一種與類風溼性關節炎相關的抗原的製作方法

2023-08-07 20:49:51

專利名稱：一種與類風溼性關節炎相關的抗原的製作方法
一種與類風溼性關節炎相關的抗原本發明涉及類風溼性關節炎(RA)的檢測和治療。本發明涉及結合纖連蛋白的 ED-A同種型的結合成員(binding member)，尤其是結合纖連蛋白的結構域ED-A的結合成 員的應用。類風溼性關節炎(RA)是一種慢性炎性和破壞性關節病，在工業化世界，其影響 0. 5-1%的人群，並且常常導致明顯的殘疾從而降低生活質量。患有RA的患者滑膜中的血管形成被認為是發病機制和疾病永存中一個重要的早 期步驟(Taylor、2002)。如在腫瘤性疾病中，血管形成促進擴張滑膜(Walsh et al.，1998)。 血管生長很可能有助於炎性滑膜血管翳的增生，並有助於炎性白細胞進入滑膜組織內。患 有RA的患者的滑膜包含增加量的成纖維細胞生長因子-2(FGF-2)和血管內皮細胞生長因 子(VEGF) (Koch, 2003)。血清VEGF濃度與疾病活性相關並且當滑膜炎可通過治療而成功抑 制時血清VEGF濃度下降(Taylor，2002)。纖連蛋白(FN)是一種糖蛋白，並且在各種正常組織和體液中廣泛表達。其是細胞 外基質(ECM)的組分，並且在許多生物學過程中發揮作用，包括細胞粘附、細胞遷移、止血、 血栓形成、創傷癒合、組織分化和惡性轉化(致癌轉化)。不同的FN同種型通過初級轉錄本FN pre-mRNA的三個區域(ED_A、ED-B， IIICS)的選擇性剪接而生成，該過程受到細胞因子和細胞外PH的調節(Balza 1988 ； Carnemolla 1989 ；Borsi 1990 ；Borsi 1995)。纖連蛋白包含兩個III型球形額外結構域 (extra-domains)，該結構域可以進行選擇性剪接ED_A 和 ED-B (ffrench-Constant 1995， Hynes 1990，Kaspar et al. 2006)。小鼠纖連蛋白和人纖連蛋白的ED-A是96. 7%相同的 (在二者90個胺基酸序列之間僅3個胺基酸不同，參見圖2)。在乳腺癌(Jacobs et al. 2002, Matsumoto et al. 1999)和肝癌(Oyama et al. 1989，Tavian et al. 1994)中的mRNA水平以及在纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和黑色素瘤 (Borsi et al. 1987)中的分離蛋白水平，已報導了纖連蛋白的ED-A在腫瘤細胞和實體瘤中 的表達。在免疫組織化學水平，已經在牙源性腫瘤(Heikinheimo et al. 1991)和肝細胞癌 (Koukoulis et al. 1995)的細胞外基質(ECM)中檢測到了 ED-A的存在。相反，已經在惡性 乳腺腫瘤的間質(Koukoulis et al. 1993)和良好分化的腎細胞癌的血管和基底膜(Lohi et al. 1995)中檢測到了 ED-Α。然而，在較少分化的腎細胞癌(Lohi et al. 1995)和甲狀 腺乳頭瘤(Scarpino et al. 1999)中，已在血管、基底膜和腫瘤間質中檢測到了 ED-Α。還報 道了 ED-A存在於膠質瘤脈管系統中(Borsi et al. 1998)。因此，針對不同類型的腫瘤報導 的ED-A表達的模式是高度不同的。對於癌症治療而言，生物活性劑基於抗體靶向遞送至血管形成部位是一種有吸引 力的治療策略，但對於慢性炎性疾病而言，在很大程度上尚未進行探索。我們先前已經證 實了纖連蛋白的ED-B結構域(一種血管生成的標誌物)在患者的銀屑病病變和牛皮癬的 小鼠模型以及膠原引起的類風溼性關節炎小鼠模型的關節炎腳爪中表達。利用放射性和熒 光技術，發現在靜脈內給予之後，特異於EDB的人單克隆抗體L19選擇性定位於體內炎症部位。這些結果表明一種治療潛能，即基於L19的生物活性化合物選擇性遞送至炎症部位 (Trachsel、2007 ；PCT/EP2007/004044)。之前已通過原位雜交證實除了 ED-B之外，纖連蛋白的ED-A結構域也存在於人關 節炎樣本中(Berndt et al.，1998 ；Kriegsmann et al. ,2004)。這裡我們證實，與抗ED-B抗體L19以及抗結合腕蛋白(粘蛋白，tenascirO-C抗 體F 16和Gll相比，抗ED-A抗體如本文中披露的F8抗體能夠在人關節炎樣本中給出較強 的染色模式。此外，利用放射性和螢光技術，發現在靜脈內給予後特異於ED-A的人單克隆抗體 F8選擇性地定位於體內炎症部位。因此，表明纖連蛋白的ED-A能作為一種類風溼性關節炎的血管標誌物。結合分子如結合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的抗體分子代表可用於製備治療類 風溼性關節炎(RA)的藥物的新型試劑。本發明提供了結合纖連蛋白的額外結構域-A(ED-A)同種型(A-FN)的結合成員 例如抗體分子在用於製備治療類風溼性關節炎(RA)的藥物中的應用。本發明還提供了結 合纖連蛋白的ED-A的結合成員如抗體分子在用於製備治療類風溼性關節炎的藥物中的應用。本發明進一步提供結合纖連蛋白的ED-A同種型的結合成員例如抗體分子在用於 將結合至該結合成員的分子遞送至類風溼性關節炎部位中的應用。本發明還提供了結合纖 連蛋白的ED-A的結合成員例如抗體分子在用於將結合至該結合成員的分子遞送至類風溼 性關節炎部位中的應用。該結合分子可用於製備用於遞送這樣的分子的藥物。本發明提供了結合纖連蛋白的ED-A同種型的結合成員如抗體分子在用於製備用 於診斷類風溼性關節炎的診斷性產品中的應用。本發明還提供了結合纖連蛋白的ED-A的 結合成員如抗體分子在用於製備用於診斷類風溼性關節炎的診斷性產品中的應用。本發明進一步提供一種檢測或診斷人或動物體內的類風溼性關節炎的方法，包 括(a)向人或動物給予結合纖連蛋白的ED-A的結合成員，如抗體分子，以及(b)確定在人或動物體內的類風溼性關節炎部位是否存在該結合成員；其中，該結合成員定位於類風溼性關節炎的部位表明存在類風溼性關節炎。本發明提供了一種治療個體中的類風溼性關節炎的方法，包括給予該個體治療有 效量的包括結合纖連蛋白的ED-A同種型的結合成員如抗體分子的藥物。本發明還提供了 一種治療個體中的類風溼性關節炎的方法，包括給予該個體治療有效量的包括結合纖連蛋 白的ED-A的結合成員如抗體分子的藥物。本發明提供了一種包括結合纖連蛋白的ED-A同種型的結合成員如抗體分子的組 合物，其用於治療個體中的類風溼性關節炎的方法中，該方法包括給予該個體治療有效量 的包括結合纖連蛋白的ED-A同種型的結合成員如抗體分子的藥物。本發明還提供一種包 括結合纖連蛋白的ED-A的結合成員如抗體分子的組合物，其用於治療個體中的類風溼性 關節炎的方法中，該方法包括給予該個體治療有效量的包括結合纖連蛋白的ED-A的結合 成員如抗體分子的藥物。本發明提供了一種將分子遞送至人或動物體內類風溼性關節炎部位的新血管系統的方法，包括向人或動物給予結合纖連蛋白的ED-A同種型的結合成員如抗體分子，其中 該結合成員結合至所述分子。本發明還提供了 一種將分子遞送至人或動物體內類風溼性關 節炎部位的新血管系統的方法，包括向人或動物給予結合纖連蛋白的ED-A的結合成員如 抗體分子，其中該結合成員結合至所述分子。用於本發明的結合成員可以為一種結合纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白 的ED-A的抗體，包括抗體!11、82、05、05』5、08、？8、？1、87』8或69或者其變異體中的一 種或多種互補決定區(CDR)。優選的，用於本發明的結合成員是一種結合纖連蛋白的ED-A 同種型和/或纖連蛋白的ED-A的抗體，包括抗體B2、C5、D5、C8、F8、B7或G9或者其變異體 中的一種或多種互補決定區(CDR)。最優選地，用於本發明中的結合成員是一種結合纖連蛋 白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED-A的抗體，包括抗體F8或者其變異體中的一種或多 種互補決定區(OTR)。用於本發明中的結合成員可包括抗體HI、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9 中的H和/或L CDR的組，或者抗體!11、82、05、0535、08、？841、87工8或69中的H和/ 或L⑶R的組，其中在所披露的H和/或L⑶R組內含10個或較少，如1個、2個、3個、4個 或5個胺基酸取代。優選地，用於本發明中的結合成員包括抗體B2、C5、D5、C8、F8、B7或G9 中的H和/或L⑶R的組，其中在所披露的H和/或L⑶R組內含10個或較少，如1個、2 個、3個、4個或5個胺基酸取代。優選地，用於本發明中的結合成員包括抗體F8中的H和 /或L⑶R組，其中在所披露的H和/或L⑶R組內含10個或較少，如1個、2個、3個、4個 或5個胺基酸取代。取代可能在⑶R組內的任何殘基處或者可以在⑶R1、⑶R2和/或⑶R3內實現。例如，用於本發明中的結合成員可包括如本文中描述的一個或多個CDR，例如， ⑶R3，並且可選地，還包括⑶Rl和⑶R2以構成⑶R組。用於本發明中的結合成員還可包含抗體分子，例如人抗體分子。該結合成員通常 包含抗體VH和/或VL結構域。結合成員的VH結構域也適用於本發明。在VH和VL結構域 中的每一種內，均存在互補決定區(「CDR」)和框架區(FR)。VH結構域包含HCDR組，而VL 結構域包含IXDR組。抗體分子可包含抗體VH結構域，其包括VH⑶R1、⑶R2和⑶R3以及 框架區。其可以可替換地或者還可包含抗體VL結構域，其包括VL⑶R1、⑶R2和⑶R3以及 框架區。抗體111、82、05、05』5、08、卩8、卩1、8738和G9中的VH和VL結構域以及CDR在 本文中描述。本文中披露的所有VH和VL序列、⑶R序列、⑶R組以及HCDR組和IXDR組均 代表用於本發明中的結合成員的實施方式。如本文所述，「CDR組」包括CDR1、CDR2和CDR3。 因此，HCDR 組是指 HCDR1、HCDR2 和 HCDR3，而 LCDR 組是指 LCDR1、LCDR2 和 LCDR3。除非另 有指明，否則「⑶R組」包括HCDR和IXDR。用於本發明中的結合成員可包含抗體VH結構域，其包含互補決定區HCDR1、HCDR2 和 HCDR3 以及框架，其中 HCDRl 是 SEQID NO :3、23、33、43、53、63、73、83、93、103 或 113，並 且其中可選地，HCDR2是SEQ ID NO :4和/或HCDR3是SEQ ID NO :5。優選地，該HCDRl是 SEQ ID NO :23、33、43、53、73、83 或 103。最優選地，該 HCDRl 是 SEQ ID NO :83。典型地，VH結構域與VL結構域配對從而為抗體提供抗原結合位點，儘管如在下面 進一步討論的，VH或VL結構域可單獨用來結合抗原。因此，用於本發明中的結合成員可進 一步包含抗體VL結構域，其包括互補決定區IXDR1、IXDR2和IXDR3以及框架，其中IXDRl
7是 SEQ ID N0:6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116，並且其中可選地，LCDR2是SEQ ID N0:7，和 / 或 LCDR3 是 SEQ ID NO :8。優選地，該 LCDRl 是 SEQ ID NO :26、36、46、56、76、86 或106。最優選地，該LCDRl是SEQ ID NO :86。用於本發明中的結合成員可以是用於纖連蛋白的ED-A的分離的抗體分子，包括 VH結構域和VL結構域，其中該VH結構域包括框架以及互補決定區HCDRl、HCDR2和HCDR3 的組，並且其中該VL結構域包括互補決定區IXDR1、IXDR2和IXDR3以及框架，並且其中HCDRl 具有胺基酸序列 SEQ ID NO :3、23、33、43、53、63、73、83、93、103 或 113，HCDR2具有胺基酸序列SEQ ID NO :4，HCDR3具有胺基酸序列SEQ ID NO :5，LCDRl 具有胺基酸序列 SEQ ID NO :6、26、36、46、56、66、76、86、96、106 或 116 ；LCDR2具有胺基酸序列SEQ ID NO :7 ；以及LCDR3具有胺基酸序列SEQ ID NO :8。可將抗體的一個或多個CDR或者CDR的組移植入框架(例如，人框架)內，以提供 用於本發明中的抗體分子。框架區可包括人種系基因節段序列。因此，可將框架種系化，借 此改變框架內的一個或多個殘基以與最相似的人種系框架內對應位置的殘基相匹配。用於 本發明中的結合成員可為分離的抗體分子，其具有在人種系框架如DP47內含有HCDR組的 VH結構域。通常，該結合成員還具有在例如人種系框架內含有LCDR組的VL結構域。該VL 結構域的人種系框架可以為DPK22。用於本發明中的VH結構域可具有胺基酸序列SEQ ID NO :1、21、31、41、51、61、71、 81、91、101或111。優選地，用於本發明中的VH結構域具有胺基酸序列SEQ ID NO :21、31、 41、51、71、81或101。最優選地，用於本發明中的VH結構域具有胺基酸序列SEQ ID N0:81o 用於本發明中的VL結構域可具有胺基酸SEQID NO :2、22、32、42、52、62、72、82、92、102或 112。優選地，用於本發明中的VL結構域可具有胺基酸SEQ ID NO :22、32、42、52、72、82或 102。最優選地，用於本發明中的VL結構域具有胺基酸SEQ ID NO :82。用於本發明中的結合成員可為單鏈Fv(SCFV)或包含單鏈Fv (scFv)，包括藉助於 肽連接物連接的VH結構域和VL結構域。普通技術人員可選擇連接物的適當長度和序列， 例如，長度至少5或10個胺基酸，長度多達約15、20或25個胺基酸。該連接物可具有氨基 酸序列GSSGG (SEQ ID NO 28)。所述scFv可由胺基酸序列SEQ ID NO 9構成，或包含氨基 酸序歹丨J SEQ ID NO :9ο單鏈Fv(ScFv)可包含在小免疫球蛋白或小免疫蛋白(SIP)中，例如，如在(Li et al. ,1997)中所描述的。sip可以包含scFv分子，該分子融合於人IgE分泌性同種型IgE-S2 的CH4結構域(ε S2-CH4 ；Batista et al.，1996)，其形成同源二聚體型小免疫球蛋白抗體 分子。可替換地，用於本發明中的結合成員可在非抗體分子內包含抗原結合位點，通常 由一個或多個CDR，例如非抗體蛋白支架中的CDR組提供。包括非抗體和抗體分子的結合成 員在本文的其他部分更詳細地描述。用於本發明中的結合成員可結合至具有殺生物性、細胞毒性免疫抑制活性或抗炎 活性的分子。白介素-10是一種與根據本發明的結合成員結合的有益分子，並且可用於治 療類風溼性性關節炎。此外，用於本發明中的結合成員可結合至放射性同位素、可檢測性標記物或光敏劑。本發明的這些以及其他方面在下文中更詳細地描述。


圖1示出了利用針對血管形成的標誌物的抗體在人關節炎樣本上進行免疫組織 化學的結果。較深的染色表示抗原的強表達，用白色箭頭指出。F8是本文中所披露的結合 ED-A的抗體分子，L19是結合ED-B的抗體分子(例如，Pini et al. 1998), F16和Gll分別 是結合於結合腕蛋白(TenascirO-C結構域Al和C的抗體分子(W02006/050834)。圖2示出了利用針對纖連蛋白的ED-A結構域的F8抗體分子在人關節炎樣本上進 行免疫螢光分析的結果。白色染色表示抗原的強表達。圖3示出了 A 人ED-A (上面的序列)與B 小鼠ED-A (下面的序列)之間的比對。 星號表示其中人ED-A與小鼠ED-A的胺基酸相同的胺基酸位置。圖4A示出了抗ED-A抗體Hl重鏈(VH)的核苷酸序列(SEQID NO :12)。抗ED-A 抗體Hl的重鏈⑶Rl的核苷酸序列加下劃線。抗ED-A抗體Hl的重鏈⑶R2的核苷酸序列 以斜體示出並加下劃線。杭ED-A抗體Hl的重鏈CDR3的核苷酸序列以粗體示出 並加下劃線。圖4B示出了抗ED-A抗體Hl連接物(連接子)序列的核苷酸序列(SEQ ID NO 14)。圖4C示出了抗ED-A抗體Hl輕鏈(VL)的核苷酸序列(SEQID NO :13)。抗ED-A 抗體Hl的輕鏈⑶Rl的核苷酸序列加下劃線。抗ED-A抗體Hl的輕鏈⑶R2的核苷酸序列 以斜體示出併力口下劃線。杭ED-A抗體Hl的輕鏈CDR3的核苷酸序列以粗體示出 並加下劃線。圖5A示出了抗ED-A抗體Hl重鏈(VH)的胺基酸序列(SEQID NO :1)。抗ED-A抗 體Hl的重鏈⑶Rl的胺基酸序列(SEQ IDNO 3)加下劃線。抗ED-A抗體Hl的重鏈⑶R2的 胺基酸序列(SEQID NO 4)以斜體示出併力口下劃線M1 ED-A抗體Hl的重鏈CDR3的 胺基酸序列(SEQ ID NO 5)以粗體示出並加下劃線。圖5B示出了抗ED-A抗體Hl連 接物序列的胺基酸序列(SEQ ID N0:11)。圖5C示出了抗ED-A抗體Hl輕鏈(VL)的氨基 酸序列(SEQ ID NO :2)。輕鏈CDRl的胺基酸序列(SEQ ID NO 6)加下劃線。抗ED-A抗體 Hl的輕鏈CDR2的胺基酸序列(SEQ ID NO 7)以斜體示出併力口 T^/·^。抗ED-A抗體 Hl的輕鏈CDR3的胺基酸序列(SEQ IDNO 8)以粗體示出並加下劃線。圖6示出了包含F8-IL10的編碼序列的核酸構建體的序列。該結構為HINDIII 分泌序列F8(14aa連接物)連接物(SSSSG)3_IL10_終止子(stop)-NotI，如下HINDIII 限制性酶切位點加iMM，編碼分泌信號的序列以#體示出，F8VH編碼序列位於分泌 信號序列之後，為啦L體,編碼14胺基酸連接物的序列以小寫字母表示，F8 VL編碼序 列在14胺基酸連接物序列之後，為粗體，連接物(SSSSG)3序列位於F8編碼序列之後， 加下劃線並以斜體表示,IL-10編碼序列加雙下劃線；然後終止子以小寫字母表示， 其後的NOTI限制性酶切位點加王劃逢。
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圖7示出了包含連接物的抗體scFv(F8) IL-10結合物的胺基酸序列，結構為 VH-連接物-VL-連接物-IL-10。VH和VL結構域以傘L體表示，scFv連接物以小寫字母表 示，scFv與ILlO之間的連接物以小寫字母和#體表示，IL-10序列加下劃線。圖8示出了 F8-IL10和HyHellO-ILlO的克隆、表達和純化圖8a示出了包含F8-IL10融合蛋白元件的pcDNA3. 1載體的示意圖。人ILlO部 分通過15胺基酸連接物(SSSSG) 3融合於ScFv抗體片段的C末端。N末端的分泌序列是重 組蛋白的分泌所必需的。圖8b示出了純化的融合蛋白的SDS-PAGE分析結果泳道1，分子量標誌物；泳道 2和3，在非還原和還原條件下的F8-IL10。期望單體融合蛋白具有46kDa的分子量。圖8c 示出了已純化的F8-IL10的尺寸排阻色譜曲線(Superdex 200)。以13ml保留體積洗脫時 的峰對應於F8-IL10的非共價同源二聚體形式，以14ml保留體積洗脫時的較小峰對應於單 體部分。圖8d示出了 F8-IL10的活性分析結果。將F8-IL10的活性與MC/9細胞上的重組 人ILlO活性進行比較。^^纖連蛋白纖連蛋白是一種可進行選擇性剪接的抗原，並且纖連蛋白的許多可選的同種型是 已知的，如本文中其他部分所描述的。額外結構域-A(EDA或ED-Α)也稱為ED、額外III型 重複 A(EIIIA)或 EDI。Kornblihtt et al. (1984)，Nucleic Acids Res. 12，5853-5868 和 Paolella et al. (1988)，Nucleic Acids Res. 16,3545-3557 已發表了人 ED-A 的序列。人 ED-A的序列還可在SwissProt資料庫上作為以登錄號P02751存入(cbposit)的胺基酸序 列中的胺基酸1631-1720(111型纖連蛋白12 ；額外結構域2)獲得。小鼠ED-A的序列還可 在SwissProt資料庫上作為以登錄號Pl 1276存入的胺基酸序列中的胺基酸1721-1810 (III 型纖連蛋白13 ；額外結構域2)獲得。 纖連蛋白的ED-A同種型(A-FN)包含額外結構域_A (ED-A)。人A-FN的序列可從 相應的人纖連蛋白前體序列推導出來，該人纖連蛋白前體序列可在SwissProt資料庫上以 登錄號P02751獲得。小鼠A-FN的序列可從相應的小鼠纖連蛋白前體序列推導出來，小鼠 纖連蛋白前體序列可在SwissProt資料庫上以登錄號P11276獲得。所述A-FN可以為纖連 蛋白的人ED-A同種型。所述ED-A可以為人纖連蛋白的額外結構域-A。ED-A是90胺基酸序列，其可通過選擇性剪接(可變剪接)插入纖連蛋白(FN)內， 並且定位在 FN 的結構域 11 和 12 之間(Borsiet al.，1987，J. Cell Biol.，104，595-600)。 ED-A在血漿形式的FN中大部分缺失，但在胚胎發生、組織重構、纖維化、心臟移植和實體瘤 生長過程中則大量存在。選擇性剪接選擇性剪接是指DNA的初級RNA轉錄本發生不同模式的剪接以產生不同的mRNA。 切除內含子後，可決定選擇哪些外顯子一起剪接以形成mRNA。選擇性剪接導致生成包含不 同外顯子和/或不同數目外顯子的不同同種型。例如，一種同種型可包含對應於一個或多 個外顯子的額外胺基酸序列，其可包含一個或多個結構域。結合成員
其描述了彼此結合的一對分子中的一個成員。結合對的成員可為天然來源或 者完全或部分通過合成而生成的。所述分子對的一個成員在其表面上具有一個區域或 者一個腔，其結合至並因此互補於該分子對的另一成員的特定空間和極性構成(polar organization)。結合對類型的實例為抗原-抗體、生物素-抗生物素蛋白、激素_激素受 體、受體_配體、酶_底物。本發明涉及抗原_抗體類型的反應。結合成員通常包含具有抗原結合位點的分子。例如，結合成員可以為包含抗原結 合位點的抗體分子或非抗體蛋白。抗原結合位點可通過互補決定區(CDR)在非抗體蛋白支架如纖連蛋白或細胞色 素B等上排列(Haan & Maggos, 2004 ；Koide 1998 ；Nygren 1997)或通過隨機化或誘變蛋 白支架內環的胺基酸殘基以賦予對預期靶的結合特異性而提供。用於設計蛋白內新型結合 位點的支架已由Nygren等人(1997)進行了詳細綜述。在W0/0034784中披露了用於抗體 模擬物的蛋白支架，將其全部內容以引用方式結合於本文，其中發明人描述了包括具有至 少一個隨機化環的纖連蛋白III型結構域的蛋白(抗體模擬物)。其中移植了一個或多個 CDR例如一組HCDR的合適支架可由免疫球蛋白基因超家族的任何結構域成員提供。該支 架可以為人或非人蛋白。非抗體蛋白支架的優勢在於其在支架分子內提供抗原結合位點， 與至少某些抗體分子相比，該支架分子較小和/或易於製備。較小尺寸的結合成員可賦予 有用的生理特性如進入細胞、透入組織深處或到達其他結構內的靶的能力，或者結合靶抗 原的蛋白腔內的能力。非抗體蛋白支架內抗原結合位點的使用在WeSS，2004中進行綜述。 典型的是具有穩定骨架以及一個或多個可變環的蛋白，其中所述環的胺基酸序列被特異性 地或隨機性地突變以產生結合靶抗原的抗原結合位點。這樣的蛋白包括來自金黃色葡萄球 菌(S. aureus)的蛋白Α、轉鐵蛋白、四連接素、纖連蛋白(例如，第10纖連蛋白III型結構 域)和抑鐵素(lipocalins)的IgG結合結構域。其他途徑包括合成的「微體」(Selecore GmbH)，其基於環肽(cyclotides)-具有分子內二硫鍵的小蛋白。除了抗體序列和/或抗原結合位點以外，用於本發明中的結合成員還可包括其 他胺基酸，例如形成肽或多肽例如摺疊域，或者賦予該分子除結合抗原能力之外的另一功 能特徵。用於本發明中的結合成員可攜帶可檢測標記，或者可結合於毒素或靶向部分或酶 (例如，藉助於肽鍵或連接物)。例如，結合成員可包含催化位點(例如，在酶結構域內)以 及抗原結合位點，其中所述抗原結合位點結合於該抗原，因此使催化位點靶向該抗原。所述 催化位點可通過例如切割而抑制抗原的生物學功能。如已指出的，儘管⑶R可由非抗體支架所攜帶，但用於攜帶⑶R或⑶R組的結構通 常將為抗體重鏈或輕鏈序列或其基本部分，其中所述CDR或CDR組定位於與天然存在的VH 和VL抗體可變域(由重排的免疫球蛋白基因編碼)的⑶R或⑶R組合相對應的位置。免 疫球蛋白可變域的結構和定位可參照Kabat 1987及其最新資料而確定，現在可在網際網路 上查到(在immuno. bme. nwu. edu或利用任何搜尋引擎查找「Kabat」)。通過⑶R區或⑶R，用於表示免疫球蛋白重鏈和輕鏈中的超變區，如由Kabat等人 (1987)所定義的(Kabat 1991a,以及後來的版本)。抗體通常包含3個重鏈⑶R和3個輕 鏈⑶R。根據情況，本文中使用了術語⑶R，以便表示這些區域中的一個或幾個，或者甚至全 部，其包含大部分胺基酸殘基，該胺基酸殘基負責通過抗體的親合力結合所識別的抗原或 表位。
在這6個較短的⑶R序列中，重鏈的第3個⑶R(HCDR3)具有較大的尺寸可變性 (較大的差異性主要是由於生成其的基因重排的機制)。其可短至2個胺基酸，儘管已知最 長的尺寸為26個胺基酸。功能上，HCDR3在決定抗體的特異性方面部分發揮作用(Segal 1974 ；Amit 1986 ；Chothia 1987 ；Chothia 1989 ；Caton 1990 ；Sharon 1990a ；Sharon 1990b ；Kabat et al.，1991b)。抗體分子其描述了免疫球蛋白，無論是天然還是部分或全部通過合成而生成的。該術語還 涉及包含抗體的抗原結合位點的任何多肽或蛋白。這裡必須理解，本發明並不涉及天然形 式的抗體，也就是說抗體不是處於其天然環境中而是它們已能夠通過純化而從天然來源 中分離或得到，或者通過遺傳重組或通過化學合成而獲得，並且它們於是包含非天然氨基 酸，如其後將描述的。包含抗體的抗原結合位點的抗體片段包括但不限於諸如Fab、Fab\ Fab，-SH、scFv、Fv、dAb、Fd的抗體分子；以及雙體抗體(雙特異抗體，diabodies)。可能採用單克隆抗體和其他抗體並採用重組DNA方法的技術來生產其他結合靶 抗原的抗體或嵌合分子。這樣的技術可涉及將編碼免疫球蛋白可變區或抗體的CDR的DNA 引入至不同免疫球蛋白的恆定區或恆定區加框架區中。參見例如EP-A-184187、GB2188638A 或EP-A-239400，以及大量的後續文獻。雜交瘤或其他產生抗體的細胞可進行遺傳突變或其 他改變，其可能改變或可能不改變所產生的抗體的結合特異性。由於抗體可以以多種方式進行修飾，因此術語「抗體分子」應該理解為涵蓋任何具 有抗體的抗原結合位點(具有對抗原的必需特異性和/或結合)的結合成員或物質。因 此，該術語涵蓋抗體片段及衍生物，包括含有抗體的抗原結合位點的任何多肽，無論其是天 然的還是全部或部分合成的。因此，包括融合於另一種多肽(例如，來自另一物種或者屬於 另一抗體類別或亞類)的包括抗體的抗原結合位點的嵌合分子或等價物。嵌合抗體的克隆 和表達描述在EP-A-0120694和EP-A-0125023以及大量的後續文獻中。抗體工程領域中可採用的另外的技術使得可以分離人和人源化抗體。例如，人雜 交瘤可如Kontermarm & Dubel (2001)所描述的來製備。噬菌體展示，另一種已建立的用於 生成結合成員的技術，已經詳細地描述在許多出版物W092/01047(下文進一步討論)和美 國專利 US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、 US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160、US6521404 以及 Kontermann & Dubel (2001)中。其中小鼠抗體基因被滅活並用人抗體基因進行功能性 替代，同時保持小鼠免疫系統的其他元件完整的轉基因小鼠可用於分離人抗體(Mendez 1997)。合成的抗體分子可通過藉助於從合適表達載體內合成和組裝的寡核苷酸產生的 基因表達而生成，例如，如由Knappik等人(2000)或Krebs等人(2001)所描述的。已證實整個抗體的片段可執行結合抗原的功能。結合片段的實例為(i)由VL、 VH、CL和CHl結構域構成的Fab片段；(ii)由VH和CHl結構域構成的Fd片段；(iii)由 單個抗體的VL和VH結構域構成的Fv片段；(iv) dAb片段(Ward 1989 ；McCafferty 1990 ； Holt 2003)，其由VH或VL結構域構成；(ν)分離的CDR區；(vi)F(ab' ) 2片段，包括兩個連 接的Fab片段的二價片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結構域和VL結構域通過肽 連接物而連接，該連接物使所述兩個結構域結合以形成抗原結合位點(Bird 1988 ；Huston1988) ； (viii)雙特異性單鏈Fv 二聚體(PCT/US92/09965)和(ix) 「雙體抗體」，通過基因 融合構建的多價或多特異性片段(W094/13804 ;Holliger 1993a)。Fv、scFv或雙體抗體分 子可通過整合連接VH和VL結構域的二硫橋而穩定(Reiter 1996)。還可製備包含結合於 CH3結構域的ScFv的微型抗體(minibodies) (Hul996)。結合片段的其他實例是Fab，，其通 過在重鏈CHl結構域的羧基末端加入若干殘基而不同於Fab片段，包括來自抗體鉸鏈區的 一個或多個半胱氨酸，以及Fab』-SH，其是其中恆定域的(一個或多個)半胱氨酸殘基攜帶 游離巰基的Fab，片段。用於本發明中的抗體片段可從本文描述的任何抗體分子，例如包含VH和/或VL 結構域的抗體分子或者本文描述的任何抗體的CDR開始，通過諸如藉助於酶如胃蛋白酶和 /或木瓜蛋白酶進行消化和/或通過藉助於化學還原切割二硫橋的方法而獲得。在另一種 方式中，本發明的抗體片段可通過同樣對於本領域普通技術人員來說熟知的基因重組技術 或藉助於例如自動肽合成儀(諸如Applied Biosystems等公司供應的那些合成儀)通過 肽合成或者通過核酸合成和表達而獲得。根據本發明的功能性抗體片段包括其半衰期通過化學修飾特別是通過聚乙二醇 化或者通過整合入脂質體內而延長的任何功能片段。dAb (結構域抗體)是抗體的較小單體抗原結合片段，即抗體重鏈或輕鏈的可變區 (Holt 2003)。VH dAb天然存在於駱駝科(例如駱駝、駱馬)中，並且可通過用靶抗原免疫 駱駝科動物、分離抗原特異性B細胞以及直接克隆來自單個B細胞的dAb基因而生成。dAb 還可在細胞培養中得到。它們的小尺寸、良好的溶解性以及溫度穩定性使得它們在生理上 特別有用，並且適合於進行選擇和親和力成熟。本發明的結合成員可以是包含VH或VL結 構域的dAb，如本文中基本上列出的，或者可以為包含一組⑶R的VH或VL結構域，如本文中 基本上列出的。如本文中所使用的，術語「基本上列出的」是指本文描述的結合成員VH或VL結構 域的相關CDR的(一個或多個)特徵將與本文中已列出其序列的特定區域相同或高度類 似。如本文所描述的，相對於一個或多個可變域的(一個或多個)特定區域，術語「高度類 似」期待可在該⑶R和/或VH或VL結構域中進行從1至約5例如從1至4，包括1至3，或 者1或2，或者3或4個胺基酸取代。雙特異性或雙功能性抗體構成第二代單克隆抗體，其中兩個不同的可變區結合在 相同分子中(Holliger 1999)。通過其補充新效應子功能或者將幾個分子靶向在腫瘤細 胞表面的能力，已經證實了它們在診斷領域和在治療領域中的用途。在將採用雙特異性 抗體的情況下，這些可以為常規的雙特異性抗體，其可通過各種途徑進行製備(Holliger 1993b)，例如通過化學或通過二次雜交瘤(雜交的雜交瘤，hybrid hybridoma)而製備，或 者可以為上文提到的雙特異性抗體片段中的任何一種。這些抗體可通過化學方法(Glermie 1987 ；Repp 1995)或體細胞法(Staerz 1986 ；Suresh 1986)，但同樣可通過基因工程技術 而獲得，後者可實現異源二聚化從而有利於所尋找抗體的純化過程(Merchand 1998)。雙特 異性抗體的實例包括BiTE 方法學(BiTE technology)的那些，其中可採用具有不同特異 性的兩種抗體的結合結構域並通過短的柔性肽(柔性連接肽，flexiblepeptides)直接連 接在一起。這樣可將兩種抗體結合在單個短多肽鏈上。雙體抗體和scFv可構建為不含Fc 區，僅利用可變域，有可能降低抗個體基因型反應的效應。
雙特異性抗體可構建為整個IgG、雙特異性Fab' 2,Fab' PEG、雙體抗體或雙特異 性scFv。此外，兩種雙特異性抗體可利用本領域中已知的常規方法進行連接，以形成四價抗 體。與雙特異性全抗體不同，雙特異性雙體抗體還特別有用，因為它們可以容易地構 建且易於在大腸桿菌中表達。具有適當結合特異性的雙體抗體(以及許多其他多肽如抗體 片段)可以利用噬菌體展示(W094/13804)從文庫中容易地進行選擇。如果雙體抗體的一 個臂(arm)將保持恆定，例如具有針對靶抗原的特異性，則可製備一個文庫，其中另一個臂 是變化的，且可選擇具有適當特異性的抗體。雙特異性全抗體可通過可替代的工程方法而 製備，如在Ridgeway 1996中描述的。在本領域中各種方法可用於獲得針對靶抗原的抗體。所述抗體可以為單克隆抗 體，特別是人源、鼠源、嵌合或人源化來源，其可按照本領域中普通技術人員熟知的標準方 法而獲得。通常，為了製備單克隆抗體或它們的功能片段，特別是鼠源的，可以參考特別是 在手冊〃 Antibodies」(Harlow and Lane 1988)中描述的技術或者參考 Kohler and Milstein, 1975描述的從雜交瘤進行製備的技術。單克隆抗體可例如從通過針對A-FN或其包含由所述單克隆抗體識別的表位的片 段(例如，包含ED-A或由ED-A構成的片段，或者ED-A的肽片段)之一進行免疫的動物細胞 獲得。A-FN或者其片段之一可按照通常的操作方法通過從cDNA序列中所包含的編碼A-FN 或其片段的核酸序列開始進行基因重組，從A-FN或其片段的肽序列中包括的胺基酸序列 開始進行肽合成來特別生成。例如，單克隆抗體可在親和柱上進行純化，該親和柱上已經預先固定了 A-FN或其 包含由所述單克隆抗體識別的表位的片段之一，例如包含ED-A或ED-A的肽片段或由ED-A 或ED-A的肽片段構成的片段。單克隆抗體可通過在蛋白A和/或G上進行層析而純化，接 著進行或不進行離子交換層析，這種層析的目的在於清除殘留的蛋白汙染物以及DNA和本 身的LPS，接著在瓊脂糖凝膠上進行或不進行排阻層析，以便消除由於存在二聚體或其他多 聚體引起的潛在聚集體。全部這些技術可同時或順序使用。抗原結合位點其描述了結合於並互補於全部或部分靶抗原的分子的部分。在抗體分子中，其稱 為抗體的抗原結合位點，並且包括結合於並互補於全部或部分該靶抗原的抗體的部分。當 抗原較大時，該抗體可以僅結合於抗原的特定部分，該部分命名為表位。抗體的抗原結合位 點可以通過一個或多個抗體可變域來提供。抗體的抗原結合位點可包括抗體輕鏈可變區 (VL)和抗體重鏈可變區(VH)。分離的該術語是指其中用於本發明的結合成員或編碼這樣的結合成員的核酸通常按照 本發明的狀態。因此，本發明的結合成員、VH和/或VL結構域可以以基本純化或同質的形 式例如從它們的天然環境分離和/或純化而提供，或者，在核酸的情況下，則為游離或基本 游離於不同於編碼具有所需功能的多肽的序列來源的核酸或基因。分離的成員和分離的核 酸將游離於或基本游離於它們天然結合的物質諸如在它們的天然環境中與它們一起存在 的其他多肽或核酸，或者當通過體外或體內實施的重組DNA技術進行這樣的製備時，則游離於或基本游離於製備它們的環境(例如，細胞培養)。成員和核酸可通過稀釋劑或佐劑進 行配製，並且還可分離用於實際目的-例如如果用來包覆用於免疫分析的微滴定板，則所 述成員將通常與明膠或其他載體進行混合，或者當用於診斷或治療時，將與藥用載體或稀 釋劑進行混合。結合成員可天然或通過異源真核細胞(例如，CHO或NSO (ECACC 85110503) 細胞進行糖基化，或者它們(例如，如果通過在原核細胞中表達而生成)可為非糖基化的。包含抗體分子的異質製劑也可用於本發明中。例如，這樣的製劑可為含全長重鏈 和缺失C末端賴氨酸重鏈的抗體混合物，具有不同程度的糖基化和/或具有衍生的胺基酸， 例如N末端穀氨酸環化以形成焦穀氨酸殘基。用於抗原例如A-FN或纖連蛋白的ED-A的一種或多種結合成員可通過使根據本 發明的結合成員的文庫與抗原或它們的片段例如包含ED-A或ED-A的肽片段或由ED-A或 ED-A的肽片段構成的片段相接觸並篩選所述文庫中能夠結合該抗原的一種或多種結合成 員來獲得。抗體文庫可利用重複克隆過濾篩選(ICFS)進行篩選。在ICFS中，將包含編碼幾 種結合特異性的DNA的細菌在液體培養基中生長，並且一旦達到指數生長期，則將數十億 的細菌分散在由適當預處理的膜濾器(membrane filter)構成的生長支持物上，並將其孵 育直至出現完全融合(匯合)的細菌集落。另外一種捕獲基質由另一種膜濾器構成，該膜 濾器已經預增溼並覆蓋有期望的抗原。隨後將該捕獲膜濾器置於包含合適培養基的板上，並用表面已覆蓋有朝上的細菌 集落的生長濾器(growth filter)進行覆蓋。由此獲得的夾層在室溫下孵育約16h。從而 可以實現編碼具有擴散作用的抗體片段ScFv的基因的表達，使得捕獲那些與在捕獲膜上 存在的抗原特異性結合的片段。然後該捕獲膜經處理以通過通常用於該目的的比色技術來 展示已結合的抗體片段ScFv。捕獲濾器上色斑的位置可追溯至存在於生長膜上並生成捕獲的抗體片段的相應 細菌集落。收集這樣的集落並進行培養，細菌_幾百萬個細菌分散在新的培養膜上，重複 上述步驟。隨後進行類似循環直至捕獲膜上的陽性信號對應於單個陽性集落(菌落)，其 中每一個均代表針對該選擇中所用的抗原的單克隆抗體片段的潛在起源。ICFS描述在例 如TO0246455中，將其結合於此供參考。文庫也可以在顆粒或分子複合物，例如可複製的 遺傳包裝如噬菌體(例如，T7)顆粒，或者其他體外展示系統上展示，每一種顆粒或分子復 合物均包含編碼在其上展示的抗體VH可變域的核酸，並且可選地還包含展示的VL結構域 (如果存在)。噬菌體展示描述在W092/01047以及例如美國專利US5969108、US5565332、 US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、 US6172197、US6225447、US6291650、US6492160 和 US6521404 中，將其每一個的全部內容均 結合於此供參考。選擇能夠結合所述抗原並在噬菌體或者其他文庫顆粒或分子複合物上展示的結 合成員後，可從展示所述選擇的結合成員的噬菌體或者其他顆粒或分子複合物提取核酸。 通過從具有從展示所述選擇的結合成員的噬菌體或者其他顆粒或分子複合物中提取的核 酸序列的核酸進行表達，這樣的核酸可用於隨後生成結合成員或者抗體VH或VL可變域。
具有所述選擇的結合成員的抗體VH可變域的胺基酸序列的抗體VH可變域可以以 分離形式提供，如可為包含這樣的VH結構域的結合成員。
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可進一步測定結合A-FN或纖連蛋白的ED-A或者其他靶抗原或同種型的能力，例 如，與抗ED-A抗體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9中的任何一種競爭與A-FN或 A-FN的片段，例如纖連蛋白的ED-A結合的能力。用於本發明中的結合成員可特異性結合A-FN和/或纖連蛋白的ED-Α。本發明的 結合成員可以與抗ED-A抗體HI、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9，例如以scFv形式 相同的親和力或者以更高的親和力結合A-FN和/或纖連蛋白的ED-Α。用於本發明中的結 合成員以3X 10_8M的Kd或更高的親和力結合A-FN和/或纖連蛋白的ED-Α。優選地，用於 本發明中的結合成員以2 X IO-8M的Kd或更高的親和力結合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A。 更優選地，用於本發明中的結合成員以1. 7 X ICT8M的Kd或更高的親和力結合A-FN和/或 纖連蛋白的ED-Α。還更優選地，用於本發明中的結合成員以1. 4 X IO-8M的Kd或更高的親和 力結合A-FN和/或纖連蛋白的ED-Α。最優選地，用於本發明中的結合成員以3X 10_9M的 Kd或更高的親和力結合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A。本發明的結合成員可結合於A-FN和/或纖連蛋白的ED-A上與抗ED-A抗體HI、 B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8 或 G9 相同的表位。用於本發明中的結合成員可不表現出任何對除A-FN和/或纖連蛋白的ED-A外的 分子的顯著結合。特別地，該結合成員可不結合纖連蛋白的其他同種型，例如纖連蛋白的 ED-B同種型和/或IIICS同種型。本文中所披露的抗體分子的變異體可在本發明中生產並使用。通常在CDR、抗體 VH或VL結構域以及結合成員的胺基酸序列內部進行取代所需的技術在本領域中是可獲得 的。可製備包含取代的變異體序列，所述取代可以(或不可以)預測對活性具有微小或有 益的影響，並測定其結合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的能力和/或測定任何其他期望特 性。如所討論的，可根據本發明採用本文中已特別披露其序列的任何VH和VL結構域 的可變域的胺基酸序列變異體。特定變異體可包括一個或多個胺基酸序列改變(添加、缺 失、取代和/或插入胺基酸殘基)，可少於約20個改變，少於約15個改變，少於約10個改變 或少於約5個改變，可能為5、4、3、2、1個改變。改變可在一個或多個框架區和/或一個或 多個CDR中進行。所述改變通常並不導致功能喪失，因此包含由此改變的胺基酸序列的結 合成員可保留結合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的能力。例如，其可保留與其中不進行改 變的結合成員相同的定量結合，例如，如在本文中描述的分析中測量的。包含由此改變的氨 基酸序列的結合成員可以具有改善的結合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的能力。攜帶用於本發明中的來自CDR序列的新型VH或VL區可利用隨機誘變一個或多個 選擇的VH和/或VL基因以在整個可變域內產生突變而產生。在一些實施方式中，在整個 可變區或CDR組內進行一個或兩個胺基酸取代。另一種可使用的方法是直接誘變VH或VL 基因的⑶R區。如上文指出的，如本文中基本上列出的CDR胺基酸序列可作為人抗體可變域中的 CDR或者其基本部分而被攜帶。如本文中基本上列出的HCDR3序列代表本發明的實施方 式，並且例如，這些序列中的每一種均可作為人重鏈可變域中的HCDR3或其基本部分而被攜帶。本發明中採用的可變域可獲自或來自任何種系或重排的人可變域，或者可為基於已知人可變域共有或實際序列的合成可變域。可變域可來自非人抗體。用於本發明中的 ⑶R序列(例如，⑶R3)可利用重組DNA技術引入到缺乏⑶R(例如，⑶R3)的可變域的庫 (repertoire)中。例如，Marks等人(1992)描述了生成抗體可變域的文庫的方法，其中定位 於或鄰近可變域的5』末端的通用引物與人VH基因的第三框架區的通用引物聯用，以提供 缺乏CDR3的VH可變域的文庫。Marks等人進一步描述了如何將該文庫與特定抗體的CDR3 進行結合。利用類似技術，本發明的來自CDR3的序列可與缺乏CDR3的VH或VL結構域的 文庫混合(shuffle)，且所混合的完整VH或VL結構域與同源VL或VH結構域結合，以提供 用於本發明中的結合成員。然後可在合適的宿主系統如W092/01047(將其全部內容結合於 此供參考)或後續大量文獻中的任一個，包括Kay，Winter & McCafferty (1996)的噬菌體 展示系統內展示該庫，使得可以選擇合適的結合成員。文庫可由任何來自IO4個以上的個 體成員例如至少105、至少106、至少107、至少108、至少IO9或至少IOki個成員組成。類似地，一個或多個，或者所有三個⑶R均可移植入VH或VL結構域的文庫內，隨 後篩選用於A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的一個或多個結合成員。可以採用抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8 或 G9 的 HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 中的一個或多個或者HCDR組，和/或可以採用抗體!11、82、05、05』5、08、卩8、卩1、8738或 G9 的 X LCDRU LCDR2 和 LCDR3 中的一個或多個或者抗體 H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、 E8或G9的LCDR組。類似地，還可以採用本文中披露的其他VH和VL結構域、⑶R組和HCDR組和/或 LCDR 組。A-FN和/或纖連蛋白的ED-A均可用於篩選用於製備治療類風溼性關節炎的藥物 的結合成員例如抗體分子。該篩選可為本文其他部分所披露的庫篩選。免疫球蛋白可變域的基本部分可包括至少所述三個CDR區，連同它們插入的框架 區。該部分還可包括第一和第四框架區中的任一個或兩者的至少約50 %，該50 %為第一框 架區的C末端50%和第四框架區的N末端50%。該可變域的基本部分的N末端或C末端 處的其他殘基可為那些通常不與天然存在的可變域域結合的殘基。例如，通過重組DNA技 術進行的構建本發明的結合成員可導致引入由連接物編碼的N末端或C末端殘基，以促進 克隆或其他操作步驟。其他操作步驟包括引入連接物以將本文其他部分披露的可變域連接 於另外的蛋白序列，包括抗體恆定區、其他可變域(例如在生成雙體抗體時)或可檢測/功 能標記物，如本文其他部分更詳細地討論的。儘管結合成員可包括VH和VL結構域對，但基於VH或VL結構域序列中的任一個 的單結合結構域也可用於本發明中。已知單個免疫球蛋白結構域，特別是VH結構域，能夠 以特異性方式結合靶抗原。例如，參見上文對dAb的討論。在單個結合結構域中的任一個的情況下，這些結構域均可用來篩選能夠形成雙結 構域結合成員(能夠結合A-FN和/或纖連蛋白的ED-Α)的互補結構域。這可通過利用如 在TO92/01047中披露的稱為分級雙重組法的噬菌體展示篩選法而實現，將全部內容結合 於此供參考，其中包含H鏈或L鏈克隆中的任一個的單個集落用來感染編碼另一條鏈(L或 H)的完整克隆文庫，並且所得到的雙鏈結合成員按照噬菌體展示技術例如該文獻中披露的 那些技術進行篩選。該技術還披露在Marks 1992中。用於本發明中的結合成員可進一步包括抗體恆定區或其一部分，例如人抗體恆定區或其一部分。例如，VL結構域可在其C末端連接於包含人Ck或CX鏈，例如CX的抗體 輕鏈恆定域。類似地，基於VH結構域的結合成員在其C末端結合於免疫球蛋白重鏈的全部 或部分(例如，CHl結構域)，所述重鏈源自任何抗體同種型，例如IgG, IgA, IgE和IgM以 及同種型亞類中的任何一種，特別是IgGl和IgG4。具有這些特徵並使可變區穩定的任何合 成的或其他恆定區變異體也可以用於本發明的實施方式中。用於本發明中的結合成員可標記有可檢測或功能性標記物。標記物可以為任何產 生或可以經誘導產生信號的分子，包括但不限於螢光劑、放射性標記、酶、化學發光劑或光 敏劑。因此，可通過檢測螢光或發光、放射性、酶活性或光吸收度來檢測和/或測量結合。可 利用本領域中已知的常規化學方法將可檢測標記物連接於用於本發明中的抗體。存在多種方法，藉助這些方法該標記物可以生成利用外在方法例如通過肉眼觀 察、電磁輻射、加熱和化學試劑可檢測的信號。所述標記物還可結合於另一種結合成員，其 結合用於本發明中的抗體，或結合於支持物。已標記的結合成員例如標記有可檢測標記物的scFv，可用於體內、離體或體外診 斷和/或治療。例如，放射標記的結合成員(例如，結合於同位素的結合成員)可用於放射診斷和 放射治療中。可結合於本發明中所用結合成員的放射性同位素包括諸如94mTc、99mTc、186Re、 188Re、2°3Pb、67Ga、68Ga、47SC、mIn、97RU、62CU、64CU、86Y、88Y、9°Y、121Sn、161Tb、153Sm、166H0、1(l5Rh、177LU、 123I、124I、125I 和 131I 的同位素。例如，用於本發明中的標記有可檢測標記物的結合成員可用來檢測、診斷或監測 人或動物體內的類風溼性關節炎。本發明的結合成員可用於製備用於診斷類風溼性關節炎的診斷性產品。本發明提供了一種檢測或診斷人或動物體內的類風溼性關節炎的方法，包括(a)向人或動物給予本發明的結合成員，例如標記有可檢測標記物的結合成員，該 標記物結合纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED-A，以及(b)確定在人或動物體的新血管系統內是否存在結合成員；其中該結合成員定位 於人或動物體內的新血管系統(neovasculature)表示存在類風溼性關節炎。在該結合成員標記有可檢測標記物的情況下，該可檢測標記物的存在與否可通過 檢測該標記物來確定。本發明中使用的結合成員與可對損傷內靶細胞發揮殺生物、細胞毒性免疫抑制或 抗炎效應的分子以及針對這些損傷中所存在的細胞外基質組分的抗體之間的結合物或融 合物可應用於本發明中。例如，結合的分子尤其可以為白介素-10、抗炎或其他藥物、光敏劑 或放射性核素。這樣的結合物治療上可用於例如治療如本文中提到的類風溼性關節炎。結合成員與殺生物性或細胞毒性分子的融合物或結合物的生成和用途例如描述 在TO01/62298中，其結合於此供參考。本發明提供了一種治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予個體治療有效量 的包含用於本發明中的結合成員的藥物。該結合成員可以為(i)通過細胞相互作用對靶細胞發揮抗炎效應的分子、抗炎性 分子、IL-10、TGFii或其他藥物，與(ii)用於纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的 ED-A的結合成員的結合物。
該結合成員可以為(i)發揮免疫抑制或抗炎效應的分子，與(ii)用於纖連蛋白的 ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED-A的結合成員的結合物。該結合成員可以為(i)白介素_10(IL 10)或TGFii，與(ii)用於纖連蛋白的ED-A 同種型和/或纖連蛋白的ED-A的結合成員的結合物。這樣的結合成員在本文所披露的本 發明與治療類風溼性關節炎相關的方面中非常有用。本發明提供了用於本發明中的結合成員在製備用於治療類風溼性關節炎的藥物 中的應用。該結合成員可結合或融合於如本文所述的發揮殺生物性、細胞毒性、免疫抑制性 或抗炎效應的分子。該結合成員可以為(i)通過細胞相互作用對靶細胞發揮殺生物性或細 胞毒性效應或者具有免疫抑制或抗炎效應的分子，與(ii)用於根據本發明的人纖連蛋白 的結合成員的結合物。本文中還描述了(i)通過細胞相互作用、或免疫抑制或抗炎效應對靶細胞發揮殺 生物性或細胞毒性效應的分子，與(ii)用於本發明所用的人纖連蛋白的結合成員的結合 物。這樣的結合物優選包括融合蛋白，其包含該殺生物性、細胞毒性、免疫抑制性或抗炎性 分子以及所述結合成員，或者，在該結合成員為雙鏈或多鏈的情況下，融合蛋白包含該殺生 物性、細胞毒性、免疫抑制性或抗炎性分子以及所述結合成員的多肽鏈組分。優選地，該結 合成員是單鏈多肽，例如單鏈抗體分子，如ScFv。包括免疫抑制性或抗炎性分子和單鏈Fv抗體分子的融合蛋白可以用於本發明 中。通過細胞相互作用對靶細胞發揮其效應的免疫抑制性或抗炎性分子可與靶細胞 直接相互作用，可與靶細胞上的膜結合受體相互作用，或者幹擾細胞膜的電化學電位。在一 個示例性的優選實施方式中，該分子是IL-10。如下文進一步討論的，該特異性結合成員優選為抗體，或包含抗體的抗原結合位 點。方便地，該特異性結合成員可以為單鏈多肽，如單鏈抗體。這樣可允許方便生產包含單 鏈抗體以及免疫抑制性或抗炎性分子(例如白介素-10或者TGFii)的融合蛋白。抗體的 抗原結合位點可藉助於獨立多肽中，例如全抗體中或抗體片段如Fab或雙體抗體中的抗體 VH結構域與抗體VL結構域的結合來提供。在該特異性結合成員是雙鏈或多鏈分子(例如， 分別為Fab或全抗體)的情況下，免疫抑制性或抗炎性分子可結合為在特異性結合成員中 含一種或多種多肽鏈的融合多肽。該結合成員可通過肽鍵與免疫抑制性或抗炎性分子結合，即在融合多肽 內包含所述分子以及該特異性結合成員或其多肽鏈組分(參見例如，Trachsel et al.)。其他用於結合的方式包括化學結合，特別是利用雙功能試劑的交聯(例如，採用 DOUBLE-REAGENTS Cross-linking Reagents Selection Guide，Pierce)。本文中還描述了編碼用於本發明中的結合成員的分離核酸。核酸可包括DNA和/ 或RNA。核酸可編碼CDR或CDR組或者VH結構域或VL結構域或者抗體的抗原結合位點或 者抗體分子，例如scFv或IgG，例如IgGl，如上文所定義的。該核苷酸序列可編碼本文披露 的VH和/或VL結構域。本文進一步描述了質粒、載體、轉錄盒或表達盒(框)形式的構建體，其包含至少 一個如上文所述的多核苷酸。
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還描述了包含如上所述的一個或多個構建體的重組宿主細胞。描述了編碼任何 CDR或CDR組或者VH結構域或VL結構域或者抗體的抗原結合位點或者抗體分子，如所提供 的scFv或IgGl或IgG4的核酸，這是一種生成編碼產物的方法，該方法包括從編碼核酸進 行表達。可通過在適當的條件下培養包含該核酸的重組宿主細胞來方便地實現表達。通過 表達而生成後，VH或VL結構域或者結合成員可利用任何合適的技術進行分離和/或純化， 然後適當時進行應用。核酸可包括DNA或RNA，並且可全部或部分為合成的。提到如本文所列出的核苷酸 序列時，涵蓋具有特定序列的DNA分子，並且涵蓋具有特定序列的RNA分子，其中U代替T， 除非上下文中以其它方式要求。還描述了一種生成抗體VH可變域的方法，該方法包括從編碼核酸進行表達。這樣 的方法可包括在用於生產所述抗體VH可變域的條件下培養宿主細胞。生產方法可包括分離和/或純化產物的步驟。生產方法可包括將該產物配製成包 含至少一種另外的組分如藥用賦形劑的組合物。用於在多種不同宿主細胞中克隆並表達多肽的系統是眾所周知的。合適的宿主細 胞包括細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、絲狀真菌、酵母菌和杆狀病毒系統以及轉基因植物 和動物。本領域中已經很好的建立了抗體和抗體片段在原核細胞內的表達。對於綜述，參 見例如PlUckthun 1991。常見的細菌宿主是大腸桿菌(E. coli)。對於本領域中的技術人員而言，在培養的真核細胞中表達也可作為一種用於生產 結合成員的選擇，例如 Chadd & Chamow (2001)，Andersen & Krummen (2002)，Larrick & Thomas (2001)。本領域中可獲得的用於表達異源多肽的哺乳動物細胞系包括中華倉鼠卵巢 (CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞、NSO小鼠黑色素瘤細胞、YB2/0大鼠骨髓瘤細胞、人 胚腎細胞、人胚視網膜細胞等。可選擇或構建合適的載體，包含適當的調節序列(包括啟動子序列、終止子序列、 多腺苷酸序列、增強子序列)、標誌物基因以及適當時的其他序列。載體可以為質粒，例如噬 菌粒或病毒，例如適當時的噬菌體。進一步的細節參見例如Sambrook & Russell (2001)。 許多已知的用於操作核酸的技術和流程，例如在製備核酸構建體時，誘變、測序、將DNA引 入到細胞內和基因表達以及蛋白分析詳細地描述在Ausubel 1999中。宿主細胞可包含如本文所述的核酸。這樣的宿主細胞可處於體外且可為培養細 胞。這樣的宿主細胞可處於體內。體內存在宿主細胞可實現用於本發明中的結合成員在細 胞內表達為「內抗體(intrabodies)」或細胞內抗體。內抗體可用於基因治療。還描述了一種包括將本文所披露的核酸引入到宿主細胞內的方法。該引入可採用 任何可獲得的技術。對於真核細胞而言，合適的技術可包括磷酸鈣轉染、DEAE-Dextran(葡 聚糖)、電穿孔術、脂質體介導的轉染以及利用逆轉錄病毒或其他病毒例如牛痘苗(或者， 對於昆蟲細胞則為杆狀病毒)進行轉導。將核酸引入到所述宿主細胞內，特別是真核細胞 內可採用基於病毒或質粒的系統。質粒系統可以以附加體形式保持或者可摻入宿主細胞內 或摻入人工染色體內。摻入可以為在單個或多個基因座隨機或定向整合一個或多個拷貝。 對於細菌細胞，合適的技術可包括氯化鈣轉化法、電穿孔法以及利用噬菌體的轉染。引入後可以是通過例如在用於基因的表達的條件下培養宿主細胞而引起或允許 從該核酸表達。表達的產物的純化可通過本領域中普通技術人員已知的方法來實現。
所述核酸可整合入該宿主細胞的基因組(例如，染色體)內。可按照標準技術通 過包括促進與基因組重組的序列而促進整合。還描述了一種方法，其包括在表達系統中利用如上文所述的構建體以便表達如上 所述的結合成員或多肽。用於本發明中的結合成員被設計成用於人或動物對象，例如人體內的診斷或治療 方法中。用於本發明中的結合成員可用於診斷或治療類風溼性關節炎。因此，本發明提供了包括給予如所提供的結合成員的治療方法、包含這樣的結合 成員的藥物組合物以及這樣的結合成員在製備用於給予的藥物中的應用，例如，在製備藥 物或藥物組合物的方法中，包括將結合成員與藥用賦形劑一起配製。藥用載體是眾所周知 的，並且作為所選的(一種或多種)活性化合物的性質和給予模式的函數，將由本領域中的 技術人員進行調整。用於本發明中的結合成員通常將以藥物組合物的形式給予，藥物組合物可包含至 少一種除該結合成員之外的組分。因此，除了活性成分之外，根據本發明的並按照本發明使 用的藥物組合物還可包括藥用賦形劑、載體、緩衝液、穩定劑或者其他為本領域技術人員所 熟知的材料。這樣的材料應該是無毒的並且不應幹擾活性成分的功效。所述載體或其他材 料的具體性質將依賴於給予途徑，其可以為口服、吸入或通過注射，例如靜脈內注射。用於口服給予的藥物組合物，例如納米抗體等也設想在本發明之內。這樣的口服 製劑可以為片劑、膠囊、粉末、液態或半固態形式。片劑可包含固態載體如明膠或佐劑。液 態藥物組合物通常包含液態載體，如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油。還可包含生 理鹽水溶液、右旋糖或其他糖溶液或者二醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。對於靜脈內注射，或在痛苦部位進行注射，活性成分將為腸外可接受的水溶液的 形式，其不含熱原並且具有合適的PH、等張性和穩定性。本領域中的相關技術人員能夠利用 例如等張載體，如氯化鈉注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液來很好地製備合適的溶 液。如有必要，可採用防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑和/或其他添加劑。許多用於製備 藥物製劑的方法對於本領域技術人員來說是已知的，參見例如Robinson，1978。組合物可單獨給予或者與其他治療同時或依次聯合給予，或者作為與另一種治療 劑或多種其他治療劑的聯合製劑而給予，取決於待治療的病症。用於本發明中的結合成員可用作與另外的藥物組分結合的聯合治療的一部分。聯 合治療可用來提供顯著的協同效應，特別是用於本發明中的結合成員與一種或多種藥物的 聯合。用於本發明中的結合成員可與另一種治療劑或多種其他治療劑同時或依次給予，或 者作為與另一種治療劑或多種其他治療劑的聯合製劑而給予，用於治療本文所列出的一種 或多種病症。例如，用於本發明中的結合成員可與現存治療劑組合使用來治療類風溼性關節 炎。用於治療類風溼性關節炎的現存治療劑包括IL-10、TGF^、光敏劑和細胞毒性藥 物。用於本發明中的結合成員以及上述另外的藥物組分中的一種或多種可用於製備 藥物。該藥物可用於單獨或聯合給予個體，因此可包括所述結合成員以及所述另外的組分， 作為聯合製劑或者作為單獨的製劑。使用單獨的製劑可以有助於單獨並依次或同時給予，
21並且允許通過不同的途徑，例如口服和腸外給予，而給予所述組分。按照本發明，所提供的組合物可給予哺乳動物。可以以「治療有效量」給予，該量 足以顯示對患者的益處。這樣的益處可為至少緩解至少一種症狀。因此，「治療類風溼性關 節炎」是指緩解至少一種症狀。所給予的實際量以及給予速率和時程將依賴於正在治療疾 病的性質和嚴重程度、正在治療的特定哺乳動物、個體患者的臨床病症、疾病的起因、組合 物的遞送部位、結合成員的類型、給予方法、給予時間安排以及藥物醫師已知的其他因素。 治療的處方，例如劑量決定等，在全科醫師和其他醫師的負責範圍內，並且可以依賴於症狀 的嚴重程度和/或正治療疾病的進展。適當的抗體劑量在本領域中是熟知的(Ledermarm 1991 和 Bagshawe 1991)。可以使用本文或 Physician' s Desk Reference (2003)中指出 適於所給予藥物類型的特定劑量。可通過比較其體外活性和動物模型中的體內活性來確定 用於本發明中的結合成員的治療有效量或合適的劑量。用於將小鼠和其他測試動物中的有 效劑量外推至人的方法是已知的。具體的劑量將依賴於多個因素，包括該抗體用於診斷、預 防還是用於治療，待治療區域的大小和位置，抗體(例如，全抗體、片段或雙體抗體)的具體 性質以及任何可檢測標記物或其他連接於抗體的分子的性質。典型的抗體劑量對於全身性 應用來說將在100μ g至Ig的範圍內，對於局部應用來說在1 μ g至Img的範圍內。初始可 給予較高的負荷量，隨後是一次或多次較低的劑量。抗體可以為全抗體，例如IgGl或IgG4 同種型。這是用於成年患者的單次治療的劑量，對於兒童和嬰兒可以按比例調整，並且對於 其他抗體形式還可按照分子量成比例調整。治療可以以每天一次、每周兩次、每周一次或每 月一次的間隔重複，由醫師決定。對於皮下給予，治療可以為每兩周至四周一次，而對於靜 脈內給予，可為每四周至八周一次。在本發明的一些實施方式中，治療是周期性的，並且給 予之間的周期為約2周或更長，例如約3周或更長，約4周或更長，或約每月一次。在本發 明的其他實施方式中，治療可以在手術之前和/或手術之後給予，並且可直接在手術治療 的解剖部位給予或施加。鑑於本披露內容包括下列實驗範例，本發明的其他方面和實施方式對於本領域技 術人員來說將是顯而易見的，實驗結果人關節炎樣本的組織化學分析纖連蛋白結構域EDA和EDB以及結合腕蛋白_C (tenascin-C)結構域Al和C的表 達分別利用F8、L19、F16和Gll抗體通過免疫組織化學在人關節炎樣本上進行研究。在圖1中，較深的染色表示各個抗原的表達(用白色箭頭指出)。抗EDA抗體F8 導致最強的染色，因此利用該抗體進行所有進一步的實驗。利用F8抗體進行的免疫螢光實驗表明一種滿意的血管周圍染色(圖2中可見為 白色結構)。人單克隆抗體F8選擇性積累在小鼠體內的關節炎部位利用用於抗體檢測的螢光和放射性，我們研究了小抗體形式(SIP) (Borsi et al. 2002)的F8在CIA小鼠模型(Courtney et al. 1980)中的體內靶向性能。該SIP形式 由scFv抗體片段而構成，該片段連接於人IgE的CH4結構域，從而產生一種大小為SOkDa 的同源二聚體蛋白。
關節炎小鼠注射標記有近紅外染料Alexa 750的SIP(FS)。靜脈內注射後24小 時，動物利用紅外螢光成像儀(Birchler et al. , 1999)進行成像，揭示抗體較強且選擇性 地積累在關節炎肢體中存在的損傷內，可見為白色發光的腳爪，在小鼠前爪中存在一些2 級腫脹。靜脈內注射放射性標記有125I的SIP (F8)後24小時，處死小鼠，並利用放射自顯影 (感光成像)對腳爪進行成像。在注射SIP(FS)小鼠的發炎肢體內觀察到了放射性的優先 積累，在放射自顯影內可見為黑色染色。一隻腳爪表現出關節炎評分為2 (整個腳爪腫脹)。 另一隻腳爪分類為1級關節炎(單個指頭腫脹)。抗ED-A抗體-白介素-10融合體的活性將scFv形式的抗體分子F8與白介素-IO(IL-IO)結合在融合蛋白內。在測定誘 導MC/9細胞的IL-4依賴性增殖的能力的分析(Thompson et al. , 1991)中，比較該融合蛋 白與人IL-10的生物學活性。結果示於圖8(d)中。材料和方法 在人關節炎樣本上進行免疫組織化學分析將人關節炎樣本的冰凍切片在冰冷丙酮中固定10』，用胎牛血清封閉30』，並對新 血管系統的標誌物(纖連蛋白ED-A和ED-B，結合腕蛋白(TenascirO-C結構域Al和C)進 行染色。以10 μ g/ml的濃度使用F8、L19、F16和Gll抗體作為myc標記的scFv並孵育lh。 將第一抗體與濃度為7yg/ml的抗myc抗體9E10共孵育。作為第三檢測抗體，兔抗小鼠 IgG抗體(Dako，丹麥)和APAAP小鼠單克隆(Dako，丹麥)分別以5和50 μ g/ml的濃度使 用，每一種均達lh。使用固紅片劑(Sigma，瑞士)來進行染色孵育15』。切片用蘇木素復染 2』，用水清洗，用甘油膠(glycergel)封固劑(Dako，丹麥)封片，並利用Axiovert SlOO TV 顯微鏡(Zeiss，瑞士)進行分析。人關節炎樣本上的免疫螢光分析將人關節炎樣本的冰凍切片在冰冷丙酮中固定10』，用胎牛血清封閉30』，並對纖 連蛋白的EDA結構域進行染色。F8抗體作為myc標記的scFv以10 μ g/ml的濃度使用並孵 育lh。將第一抗體與濃度為7 μ g/ml的抗myc抗體9E10共孵育。作為第三檢測抗體，螢光 抗小鼠Alexa 596抗體(Molecular Probes，丹麥)以10 μ g/ml的濃度均使用lh。切片用 Hoechst 33342復染，用甘油膠(glycergel)封固劑(Dako，丹麥)封片，並利用AxioScop 2M0T+顯微鏡(Zeiss，瑞士)進行分析。動物模型通過在尾巴根部皮內注射用相等體積的弗氏完全佐劑(MDBiosciences)乳化的 200 yg II型牛膠原(MD Biosciences)來免疫雄性DBA/1小鼠(8_12周齡)。首次免疫後 2周，重複該步驟，但採用不完全弗氏佐劑(MD Biosciences)來乳化膠原。每天觀察小鼠， 並且指定1個或多個肢體中表現出紅斑和/或腳爪腫脹的每隻小鼠進行成像或治療研究。利用2個疾病指數(臨床評分和腳爪腫脹)監測關節炎。對於臨床評分，每天一 次以非盲方式對每個肢體進行分級(0 =正常，1 =同一肢體的1個或多個指頭腫脹，2 =整 個腳爪腫脹)，每隻動物得到的最大可能評分是8。在異氟烷麻醉下，每隔一天利用測徑器 測量每一個肢體的厚度來評價腳爪腫脹。全部4隻腳爪的平均值指定為每一隻動物的腳爪 厚度。
關節炎腳爪的近紅外成像通過近紅外圖像分析來測試SIP(FS)在關節炎小鼠內的選擇性積累，如Birchler et al. (1999)所描述的。簡單而言，按照生產商的建議，用Alexa750 (MolecularProbes， Leiden，荷蘭)標記純化的SIP (F8)，並將100 μ g已標記的蛋白注射入關節炎小鼠的尾靜脈 內。注射後24小時，用氯胺酮(ketamirOSOmg/kg和美託咪定0.2mg/kg麻醉小鼠，並在近 紅外小鼠成像系統中成像(Trachsel et al. 2007 ；Birchler et al. 1999)。生物分布實驗如前面所描述的，通過生物分布分析來評估SIP(FS)在關節炎小鼠體內的體內靶 向性能(Borsi et al. 2002 ；Tarli et al.，1999)。簡單而言，將純化的SIP(F8)進行放射 性碘標記，並將IOyg的蛋白(相對於IluCi 125I)注射入關節炎小鼠的尾靜脈內。注射後 24小時處死小鼠，並將腳爪暴露1小時，並如前所述(Trachsel et al. 2007)在磷光成像儀 (phosphorimager) (Fujifilm BAS-5000)巾 .。抗體抗ED-B抗體片段scFv(L19)的分離先前已經描述過(Pini etal. 1998)。利用已 公開的步驟(Giovannoni，Nucleic. Acid Research, 2001, 29 (5) :E27)，從 ETH-2 文庫中分 離母本抗ED-A抗體。在以下部分將描述母本抗ED-A抗體的親和力成熟，其可產生高親和 力的抗ED-A抗體。母本抗ED-A抗體的親和力成熟母本抗ED-A抗體(一種來自ETH-2的抗體)用作用於構建親和力成熟文庫的 模板。利用部分簡併的引物 5 『 -CTGGAGCCTGGCGGACCCAGCTCATMNNMNNMNNGCTAAAGGTGAAT CCAGA-3 『 (SEQ ID NO 17)(用於 VH)和 5 『 -CCAGGTTTCTGCTGGTACCAGGCTAAMNNMNNMNNG CTAACACTCTGACTGGCCCTGC-3 『 (SEQ ID NO 18)(用於 VL)(所有寡核苷酸均購自 Operon Biotechnologies, Cologne，德國)，在一個可在 VH CDRl 的位置 31、32 和 33 以及 VL CDRl 的位置31、31a和32產生隨機突變的過程中通過PCR引入文庫的VH⑶Rl (DP47種系)和 VL CDRl (DPK22 種系)中的序列變異性。利用引物 LMB31ong(5' -CAGGAAACAGCTATGACCAT GATTAC-3『 ) (SEQID NO :19)和 fdseqlong(5' -GACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3『) (SEQ ID NO :20)，並利用凝膠純化的VH和VL節段作為模板，通過PCR組裝將VHVL組合裝 配成ScFv形式。將組裝的VH-VL片段用NcoI/NotI進行雙重消化，並克隆入NcoI/NotI消 化的 PHEm 噬菌粒載體中(Hoogenboom et al.，1991)。按照(Viti et al.，2000)，將所得 到的連接產物電穿孔進入電感受態大腸桿菌(E. coli)TG-l細胞中，得到一個包含1. 5X IO7 個獨立抗體克隆的文庫，篩選以改善的親和力結合ED-A的抗體。抗ED-A抗體的選擇利用BIAcore分析，篩選上文所述的抗體文庫中以比母本抗ED-A抗體較高的親和 力結合ED-A的抗體。BIAcore分析中應用的抗原(11A12)包含人纖連蛋白的ED-A結構域， 並且具有以下胺基酸序列(SEQ ID N0 120)MRSYRTEIDKPSQMQVTDVQDNSISVKWLPSSSPVTGYRVTTTPKNGPGPTKTKTAGPDQTEMTIEGLQPTVEYVVSVYAQNPSGESQPLVQTAVTNIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESPQGQVSRYRVTYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPLIGTQSTAIPAPTDLKFTQVTPTSLSAQWTPPNVQLTGYRVRVTPKEKTGPMKEINLAPDS
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SSVVVSGLMVATKYEVSVYALKDTLTSRPAQGVVTTLENVRSHHHHHH抗原(11A12)的核苷酸序列(SEQ ID N0:121)如下atgagatcctaccgaacagaaattgacaaaccatcccagatgcaagtgaccgatgttcaggacaaCagcattagtgtcaagtggctgccttcaagttcccctgttactggttacagagtaaccaccactcCcaaaaatggaccaggaccaacaaaaactaaaactgcaggtccagatcaaacagaaatgactattGaaggcttgcagcccacagtggagtatgtggttagtgtctatgctcagaatccaagcggagagagTcagcctctggttcagactgcagtaaccaacattgatcgccctaaaggactggcattcactgatgTggatgtcgattccatcaaaattgcttgggaaagcccacaggggcaagtttccaggtacagggtgAcctactcgagccctgaggatggaatccatgagctattccctgcacctgatggtgaagaagacacTgcagagctgcaaggcctcagaccgggctctgagtacacagtcagtgtggttgccttgcacgatgAtatggagagccagcccctgattggaacccagtccacagctattcctgcaccaactgacctgaagTtcactcaggtcacacccacaagcctgagcgcccagtggacaccacccaatgttcagctcactggAtatcgagtgcgggtgacccccaaggagaagaccggaccaatgaaagaaatcaaccttgctcctgAcagctcatccgtggttgtatcaggacttatggtggccaccaaatatgaagtgagtgtctatgctCttaaggacactttgacaagcagaccagctcagggagttgtcaccactctggagaatgtcagatctcatcaccatcaccatcactaa利用5』和3』處分別含BamHI和BglII限制性酶切位點的引物通過PCR擴增抗原 的核苷酸序列。將所得到的PCR產物和載體pQE12 (QIAGEN)用BamHI和BglII限制性內切 酶進行消化，隨後在插入片段載體的比率為3 1的反應中進行連接。將得到的載體進行 測序以核實序列是否正確。抗原製備將IOml 2TY，Amp，葡萄糖中的TGl電感受態預培養物在存在1 μ 1的11Α12的 DNA小量製備物的情況下進行電穿孔。隨後將該預培養物稀釋1 100 (8ml稀釋入800ml 2TY，Amp，0. 葡萄糖)並生長至0. 4-0. 6的0D600，隨後用IPTG誘導過夜。第二天，將 細胞旋轉下來並過濾上清(Millipore 0. 22 μ m)。將培養液離心並澄清後，利用Hitrap柱 在FPLC上純化11A12。Ni/柱如下進行再生用5倍柱體積(CV)的H2O清洗柱，接著施加 3CV 0. 5M EDTA/0. 2MTris pH 8以將舊鎳從柱中洗出。接著用5CV H2O清洗柱。隨後用2CV IOOmM NiSO4重新裝載柱，接著用幾CV的H2O清洗柱。隨後用5CV裂解緩衝液(20mM咪唑 /250mM NaCl/PBS pH 7.4)平衡柱。過濾(Millipore 0. 45 μ m)細胞裂解物並裝載到柱上 (手工)。隨後將柱裝回FPLC上，並使裂解緩衝液保持流動直至UV信號穩定(恆定)，約 3CV。然後啟動洗脫程序5CV中的0%-100%的梯度洗脫緩衝液(400mM咪唑ΛδΟπιΜ NaCl/ PBS pH 7.4)。收集包含洗脫的抗原的流分，並在PBS中透析過夜。 抗ED-A抗體的表達和純化 抗ED-A抗體如下進行表達和純化將IOml 2ΤΥ，Amp，葡萄糖中的TGl電感受 態預培養物在存在ι μ 1的抗ED-A抗體之一的DNA小量製備物的情況下進行電穿孔。隨後 將該預培養物稀釋1 100 (8ml稀釋入800ml 2TY，Amp，0. 葡萄糖)並生長至0. 4-0. 6的 0D600，隨後用IPTG誘導過夜。第二天，將細胞旋轉下來並過濾上清(Millipore 0. 22 μ m)。 該ScFv在Protein A-S印harose柱上純化，並用三乙胺從柱上洗脫ScFv。將包含洗脫出的 ScFv的流分在PBS中在4°C下透析過夜。然後將該ScFv流分置於Superdex 75柱上，PBS
25以0. 5ml/min的速度流動，並收集0. 25ml流分。該單體流分用於BIAcore分析。BIAcore 分析 1BIAcore 晶片用 HBS-EP 緩衝液 BIAC0RE 、0. OlM HepespH 7. 4,0. 15M NaCl、3mM EDTA、0.005%表面活性劑P20(用於該分析的相同緩衝液)以5 μ 1/min的流速衝洗過夜。 將抗原(11A12)在醋酸鹽緩衝液(pH 4. 0)中稀釋至50 μ g/ml的濃度，並通過注射50 μ 1 的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)與乙基-N-( 二甲基氨丙基)-碳二亞胺(EDC)的混合物激活 晶片上的COOH基團。將40 μ 1的11Α12抗原注射在晶片上，並用30 μ 1的乙醇胺封閉殘留 的游離COOH基團。在0. 22 μ m過濾後，將20 μ 1的每一種細菌上清注射在晶片上，並實時 監測與抗原的相互作用。BIAcore 分析 2利用表面等離子體共振來評估母本抗ED-A抗體以及抗ED-A抗體B2、C5、D5、C8、 F8、B7和G9的k。n、k。ff和Kdo該晶片用這種分析中所用的同一緩衝液以5 μ 1/min的緩衝 液流速平衡過夜。整個塗布過程也以該流速進行。用醋酸鹽緩衝液PH 4. 00 (由BIACORE 提供)將抗原11A12稀釋1 25至20 μ g/ml的最終濃度。然後混合NHS和EDC，並注射 50 μ 1以激活CM5晶片上的COOH基團。其後注射40 μ 1的抗原(這持續約40」)。然後注 射30 μ 1的乙醇胺以便封閉最終游離的COOH的反應性。每一個樣品均以20μ 1/min的流速進行分析。注射20 μ 1的未稀釋的單體蛋白 (因為其來自凝膠過濾)。解離時間持續約200」。然後注射10μ1的HCllOmM以再生該芯 片。以不同稀釋度即1 2稀釋(在PBS中)重複單體蛋白的注射，然後用HCl進行再生。 這之後以1 4的稀釋度第三次注射該蛋白，並再次用HCl進行再生。利用BIA評估軟體 來評價每一抗ED-A抗體的k。n、k。ff和KD值。抗ED-A抗體的選擇BIAcore 分析 1BIAcore 分析針對每種抗ED-A抗體均生成一個曲線圖，分析該曲線圖以如下推 導抗體對該抗原的親和力每一個曲線圖的X軸對應於時間，而y軸對應於共振單位(一種 表示所測抗體對塗布在BIAcore 晶片上的抗原的結合親和力的度量)。每一個曲線圖均 展示出3個峰和1個谷，這對應於緩衝液的變化，因此與結果的解釋無關。每一個曲線圖的上升部分均表示結合期。在該部分曲線圖中曲線越陡，則抗體與 抗原的結合越快。每一個曲線圖的下降部分均表示抗體從抗原的解離期。在該部分曲線圖 中曲線越平坦，則抗體從抗原的解離越慢。與其所起源的母本抗ED-A抗體相比，抗ED-A抗體HI、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、 B7、E8和G9都表現出為較平坦的解離曲線，表明它們以比母本抗ED-A抗體更大的親和力 結合ED-A，因此也結合A-FN。在所測試的全部抗ED-A抗體中，抗體E5、Fl、F8和Hl的曲 線圖表現出最平坦的解離曲線。抗體H1、C5、D5、E5、C8、F8和Fl的結合曲線比針對母本抗 ED-A抗體所觀察到的結合曲線較平坦，但針對抗體B2、B7、E8和G9觀察到的結合曲線與針 對母本抗ED-A抗體所觀察到的結合曲線一樣陡。然而，由於IPTG誘導的大腸桿菌(E. coli) TG-I 細胞的細菌上清液用於抗體 HI、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8 和 G9 的 BIAcore 分析，因此雖然所測試的抗體樣品的濃度未知，但最有可能低於用於比較的母本抗ED-A抗 體樣品的濃度。因此，由於用於BIAcore 分析的樣品中的抗體濃度較低，因此抗體H1、B2、
26C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9的結合曲線可能人為地較低。然而，由於在BIAcore 分 析中，濃度不會顯著影響抗體從其靶抗原中解離，因此針對抗體HI、B2、C5、D5、E5、C8、F8、 FU B7、E8和G9所觀察到的平坦解離曲線表明這些抗體以至少與母本抗ED-A抗體相等且 可能較高的親和力結合ED-A。BIAcore 分析 2利用BIA評估(BIAevaluation)軟體來評估每一種抗ED-A抗體的k。n、k。ff和KD 值。用於抗原11A12的母本抗ED-A抗體和抗ED-A抗體B2、C5、D5、C8、F8、B7和G9的k。n、 < 和KD值詳細列於表2中。與它們所起源的母本抗ED-A抗體相比，抗ED-A抗體B2、C5、 D5、C8、F8、B7和G9都具有更好的Kd值，表明它們以比母本抗ED-A抗體更大的親和力結合 ED-A,因此也結合A-FN。序列抗ED-A 抗體 Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8 和 G9 是所有 ScFv 抗體，並且均 利用常規方法進行測序。抗ED-A抗體Hl的核苷酸序列示於圖3中。抗ED-A抗體Hl的氨 基酸序列示於圖4中。優選的編碼抗ED-A 抗體 B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8 和 G9 的 VH 和 / 或 VL 的 核苷酸序列等同於編碼抗ED-A抗體Hl的VH和/或VL的核苷酸序列，只是編碼輕鏈(VL) 和重鏈(VH)的HlCDRl的核苷酸序列用表1中列出的編碼各個抗體的輕鏈(VL)和重鏈(VH) CDRl的核苷酸序列代替。優選的編碼抗ED-A抗體scFv F8雙體抗體的VH和/或VL的核苷酸序列等同於編 碼抗ED-A抗體Hl的VH和/或VL的核苷酸序列，只是編碼輕鏈(VL)和重鏈(VH)的HlCDRl 的核苷酸序列用表1中列出的編碼抗ED-A抗體F8的輕鏈(VL)和重鏈(VH)CDRl的核苷酸 序列代替。優選的編碼連接抗ED-A scFv F8雙體抗體的VH和VL的連接物的核苷酸序列 是 gggtccagtggcggt(SEQ IDNO 29)。抗ED-A 抗體 B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8 和 G9 具有與抗 ED-A 抗體 Hl 相同的 胺基酸序列，只是輕鏈(VL)和重鏈(VH)的Hl CDRl的胺基酸序列用表1中列出的各個抗 體的輕鏈(VL)和重鏈(VH)⑶Rl的胺基酸序列代替。抗ED-A scFv F8雙體抗體的胺基酸 序列與抗ED-A抗體Hl的胺基酸序列相同，只是輕鏈(VL)和重鏈(VH)的Hl CDRl的氨基 酸序列用表1中列出的抗ED-A抗體F8的輕鏈(VL)和重鏈(VH)CDRl的胺基酸序列代替， 並且Hl中連接物的胺基酸序列用連接物胺基酸序列GSSGG (SEQ ID NO 28)代替。抗ED-A抗體B2 VH結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 21)等同於抗ED-A抗體Hl 的VH結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO 23代替Hl的VH⑶R1。抗ED-A抗體C5 VH結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 41)等同於抗ED-A抗體Hl 的VH結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO 43代替Hl的VH⑶R1。抗ED-A抗體D5 VH結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 51)等同於抗ED-A抗體Hl 的VH結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO 53代替Hl的VH⑶R1。抗ED-A抗體E5 VH結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 61)等同於抗ED-A抗體Hl 的VH結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO 63代替Hl的VH⑶R1。抗ED-A抗體C8 VH結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 71)等同於抗ED-A抗體Hl 的VH結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO 73代替Hl的VH⑶R1。
抗ED-A抗體F8 VH結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 81)等同於抗ED-A抗體Hl 的VH結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO :83代替Hl的VH CDRl。抗ED-A F8雙體抗體 的VH結構域具有與抗ED-A抗體F8的VH結構域相同的胺基酸序列(即，SEQID NO 81)。抗ED-A抗體Fl VH結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 91)等同於抗ED-A抗體Hl 的VH結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO 93代替Hl的VH⑶R1。抗ED-A抗體B7 VH結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 101)等同於抗ED-A抗體Hl 的VH結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO 103代替Hl的VH⑶R1。抗ED-A抗體E8 VH結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 111)等同於抗ED-A抗體Hl 的VH結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO 113代替Hl的VH⑶R1。抗ED-A抗體G9 VH結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 31)等同於抗ED-A抗體Hl 的VH結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO 33代替Hl的VH⑶R1。抗ED-A抗體B2 VL結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 21)等同於抗ED-A抗體Hl 的VL結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO 26代替Hl的VL⑶R1。抗ED-A抗體C5 VL結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 42)等同於抗ED-A抗體Hl 的VL結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO 46代替Hl的VL⑶R1。抗ED-A抗體D5 VL結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 52)等同於抗ED-A抗體Hl 的VL結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO 56代替Hl的VL⑶R1。抗ED-A抗體E5 VL結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 62)等同於抗ED-A抗體Hl 的VL結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO 66代替Hl的VL⑶R1。抗ED-A抗體C8 VL結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 72)等同於抗ED-A抗體Hl 的VL結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO 76代替Hl的VL⑶R1。抗ED-A抗體F8 VL結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 82)等同於抗ED-A抗體Hl 的VL結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO :86代替Hl的VL CDRl。抗ED-A F8雙體抗體 的VL結構域具有與抗ED-A抗體F8的VL結構域相同的胺基酸序列(即，SEQ IDNO 82)。抗ED-A抗體Fl VL結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 92)等同於抗ED-A抗體Hl 的VL結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO 96代替Hl的VL⑶R1。抗ED-A抗體B7 VL結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 102)等同於抗ED-A抗體Hl 的VL結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO 106代替Hl的VL⑶R1。抗ED-A抗體E8 VL結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 112)等同於抗ED-A抗體Hl 的VL結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO 116代替Hl的VL⑶R1。抗ED-A抗體G9 VL結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO 32)等同於抗ED-A抗體Hl 的VL結構域的胺基酸序列，只是用SEQ IDNO 36代替Hl的VL⑶R1。可選地，抗ED-A抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8、G9和scFv F8 雙體抗 體的VH結構域的第5位的胺基酸可以是亮氨酸殘基(L)而非纈氨酸殘基(V)，如圖4A中 所示。此外，或者可替換地，抗 ED-A 抗體 HI、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8、G9 和 scFv F8雙體抗體的VL結構域的第18位的胺基酸可以是精氨酸殘基(R)而非賴氨酸殘基(K)， 如圖4C中所示。F8-IL10的克隆、生產和鑑定人IL-10基因利用下列引物序列通過PCR進行擴增
反向的反義引物，5 『 -TCGGGTAGTAGCTCTTCCGGCTCATCGTCCAGCGGCAGCCCAGGCCAGGGCACC-3『，以及正向的正義引物，5' -TTTTCCTTTTGCGGCCGCtcattaGTTTCGTATCTTCATTGTCATGTA-3'，在其N末端懸掛15個胺基酸的連接物(SSSSG) 3的一部分，而在其C末端則懸掛 終止密碼子和NotI限制性酶切位點。編碼單鏈可變片段(F8)的DNA利用下列引物對應用信號肽進行擴增反向的反義引物，5 『 -CCCAAGCTTGTCGACCATGGGCTGGAGCC-3『以及正向的正義引物，5' -GAGCCGGMGAGCTACTACCCGATGAGGAAGAGMTTCTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTG-3'。利用該策略，在N末端插入HindIII限制性酶切位點，並且在C末端插入連接物序 列的互補部分。隨後利用PCR組裝單鏈Fv和IL_10片段，並克隆入哺乳動物細胞表達載體 pcDNA3. 1 (+)的HindIII和NotI限制性酶切位點內。CHO-S細胞用前述質粒進行穩定轉染，並在G418(0. 5g/l)存在的情況下進行選 擇。利用人纖連蛋白的重組EDA作為抗原以及用於檢測的Pr0teinA(蛋白A)，針對融 合蛋白表達，通過ELISA篩選G418抗性細胞克隆。在Protein A柱通過親和層析從細胞培養基中純化該融合蛋白。在還原和非還原條件下在SDS-PAGE上以及在天然條件下通過FPLC凝膠過濾 在Superdex S-200排阻柱上分析該融合蛋白的大小(Amersham Pharmacia Biotech, Diibendorf.瑞士 )。活性分析利用比色法MTT染料還原分析通過其誘導MC/9細胞的IL-4依賴性增殖 (Thompson-et al. , 1991)的能力來確定hILlO的生物學活性。將96孔微滴定板中每 孔10. 000MC/9 (ATCC, Manassas, USA)細胞用不同量的人ILlO處理48小時，其中每孔為 200 μ 1 的含 5pg(0. 05 單位)的鼠 IL4/ml(eBiosciences)培養基。hILlO 標準和 F8-IL10 融 合蛋白以最大lOOng/ml的ILlO當量應用，並連續稀釋。加入10 μ 1的5mg/ml MTT(Sigma) 並孵育3-5小時。隨後將細胞離心、用DMSO裂解並讀取在570nm處的吸光度。參考文獻在本說明書中任何位置引用的所有文獻，包括在上文任何位置引用的那些文獻， 其全部內容均結合於此供參考以及用於所有的目的。Amit et al. (1986)，Science，233 :747_753·Andersen et al. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:117Ausubel et al. (1999)4th eds. , Short Protocols in Molecular Biology :A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons.Bagshawe K. D. et a 1. (1991) Antibody, Immunoconjugates andRadiopharmaceuticals 4 :915_922Balza et al. (1988)，FEBS Lett.，228 :42_44·Batista et al. J. Exp. Med.，184 :2197_205，1996.Berndt et al. Histochem Cell Biol 1998,109(3) :249_255·Birchler et al. (1999), J.Immunol. Methods,231,239-248.Bird et al. (1988)Science，242，423-426Borsi et al. (1987)，J. Cell. Biol.，104，595—600·Borsi et al. (1990)，FEBS Lett.，261 :175—178.Borsi et al. (1995)，J. Biol. Chem.，270 :6243_6245·Borsi et al. (1998)，Exp. Cell Res.，240，244—251.Borsi et al. (2000) Int J Cancer, 102(1) :75_85.Brack et al. (2006), Clin.Cancer Res.，12，3200—3208·Carnemolla et al. (1989)，J. Cell. Biol.，108 :1139_1148·Caton et al. (1990)，J. Immunol.，144 1965—1968.Chadd et al. (2001), Current Opinion in Biotechnology 12:188—194Chothia et al. (1987)，J. Mol. Biol.，196 :901_917·Chothia et al. (1989)，Nature，342 :877_883·Courtney et al. (1980)Nature, 14 ；283 (5748) :666_8·Devos et al. (1983)，Nucl. Acids Res. 11 :4307_4323·ffrench-Constant (1995), Exp. Cell Res.，221，261-271.Giovannoni，Nucleic. Acid Research, 2001, 29 (5) :E27.Glennie M J et al.，1987 J. Immunol. 139,2367-2375Haan et al. (2004), BioCentury, 12(5) :A1_A6.Hanahan et al. (2000), Cell 100，57—70.Harlow and Lane, Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N. Y. , PP.726,1988Heikinheimo et al. (1991), Virchows Arch. B Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol., 61，101-109.Holliger and Bohlen 1999 Cancer and metastasis rev. 18 :411-419.Holliger et al. (1993a), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448.Holliger et al. (1993b), Current Opinion Biotechnol 4,446-449.Holt et al. (2003)Trends in Biotechnology 21,484-490.Hoogenboom et al. (1991)，Nucleic Acids Res. ，19(15)4133—7.Hu et al. (1996), Cancer Res.，56，3055-3061·Huston et al. (1988)PNAS USA，85，5879-5883.Hynes, R. 0. (1990).Fibronectins(New York :Springer-Verlag) ·Jacobs et al. (2002)，Hum. Pathol.，33，29-38.Kabat et al. (1987)Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition.US Department of Health and Human Services.
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表2BIAcore 評估數據
權利要求
結合纖連蛋白的額外結構域 A(ED A)同種型的結合成員在製備用於治療患有類風溼性關節炎的患者的藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其中，所述結合成員結合所述纖連蛋白的ED-A。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其中，所述結合成員結合於可檢測標記物。
4.根據權利要求1或2所述的應用，其中，所述結合成員結合於具有抗炎活性的分子。
5.根據權利要求1或2所述的應用，其中，所述結合成員結合於白介素-IO(IL-IO)。
6.根據權利要求1或2所述的應用，其中，所述結合成員結合於放射性同位素。
7.結合纖連蛋白的ED-A同種型的結合成員在製備用於將結合於所述結合成員的分子 遞送至患者體內的類風溼性關節炎部位的新血管系統的藥物中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其中，所述結合成員結合所述纖連蛋白的ED-A。
9.根據權利要求7或8所述的應用，其中，所述分子是可檢測標記物。
10.根據權利要求7或8所述的應用，其中，所述分子具有抗炎活性。
11.根據權利要求7或8所述的應用，其中，所述結合成員結合於白介素-IO(IL-IO)
12.根據權利要求7或8所述的應用，其中，所述結合分子是放射性同位素。
13.根據權利要求1至12中任一項所述的應用，其中，所述結合成員包含VH結構域，其 中，所述VH結構域包括框架區以及互補決定區HCDRl、HCDR2和HCDR3的組，其中HCDRl 具有胺基酸序列 SEQ ID NO :3、23、33、43、53、63、73、83、93、103 或 113， HCDR2具有胺基酸序列SEQ ID NO :4，以及 HCDR3具有胺基酸序列SEQ ID NO 5 ；或者其中，所述VH結構域包含在所述互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3內具有10個 或更少胺基酸取代的互補決定區的組。
14.根據權利要求13所述的應用，其中，所述VH結構域的框架區是人種系框架區。
15.根據權利要求14所述的應用，其中，所述VH結構域具有胺基酸序列SEQID NO=U21、31、41、51、61、71、81、91、101或 111。
16.根據權利要求13至15中任一項所述的應用，其中，所述結合成員進一步包含VL結 構域，所述VL結構域包括互補決定區IXDRl、IXDR2和IXDR3的組以及框架區。
17.根據權利要求16所述的應用，其中LCDRl 具有胺基酸序列 SEQ ID NO :6、26、36、46、56、66、76、86、96、106 或 116， LCDR2具有胺基酸序列SEQ ID NO :7，以及 LCDR3具有胺基酸序列SEQ ID NO 8 ；或者其中，所述VL結構域包含在所述互補決定區IXDR1、IXDR2和IXDR3內具有10個 或更少胺基酸取代的互補決定區的組。
18.根據權利要求16或17所述的應用，其中，所述VL結構域的框架區是人種系框架區。
19.根據權利要求18所述的應用，其中，所述VL結構域具有胺基酸序列SEQID NO :2、22、32、42、52、62、72、82、92、102或 112。
20.根據權利要求16-19中任一項所述的應用，其中，所述結合成員包含單鏈Fv。
21.根據權利要求20所述的應用，其中，所述結合成員是小免疫蛋白(SIP)。
22.根據權利要求16至19中任一項所述的應用，其中，所述結合成員是雙體抗體。
23.結合纖連蛋白的ED-A同種型的結合成員在製備用於診斷患者體內的類風溼性關 節炎的診斷性產品中的應用。
24.根據權利要求23所述的應用，其中，所述結合成員結合所述纖連蛋白的ED-A。
25.根據權利要求1至24中任一項所述的應用，其中，所述患者患有類風溼性關節炎。
26.一種檢測或診斷人或動物患者體內的類風溼性關節炎的方法，包括(a)向所述人或動物給予結合纖連蛋白的ED-A同種型的結合成員，以及(b)確定在所述人或動物體的新血管系統中是否存在所述結合成員；其中，所述結合成員定位於所述人或動物體內的新血管系統表明存在類風溼性關節炎。
27.根據權利要求26所述的方法，其中，所述結合成員結合所述纖連蛋白的ED-A。
28.根據權利要求26或27所述的方法，其中，所述結合成員結合於可檢測標記物。
29.根據權利要求26至28中任一項所述的方法，其中，所述結合成員結合於放射性同位素。
30.一種治療患者體內的類風溼性關節炎的方法，包括給予所述患者治療有效量的包 含結合纖連蛋白的ED-A同種型的結合成員的藥物。
31.根據權利要求30所述的方法，其中，所述結合成員結合所述纖連蛋白的ED-A。
32.根據權利要求30或31所述的方法，其中，所述結合成員結合於可檢測標記物。
33.根據權利要求30至32中任一項所述的方法，其中，所述結合成員結合於具有抗炎 活性的分子。
34.根據權利要求30至32中任一項所述的方法，其中，所述結合成員結合於白介 素-10 (IL-10)。
35.根據權利要求30或31所述的方法，其中，所述結合成員結合於放射性同位素。
36.一種將分子遞送至人或動物體內類風溼性關節炎部位的新血管系統的方法，包括 向所述人或動物給予結合纖連蛋白ED-A同種型的結合成員，其中，所述結合成員結合於所 述分子。
37.根據權利要求36所述的方法，其中，所述結合成員結合所述纖連蛋白的ED-A。
38.根據權利要求36或權利要求37所述的方法，其中，所述分子是可檢測標記物。
39.根據權利要求36或權利要求37所述的方法，其中，所述分子具有抗炎活性。
40.根據權利要求36或權利要求37所述的方法，其中，所述結合成員結合於白介 素-IO(IL-IO)。
41.根據權利要求36或權利要求37所述的方法，其中，所述分子是放射性同位素。
42.根據權利26至41中任一項所述的方法，其中，所述結合成員包含VH結構域，並且 其中，所述VH結構域包括框架區和互補決定區HCDRl、HCDR2和HCDR3的組，其中HCDRl 具有胺基酸序列 SEQ ID NO :3、23、33、43、53、63、73、83、93、103 或 113， HCDR2具有胺基酸序列SEQ ID NO :4，以及 HCDR3具有胺基酸序列SEQ ID NO 5 ；或者其中，所述VH結構域包含在所述互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3內具有10個 或更少胺基酸取代的互補決定區的組。
43.根據權利要求42所述的方法，其中，所述VH結構域的框架區是人種系框架區。
44.根據權利要求43所述的方法，其中，所述VH結構域具有胺基酸序列SEQID NO=U21、31、41、51、61、71、81、91、101或 111。
45.根據權利要求42至44中任一項所述的方法，其中，所述結合成員進一步包含VL結 構域，所述VL結構域包括互補決定區IXDRl、IXDR2和IXDR3的組以及框架區。
46.根據權利要求45所述的方法，其中LCDRl 具有胺基酸序列 SEQ ID NO :6、26、36、46、56、66、76、86、96、106 或 116， LCDR2具有胺基酸序列SEQ ID NO :7，以及 LCDR3具有胺基酸序列SEQ ID NO 8 ；或者其中，所述VL結構域包含在所述互補決定區IXDR1、IXDR2和IXDR3內具有10個 或更少胺基酸取代的互補決定區的組。
47.根據權利要求46所述的方法，其中，所述VL結構域的框架區是人種系框架區。
48.根據權利要求47所述的方法，其中，所述VL結構域具有胺基酸序列SEQID NO :2、22、32、42、52、62、72、82、92、102或 112。
49.根據權利要求26至48中任一項所述的方法，其中，所述結合成員包含單鏈Fv。
50.根據權利要求49所述的方法，其中。所述結合成員是小免疫蛋白(SIP)。
51.根據權利要求26至48中任一項所述的方法，其中，所述結合成員是雙體抗體。
52.根據權利要求26至51中任一項所述的方法，其中，所述患者患有類風溼性關節炎。全文摘要
本發明涉及一種用於檢測和治療類風溼性關節炎的結合纖連蛋白的額外結構域-A(ED-A)同種型的結合成員。
文檔編號A61P19/00GK101918443SQ200880123186
公開日2010年12月15日 申請日期2008年10月27日 優先權日2007年10月30日
發明者伊夫林·特拉赫塞爾, 凱薩琳·施瓦格爾, 曼努埃拉·卡斯帕 申請人:菲洛根股份公司