氮鈉、0.5-3 mmol/L乙二胺四乙酸鈉、l_5mmol/L牛血清白蛋白。
[0006](b)將Rl、R2試劑與待測樣本按一定比例混合；
(c)用全自動生化分析儀500nm條件下測定吸光度的變化；
Cd)根據吸光度變化值計算出樣本中肌鈣蛋白的濃度。
[0007]其中，所述結合有肌鈣蛋白單克隆抗體的微球顆粒採用如下製備方法製備而成:配製 PH 值為 5.0 和 6.8 的 50mM 的 MES 緩衝溶液、150mg/mlNHS、50mg/ml EDAC，其中，PH 值為 5.0 的 50mM MES 緩衝液:150nml0% 的微球:NHS: EDAC 為 70:10:15: 5，40°C恆溫振蕩器上活化40min, 15000rps離心15min,去掉上清液,收集離心沉澱。加入PH值為6.8的MES,使用水浴超聲儀超聲2min，離心，洗滌3次後，加入肌鈣蛋白抗體200ul，在振蕩器上偶聯1.5h，離心洗滌加入10%的封閉液100rpm搖床上封閉過夜。
[0008]全自動生化儀參數設置
(a)檢測溫度:37°C
(b)檢測波長:主波長為500nm;副波長設為O ;
(c)反應時間:10分鐘。其中，孵育時間3分鐘，反應時間100秒，檢測時間200秒。
[0009]3.檢測步驟
1.樣品(檢測的樣品包括蒸餾水、標準品和臨床樣本)加試劑I混勻，37°C孵育5 min後讀取吸光度A0，立即加入試劑2混勻，37°C反應5 min後，在500nm條件下檢測，讀取吸光度Al，ΔΑ = Al-AO0其中樣本用量6 μ?，試劑I用量225 μ?，試劑2用量75 μ?。
[0010]通過讀取的吸光度值計算出肌鈣蛋白的濃度。
[0011]本發明提供的檢測試劑盒，靈敏度高，相關性好。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為本發明線性關係圖。
【具體實施方式】
[0013]下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0014]實施例1 試劑Rl:
PIPES (哌嗪-N，N-雙(2-乙磺酸))緩衝液聚乙二醇200mmol/L
疊氮鈉8 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉試劑 4 mmol/L 乙醇胺 2 mmol/L ；
試劑R2:
PIPES緩衝液
結合有肌?丐蛋白單克隆抗體的微球顆粒 200mmol/L 吐溫-205%
疊氮鈉3mmol/
乙二胺四乙酸鈉2 mmol/L
牛血清白蛋白3mmol/L。
[0015]採用全自動生化分析儀500nm條件下測定吸光度的變化:
全自動生化儀參數設置:
(a)檢測溫度:37°C
(b)檢測波長:主波長為500nm;副波長設為O ;
(c)反應時間:10分鐘。其中，孵育時間3分鐘，反應時間100秒，檢測時間200秒。
[0016]檢測步驟
樣品(檢測的樣品包括蒸餾水、標準品和臨床樣本)加試劑I混勻，37°c孵育5 min後讀取吸光度A0，立即加入試劑2混勻，37°C反應5 min後，在500nm條件下檢測，讀取吸光度Al，ΔΑ = Al-AO0其中樣本用量6 μL，試劑I用量225 μL，試劑2用量75 μL。
[0017]通過讀取的吸光度值計算出肌鈣蛋白的濃度。
[0018]實驗結果及分析
1、重複性實驗以產品標準要求選擇濃度為4.86ug /mL的定值樣本作為實驗樣本，用膠乳增強免疫透射比濁法先對此樣本重複測定20次，計算出均值、標準差和變異係數等相關數據見表1，為本發明試劑檢測結果；表2為對照試劑(北京九強生物技術有限公司提供)檢測結果.經兩表的對照顯示，本發明試劑的重複性優於市場上的對比試劑。
[0019]
表1本試劑重複性數據
【權利要求】
1.一種精密度好線性相關性強的肌鈣蛋白檢測試劑盒，其特徵在於，包括體積比為3:1的試劑Rl和試劑R2，其組分分別為: 試劑Rl: PIPES (哌嗪-N，N-雙(2-乙磺酸))緩衝液 聚乙二醇200-220mmol/L 疊氮鈉5-10 mmol/L 乙二胺四乙酸鈉試劑 1-5 mmol/L 乙醇胺 2-3 mmol /I, 試劑R2: PIPES緩衝液 結合有肌鈣蛋白單克隆抗體的微球顆粒 200-220mmol/L 吐溫-205% 疊氮鈉l-5mmol/ 乙二胺四乙酸鈉0.5-3 mmol/L 牛血清白蛋白l-5mmol/L ; 所述結合有肌鈣蛋白單克隆抗體的微球顆粒採用如下製備方法製備而成: 配製 PH 值為 5.0 和 6.8 的 50mM 的 MES 緩衝溶液、150mg/mlNHS、50mg/ml EDAC，其中，PH 值為 5.0 的 50mM MES 緩衝液:150nml0% 的微球:NHS: EDAC 為 70:10:15: 5，40°C恆溫振蕩器上活化40min，15000rps離心15min，去掉上清液，收集離心沉澱；加入PH值為6.8的MES,使用水浴超聲儀超聲2min，離心，洗滌3次後，加入肌鈣蛋白抗體200ul，在振蕩器上偶聯1.5h，離心洗滌加入10%的封閉液100rpm搖床上封閉過夜。
【文檔編號】G01N21/31GK104181303SQ201410417576
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月22日 優先權日:2014年8月22日
【發明者】甘宜梧, 葉麗華, 譚柏清, 李靜, 王綺 申請人:山東博科生物產業有限公司