一種培養篩選微生物菌種的方法

2023-08-04 18:36:31 1

專利名稱：一種培養篩選微生物菌種的方法
技術領域：
本發明涉及微生物菌種的篩選方法，具體是對極端環境樣品中微生物菌 種的篩選分離培養方法。
技術背景微生物特別是極端環境(如酸/鹼/溫/冷/鹽樣品、深海樣品、火山口樣品、 高海拔樣品、太空樣品等)中的微生物，在自然生物、地球化學循環等方面 扮演著極為重要的角色。研究極端環境微生物不僅有助於我們了解和認識生 命起源與生命進化，極端環境的耐受機制以及其與環境之間的相互作用等； 而且其基因資源、酶資源及其代謝產物資源產業被稱為21世紀可持續發展的 朝陽產業。微生物菌種資源，特別是具有特殊價值的菌種資源的爭奪已成為 當今國際生物資源爭奪的一個重要組成部分。微生物種類繁多、分布極為廣泛，但目前受技術的限制，超過99%的微 生物是未知的，或在當前認識水平或試驗條件下是"不可培養的"。為此，研究 建立新的微生物培養與選育方法，突破傳統微生物培養方法的制約，以獲得 更多的微生物的種類，是當今微生物工作者迫切需要解決的問題。近年來， 微生物分子生態學技術、宏基因組技術、生物信息技術、地球化學物質循環 分析相關技術及多學科強交叉學科平臺的形成等，這些為建立新的微生物培 養與選育方法提供了強力的支持。發明內容本發明的目的是提供一種從各類樣品中篩選所含微生物菌種的方法，即 通過建立樣品中各類微生物的個性化富集培養體系，來富集分離樣品中的微 生物菌種。本發明微生物菌種培養篩選方法的詳細技術方案包括以下步驟1) 樣品處理及DNA抽提溶解洗滌樣品，收集菌體顆粒物質，去雜質， 收集沉澱物；酚一氯仿一異戊醇抽提沉澱物中的DNA;2) PCR擴增，克隆、酶切、測序及序列分析，檢測樣品中微生物種類多 樣性分別採用細菌、古細菌和真菌通用引物擴增DNA抽提物，擴增產物經 凝膠電泳檢測後用凝膠回收試劑盒純化，純化產物連接克隆後通過藍白篩選陽性克隆子；再對陽性克隆子進行克隆序列的擴增，擴增產物經酶切電泳後 初步判斷樣品中所含微生物的種類數；對各種類進行測序分析，獲知樣品中 的微生物種類、豐度、生物多樣性和分布規律；3)微生物菌種的個性化富集培養用掃描電鏡分析樣品的表面形態結構； 用能譜儀、X-射線採集樣品礦物元素的成份及其有機物種類的信息；採集樣 品所在的環境信息，包括溫度、酸鹼度、鹽度等；通過序列比對分析，初步 判斷各類微生物的種屬及生長特徵情況，參照已有的該類微生物的相關信息； 對於新種則參照與之在系統發育樹中親緣關係最近的微生物的生長環境特點 等信息；根據上述信息建立個性化富集培養體系；應用個性化富集培養體系 富集各類微生物，分離純化各富集分離物，獲得純培養物。在本發明的步驟l)中，抽提沉澱物中的DNA的步驟具體為① 向沉澱物中加入高濃度細胞裂解液，充分混勻，放入沸水浴中8 15min;② 55 65。C水浴30min以上；③ 隨後72。C水浴30min以上；④ 加入酚/氯仿/異戊醇混和液，混勻，在室溫下靜置10min左右，離心， 將上清液用酚/氯仿/異戊醇重複抽提，收集上清液；⑤ 上清液用-20。C 4。C的無水乙醇沉澱，沉澱溫度為4°C ，沉澱時間30 min 以上，離心收集沉澱；⑥ 用濃度為70%的乙醇洗滌沉澱物兩次；⑦ 沉澱物置於室溫或真空乾燥，用TE或無菌去離子水溶解沉澱，即得到 基因組DNA提取液。上述細胞裂解液包括以下各組分0.10 0.3Omol/L的EDTA; 0.005 0.15mol/L的Tris'HCl; 0.10 0.3Omol/L的NaCl水溶液；質量百分濃度為2°/。
7.5%的SDS;質量百分比濃度為0.30% 0.75%的CTAB。本發明區別於傳統的選擇性篩選培養、富集培養等方法，其優點是先用 分子生態相關技術檢測樣品中所含微生物的種類、豐度等特徵信息；再根據 各種屬的生長代謝特徵、該菌所在樣品的生長環境特點(如溫度、酸鹼度、 鹽度和物質組成等)等系列信息建立分別適合各微生物生長的個性化富集培 養體系，有的放矢的富集與選育樣品中特定的微生物。採用該方法能使得更 多的"不能培養的微生斷'變成可培養的。本方法克服了在分離培養樣品中微生 物種類的過程中，存在的效率低、損失新種的概率大、樣品耗量大、隨機性與盲目性程度高等問題，針對各類樣品特別是珍稀樣品，能分離培養出更多 的微生物種類，從而提高了從樣品培養和選育微生物的產率和種類數。


圖l:實施例中沉積物礦物元素的能譜圖；圖2:菌株DS-0205的光學顯微圖xi000;圖3:菌株DS-0205的SEM圖20KVx5500;圖4:菌株DS-0205的TEM圖100KV x46800;圖5:菌株DS-0205的莢膜染色圖；圖6:菌株DS-0205固體培養7天後的菌落形態；具體實施方式
下面結合附圖，以富集分離深海沉積樣品中微生物進一步詳述本發明的 具體實施(一)樣品中總基因組的抽提(1) 在無菌條件下，稱取深海沉積樣品3g並移入體積為50ml的無菌帶蓋 的離心管中，加30ml無菌人工海水基本鹽，充分振蕩後置於搖床上以180rpm 速率勻速搖10-20 min，然後3000rpm離心3min，上清液轉移到新的離心管 中；沉澱再重複洗滌兩次，均收集上清液，沉澱保存備用。(2) 上清液，以12000rpm離心15min，收集沉澱。(3) 往沉澱中加入20ml滅菌磷酸鹽緩衝液，充分振蕩後置於搖床上以 180rpm速率勻速搖10min，以12000rpm離心15min，收集沉澱。(4) 重複步驟(3)兩次。沉澱即為實驗樣品。顯微鏡下初步觀察樣品中微生 物的形態。(5) 把樣品完全轉移到5ml離心管中，加入高濃度細胞裂解液的配置(總 體積100ml)為Tris HCl(pH8.0， lmol/L) 12.5ml; EDTA(pH8.0, 0.5mol/L)， 50ml; 5ml濃度為5mol/L的NaCl溶液；25ml質量百分比濃度為20%的SDS; 7.5ml質量百分比濃度為10。/。的CTAB。充分振蕩10min，立即放入沸水浴中 並開始計時8 15min。如果樣品中以革蘭氏陰性菌居多時，則沸水浴時間控 制在10min以內；如果樣品中主要以革蘭氏陽性菌或細胞壁外有莢膜或多糖 或胞外吸附眾多的顆粒物的微生物居中多時，沸水浴時間最好控制在10 15min,每隔2 3min輕輕翻轉離心管5 8次。(6) 接著轉入55 65。C水浴中水浴lh，每隔15min輕輕翻轉離心管5 8次。(7) 隨後轉入72。C水浴中水浴lh，每隔15min輕輕翻轉離心管5 8次。(8) 向離心管中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(V/V/V: 25: 24: 1)，上下 輕輕倒轉離心管15min後，隨後室溫靜置10min，接著12000rpm離心5min， 輕輕收集上清液並轉入到新的離心管中。(9) 重複步驟(8)—次。柳往離心管中加入2.5倍體積的-20'C冷凍的無水乙醇，上下輕輕倒轉離 心管10次後，置於4'C冰箱中沉澱至少lh。沉澱完畢後12000rpm離心15min，收集沉澱。(11)向載有沉澱的離心管中加入2ml70。/。的乙醇，輕輕倒轉溶液8次後靜 置15min,隨後12000rpm離心15min，棄上清，收集沉澱。 肪重複步驟(ll)一次。(13)沉澱物置於室溫或真空乾燥後，加適量TE或無菌雙蒸水溶解沉澱， 即為基因組DNA提取液，4'C保存備用。(二) PCR擴增，克隆、酶切、測序及序列分析分別用細菌、古細菌與真菌的16SrDNA、 16SrDNA和18SrDNA通用引 物擴增從樣品中獲得的總基因組DNA。選用的細菌16SrDNA通用引物為 (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAGA-3'， 5'-GTTACCTTGTTACGACTT-3');選 用的古細菌16SrDNA通用引物為5'-TTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3'， 5'-CTTTCGGTCGCCCCTACT-3'; 選用的真菌 18SrDNA通用引物 為:5 '-ACCTGGTTGAT CCTG C國3'， 5 '國TGATCCTTCYGCAGGTTCAC陽3'。下面以真菌的擴增為例在50jxlPCR反應體系組成5pl的10xPCRbuffer， 3^1的2.5mMMgCl2， 的0.2mMDntp，每一條引物l(J， 4^1的DNA樣品， 1^1的2.5單位的Taq polymerase, 34^1的ddH20。 PCR擴增步驟95。C4min; (94。C60s， 60。C90s， 72。C2.5min; 30~32循環;72。C6min。 PCR產物經凝膠 電泳檢測後，用膠回收試劑盒純化回收，隨後按照真菌克隆試劑盒操作說明 進行操作，克隆子經藍白篩選，擴增陽性克隆子；擴增片段經酶切後電泳檢 測種數多樣性，對具有不同酶切片段的克隆子進行測序，序列在 h加:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2sea/wblast2.cgi網站中講《亍Blast分析，按照親源關係遠近依次選取一些有代表性種屬序列，利用系統發育樹軟體ClustalX2.0繪製系統發育樹，進而劃定各所測序列可能代表的種屬情況。序列比對分析發現代號為DS-1的克隆子的18SrDNA基因序列與i^odas;7on'(i/Mm ^^ov"rt^ | AB073271.ll的相似度達到了 99.5%，提示沉積樣品裡含有朋o^w/7onWww^oZjow^謂類酵母菌。(三)7 /20cfos; onWMm力o6ovaft/m類酵母菌的個性化富集培養 能譜儀檢測結果發現沉積樣品的元素組成及含量如表1,沉積物礦物元素的能譜圖見附圖1。表l沉積物礦物元素組成與含量元素組成Wt%At%OK44.7659.30NaK3.603.32MgK1.130.99A1K9.607.54SiK33.5025.28C1K0.680.40KK3.341.81CaK0.530.28FeK2.881.09X-射線結果發現沉積樣品主成分為矽酸鹽。樣品取樣點理化參數為水深約5200米，pH為7.60、溫度為4'C、鹽度 約為2%。供參考的已知種屬的特徵信息，已報導的海水或河水中 i^o^wponVZ/ww力o6ovaft/m的富集培養條件麥芽浸出物、酵母浸出物、葡 萄糖、海水等，最佳生長溫度約為25°C。根據上述信息，及/zo^wponW/wm Wo6ova^m類酵母菌的個性化富集培養體 系被設定為酵母浸出物、葡萄糖、pH為7.60、培養溫度為15°C、生長大 氣壓為l個標準大氣壓、配置用水為人工海水，液體培養。人工海水基本鹽的 組分(g/1)是NaCl: 24.4770; Na2S04: 3.9170; KCl: 0.6640; MgCl2*6H20: 4.9810; CaCl2'H20: 1.1020; NaHC03: 0.1920; KH2P04: 0.1500; MnCl2'4H20: 0.2000; FeSO4'7H2O:2.0000; Na2S204: 1.0000。取約0.5克沉積樣品放在建立好的個性化富集培養體系中開始富集、富集 一個星期後、再進行固體培養，固體培養基成分與液體培養基成分相同，所 用凝固劑為瓊脂粉。通過劃線分離3次以上後，獲得一種呈大小不一的粉紅色 點狀隆起菌落，菌落表面粘稠，邊緣光滑、完整、無透明圈，光鏡下檢測發 現菌體形如頭盔、呈單細胞多多細胞珠連、有明顯的厚莢膜層，有分裂生殖的現象。經檢測發現該菌的18rDNA序列與DS-l的克隆子18SrDNA的序列完 全相同，為此認為該菌與DS-1為同一菌。隨後經ITSl-5.8SrDNA-ITS2間序列 檢測分析結果，形態學分析結果、生理生化結果發現DS-l與朋o^^on'^謹 Wo^w^/m屬內菌有較高的相似性，但仍存在一些差異。為此，認為DS-1屬 於i /zc^os/ oW(i/w附d/o6ov^腦內的一個新菌株(朋ot/os/ orW, (i/o6ovaf謂 JCM 0205)，根據18SrDNA序列和ITSl-5.8SrDNA-ITS2間序列的登陸 DQ854820 (18SrDNA)， DQ981849 (ITSl-5.8SrDNA-ITS2區域序列)。該菌 分離培養結果如附圖2 附圖6所示。隆起菌株及/2<^0^0〃'^^^060卩^"附JCM0205描述如下形如頭盔，呈能 運動的單細胞或雙細胞狀，如附圖2。在掃描電鏡下呈中央凹陷的半球狀，凹 陷的直徑大小約為1.5nm 5|im，凹陷深度變化約為0.5pm 2.0^im，在細胞 表面有許多網狀纖維，如附圖3。在透射電鏡下發現DS-0205外表面有一個 厚約為0.3nm lnm細胞壁，而在菌體近中央也有一個環狀的細胞壁，胞內 液泡不僅數量少而且體積偏小，如附圖4。莢膜染色結果顯示DS-0205胞外有 一層很厚的莢膜，如附圖5，圖中箭頭所示為莢膜。在15'C瓊脂培養5-7天後， 在有氧條件下，菌落形如表面柔軟，邊緣完整，呈粉紅色/紅色，菌落表面 粘稠發光，邊緣光滑、完整、無透明圈；菌落呈大小不一的粉紅色點狀隆起， 見附圖6。然而，厭氧培養時，菌落顏色最初為乳白色，隨著培養時間延長變 為粉紅色/紅色。
權利要求
1.一種培養篩選微生物菌種的方法，其特徵在於包括以下步驟1)樣品處理及DNA抽提溶解洗滌樣品，收集菌體顆粒物質，去雜質，收集沉澱物；酚-氯仿-異戊醇抽提沉澱物中的DNA；2)PCR擴增，克隆、酶切、測序及序列分析，檢測樣品中微生物種類多樣性分別採用細菌、古細菌和真菌通用引物擴增DNA抽提物，擴增產物，純化，純化產物連接克隆後通過藍白篩選陽性克隆子；對陽性克隆子進行克隆序列的擴增，擴增產物經酶切電泳後初步判斷樣品中所含微生物的種類數；對各種類進行測序分析，獲知樣品中的微生物種類、豐度、生物多樣性和分布規律；3)微生物菌種的個性化富集培養用掃描電鏡分析樣品的表面形態結構；用能譜儀、X-射線採集樣品礦物元素的成份及其有機物種類的信息；採集樣品所在的環境信息，包括溫度、酸鹼度、鹽度等；通過序列比對分析，初步判斷各類微生物的種屬及生長特徵情況，參照已有的該類微生物的相關信息；對於新種則參照與之在系統發育樹中親緣關係最近的微生物的生長環境信息；根據上述信息建立個性化富集培養體系；應用個性化富集培養體系富集各類微生物，分離純化各富集分離物，獲得純培養物。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟l)中抽提沉澱物中的DNA 的過程為① 向沉澱物中加入高濃度細胞裂解液，充分混勻，放入沸水浴中8 15min;② 55 65。C水浴30min以上；③ 隨後72。C水浴30min以上； 加入酚/氯仿/異戊醇混和液，混勻，在室溫下靜置10min左右，離心， 將上清液用酚/氯仿/異戊醇重複抽提，收集上清液；⑤ 上清液用-2(TC 4'C的無水乙醇沉澱，沉澱溫度為4。C，沉澱時間30 min 以上，離心收集沉澱；⑥ 用濃度為70%的乙醇洗滌沉澱物兩次；⑦ 沉澱物置於室溫或真空乾燥，用TE或無菌去離子水溶解沉澱，得到基 因組DNA提取液。
3. 如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述細胞裂解液各組分的濃度 分別為EDTA: 0.10 0.30mol/L; Tris.HCl: 0.005 0.15mol/L; NaCl: 0.10 0.30mol/L; SDS的質量百分濃度為2% 7.5%; CTAB質量百分比濃度為 0.30% 0.75%。
4. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述細胞裂解液的組成為pH8.0， lmol/L的Tris . HC1、 pH8.0， 0.5mol/L的EDTA、 5mol/L的NaCl水溶液、質 量百分比濃度為20。/。的SDS，質量百分比濃度為10。/。的CTAB，各組分的體 積百分比為12.5: 50: 5: 25: 7.5。
全文摘要
本發明公開了一種培養篩選微生物菌種的方法，先通過提取各樣品的總基因組，再利用PCR技術及RFLP分子生物學技術檢測物樣品中微生物的種類、豐度、生物多樣性及其分布規律，用能譜儀分析樣品的礦物元素的成份，並結合取樣時獲得的取樣點的理化信息構建針對樣品中各類微生物的個性化富集培養體系，以個性化富集培養體系來篩選分離樣品中各類微生物，特別是目的微生物。與傳統的選擇性微生物篩選培養方法相比，本發明使得一些不可培養的微生物變成可培養的；克服了損失新種概率大、樣品耗量大、隨機性與盲目性程度高、效率低等問題，提高了從樣品培養和選育微生物的產率和種類。
文檔編號C12Q1/68GK101250578SQ20081003087
公開日2008年8月27日 申請日期2008年3月24日 優先權日2008年3月24日
發明者曾樂平, 黃菊芳 申請人:中南大學