一種基於毛囊幹細胞和矽凝膠敷料的皮膚重建方法
2023-08-04 12:45:31 2
一種基於毛囊幹細胞和矽凝膠敷料的皮膚重建方法
【專利摘要】本發明涉及一種皮膚重建的方法，所述方法以毛囊幹細胞為種子細胞，以矽凝膠敷料作為新的細胞移植載體進行皮膚重建，包括以下步驟：1）培養擴增毛囊幹細胞；2）培養真皮細胞；3）將步驟1）培養擴增的毛囊幹細胞與步驟2）培養的真皮細胞混合；4）將步驟3）的混合細胞滴加於矽凝膠敷料上孵育；5）將步驟4）的細胞和矽凝膠敷料移植到需要皮膚重建的部位。本發明提供的方法不僅可以在大面積皮膚損傷的治療中重建功能性皮膚，也可以在科研活動中為毛囊幹細胞的多潛能性檢測提供一種簡便的驗證方法。
【專利說明】一種基於毛囊幹細胞和矽凝膠敷料的皮膚重建方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及一種基於毛囊幹細胞和矽凝膠敷料的新型皮膚重建方法。
【背景技術】
[0002]皮膚是哺乳動物最大的器官，不僅可以起到隔絕外界病原等有害因素保護機體的屏障作用，同時皮膚中含有豐富的神經末梢可以迅速感知環境變化，此外，在體溫調節和水分保持等方麵皮膚也同樣發揮著不可替代的作用。然而，現在面對諸如燒傷或傳染性疾病導致的皮膚損傷等問題時，皮膚的修復和再生一直是困擾人類的一大難題。
[0003]毛囊作為皮膚的一個重要組成部分，在保護體表、感覺傳導、毛色膚色決定、表皮再生等多方面也同樣發揮著重要作用。因此，研究毛囊的結構及功能在皮膚的再生醫學、美容、以及疾病治療等方面有著不可忽視的意義。自1990年Cotsarelis等人發現毛囊幹細胞位於毛囊隆突部以來，經過二十幾年的深入研究，科研人員發現分離的單個毛囊幹細胞就可以體外大量增殖，並分化形成皮膚表皮的各種細胞類群，說明位於毛囊隆突部的毛囊幹細胞在構建毛囊的過程中起到了至關重要的作用。此外，多個研究組也已證明毛囊幹細胞直接參與了創傷修復過程，能夠形成新的表皮組織。綜合這些結果不難看出，毛囊幹細胞為皮膚再生研究提供了一個新的思考方向。
[0004]鑑於皮膚及毛囊重建有著重要的醫學應用前景，目前已有多種方法來進行體外的毛囊重建及異種毛囊重建實驗。例如，1993年首次報導的在毛囊重建實驗中使用最為廣泛的矽膠小室(Chamber)法,還有隨後發展出來的皮下注射(Patch)法、夾層(Flap)法、以及新近報導的支架(Scaffold)方法等。雖然毛囊重建實驗已有多種方法，但是這些方法或多或少存在硬體要求高、操作時間長、難度較高、毛囊再生效率低、可重複性差等缺點，比如矽膠小室(Chamber)法所用移植材料成`本高，手術操作難度高,重建面積較小,傷口暴露時間長；皮下注射(Patch)法由於是皮下注射實現重建，因此，手術操作難度高，重建面積有限，效率低，重複性差；夾層(Flap)法由於是皮膚的分層操作，所以手術操作難度大，時間長，再生效率低，重複性差；支架(Scaffold)方法所用移植材料成本高、手術縫合操作時間較長，上述這些方法的缺點禁錮了毛囊幹細胞在皮膚再生方面的研究和應用。雖然國內外已有商業出售的人工表皮，但是這種人工皮膚由於缺乏皮脂腺汗腺等附屬結構，移植到患處後缺乏彈性，而且並不能發揮正常皮膚的完整功能。由此可見，建立一種有效而簡單的皮膚重建方法是十分必要的。
【發明內容】
[0005]因此，本發明的目的是提供一種皮膚重建的方法。
[0006]本發明的目的是採用以下技術方案來實現的。本發明提供了一種皮膚重建的方法，以毛囊幹細胞為種子細胞，以矽凝膠敷料作為新的細胞移植載體進行皮膚重建，具體包括以下步驟:1)培養擴增毛囊幹細胞；2)培養真皮細胞；3)將步驟I)培養擴增的毛囊幹細胞與步驟2)培養的真皮細胞混合；4)將步驟3)的混合細胞滴加於矽凝膠敷料上孵育；5)將步驟4)的細胞和矽凝膠敷料移植到需要皮膚重建的部位。
[0007]優選地，其中所述步驟I)中的毛囊幹細胞來源於哺乳動物毛囊隆突部，優選為大鼠觸鬚。
[0008]優選地，所述步驟I)中的毛囊幹細胞和成纖維細胞按2: 1-1: 2的比例接種到培養皿中培養。其中，發揮滋養作用的成纖維細胞過多或過少均會影響毛囊幹細胞的生長狀況，因此，毛囊幹細胞和成纖維細胞的比例優選2: 1-1: 2之間。
[0009]更優選地，所述步驟I)中的毛囊幹細胞和成纖維細胞按1:1的比例接種到培養
皿中培養。
[0010]優選地，所述毛囊幹細胞是利用器官培養的方法，採用William’s E完全培養基對毛囊進行培養並分離純化而製備的。
[0011]優選地，其中所述步驟2)中的真皮細胞來源於新生大鼠，優選出生後24小時內的大鼠。
[0012]優選地，步驟3)還包括在混合前，將毛囊幹細胞和真皮細胞分別使用DMEM/F12重懸的步驟；
[0013]其中，所述DMEM/F12培養基是實驗室常用的培養基，為DMEM培養基和F12培養基按1:1的比例結合，稱為DMEM/F12培養基。在本申請的一個優選的實施例中，所述DMEM/F12培養基購自Gibco公司。
[0014]優選地,步驟3)還包括混勻後,加入基質膠(Matrigel)的步驟；優選地,所述基質膠在冰上溶解；優選地，將所述基質膠與細胞混合液按體積比1: 2-1: 4混合；更優選地，所述基質膠與細胞混合液的體積之比為1: 3。其中，根據基質膠本身的性質，基質膠濃度越大凝結越明顯，不利於細胞的均勻混合，濃度過低則不能有效輔助製成膠凍狀，因此，基質膠與細胞混合液適宜體積比在1: 2-1: 4之間。
[0015]其中，所述基質膠購自BD Biosciences公司。
[0016]優選地，所述步驟3)中毛囊幹細胞和真皮細胞的混合比例為1: 1-1: 10，優選1:4-1: 6，更優選 1: 5。
[0017]優選地，將所述步驟5)中的重懸液吹成膠凍狀，優選地，在超淨工作檯中以
0.2-0.5m/s的低風速將所述重懸液吹15-25分鐘至形成膠凍狀即可，優選地，在超淨工作檯中以0.3m/s的低風速將所述重懸液吹15-25分鐘至形成膠凍狀即可。
[0018]優選地，所述矽凝膠敷料為醫用自粘性矽凝膠敷料，所述醫用自粘性矽凝膠敷料優選為醫用自粘性矽凝膠膜或醫用自粘性矽凝膠貼。
[0019]在本發明的一個優選的實施方案中優選使用購自美國Biodermis公司的矽膠貼。
[0020]優選地，步驟5)中使用醫用粘合劑將矽凝膠敷料與需要皮膚重建的部位粘合；優選地，所述粘合劑為軟組織醫用粘合劑，優選地，所述醫用粘合劑為α -氰基丙烯酸正丁酯。
[0021]優選地，所述方法還包括用綠色螢光蛋白標記毛囊幹細胞的步驟；
[0022]優選地，所述綠色螢光蛋白標記毛囊幹細胞是通過慢病毒感染法。[0023]此外，本發明提供了上述方法在皮膚損傷治療中用於重建皮膚的用途；優選地，所述皮膚損傷包括燒傷或燙傷。[0024]本發明還提供了上述方法重建的皮膚類產品，例如表皮。
[0025]在本發明的一個優選實施方案中，涉及的主要技術路線包括:
[0026](I)大鼠隆突部毛囊幹細胞復甦擴增及綠色螢光標記細胞
[0027](2)新生大鼠真皮細胞的製備
[0028]( 3 )矽凝膠敷料和待移植細胞準備
[0029](4)皮膚重建手術
[0030](5)形態學觀察
[0031]本發明具有以下的有益效果:
[0032]1.矽凝膠敷料的使用簡化了手術操作並大大縮短傷口暴露時間，避免感染；
[0033]2.用含基質膠的-DMEM/12培養液作為移植細胞的支持環境，細胞移植後易存活，提高了皮膚重建的成功率；
[0034]3.本方法成本低，成功率高，矽凝膠敷料和醫用粘合劑價廉易得，大大提高了操作的可重複性、可操作性；
[0035]4.利用毛囊幹細胞和真皮細胞的移植，實現了裸鼠背部全皮缺失後的皮膚重建；
[0036]5.將毛囊幹細胞用綠色螢光蛋白標記，便於對幹細胞進行跟蹤定位；
[0037]6.手術中利用醫用粘`合劑取代針線縫合固定矽凝膠敷料，將小鼠創傷降到最低，並排除縫合造成的傷口修復對毛囊重建過程的影響以及避免拆除縫合線的過程，進一步簡化了手術操作。
[0038]此外，由於整個移植手術過程操作簡單，耗時少，再加上毛囊幹細胞在體外增殖能力強，以及真皮細胞容易獲取等特點，因而，本發明具有較強的實際應用前景和科研價值，不僅可以在皮膚損傷的治療中功能性皮膚的重建方面發揮作用，也可以在科學基礎研究中為毛囊幹細胞的多潛能性驗證方面提供更簡便易行的方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0039]以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中:
[0040]圖1是本發明中毛囊重建過程示意圖，即綠色螢光蛋白(GFP)標記的毛囊幹細胞與新生大鼠真皮細胞混合後滴加於矽膠貼上，然後移植到裸鼠的背部創口處。
[0041]圖2是手術後4周裸鼠背部明顯長出的新毛；B圖是A圖所示裸鼠背部的俯拍圖，可見綠色虛線框所示的創傷癒合區域中已長出不同於裸鼠自身畸形毛髮的新毛；C圖為A圖的局部放大圖。
[0042]圖3是手術後4周在螢光體視鏡下拍到的裸鼠背部創傷癒合區域的局部放大圖，可見圖2B中長毛區域相較於外周的非創傷皮膚呈現明顯綠色，說明這一區域正是由毛囊幹細胞參與重建的皮膚組織圖為A圖中白色虛線框的局部放大圖，可見毛幹基部有綠色亮斑，說明此毛囊是由移植的綠色螢光蛋白標記的毛囊幹細胞重建而來。
[0043]圖4是手術後4周裸鼠背部創口及附近皮膚冰凍切片後，在螢光顯微鏡下觀察到的由綠色螢光蛋白標記的毛囊幹細胞分化形成的表皮、毛囊、和皮脂腺結構。
【具體實施方式】
[0044]以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用於說明本發明，其不以任何方式限制本發明的範圍。
[0045]在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其後所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內容相同。
[0046]以下實施例中，新生大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，是出生後24小時內的，不區分雌雄；裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，是大於7周齡的雌鼠。
[0047]實施例1大鼠隆突部毛囊幹細胞製備
[0048]皮膚重建所需要的毛囊幹細胞的來源有多種途徑，例如根據毛囊幹細胞標記分子以流式細胞分選的手段獲得，或通過組織器官培養的方法獲得。
[0049]本實施例以成年大鼠觸鬚毛囊幹細胞為例，詳細說明製備作為本發明毛囊重建的種子細胞的方法，具體如下。實驗動物的飼養和使用按照中國科學院動物研究所動物與醫學倫理委員會的規定執行。
[0050]1.大鼠觸鬚毛囊的顯微剝離:取一小塊成年Wistar大鼠(中國科學院動物研究所)觸鬚部皮膚，用75%酒精消毒3-5分鐘；在體視鏡下，用鑷子夾住觸鬚毛囊靠近表皮的峽部，向真皮方向用力撕出毛囊；用29G針頭固定住毛囊，用解剖刀小心劃破真皮鞘，並將毛囊剝離出來，切斷真皮乳頭和真皮鞘間的連接。
[0051]2.用William’s E完全培養基培養毛囊:(I)配製William’s E完全培養基。向William』 s E基本培養基(購自Gibco公司)中添加以下因子,各種因子的最終濃度為:10納克/毫升的表皮生長因子，5微克/毫升的胰島素，I微克/毫升的氫化可的松，5.8毫摩爾/升的L-穀氨醯胺，0.115微克/毫 升的維生素A，I微克/毫升的維生素D2，I微克/毫升的轉鐵蛋白，100納克/毫升的亞油酸，20微克/毫升的牛血清白蛋白，200單位/毫升的青黴素鈉，200單位/毫升的硫酸鏈黴素。向添加因子後的William』 s E培養基中加體積百分含量為15%的胎牛血清，即為William』 s E完全培養基。(2)將毛囊轉入6孔培養板，加William’s E完全培養基，37°C、5%C02、100%溼度的培養箱中培養。毛囊一般在第3-7天貼壁，然後毛囊幹細胞會從隆突部爬出，細胞邊緣明亮，緊密排列，為典型角質細胞特徵。
[0052]3.毛囊幹細胞的純化:毛囊幹細胞具有貼壁緊的特點，利用這一特點，在室溫25°C左右，用消化液(含有質量百分含量為0.1%的胰蛋白酶和0.008%的EDTA的磷酸鹽緩衝液)消化時，成纖維細胞會被消化下來，而幹細胞克隆仍貼在培養板上。用磷酸鹽緩衝液小心將消化下來的成纖維細胞收集起來，離心後可以傳代或凍存，以備用於與毛囊幹細胞的共培養，為幹細胞提供與體內相似的模擬環境，有利於幹細胞的生長。再向培養板中加消化液，轉到37°C培養箱繼續消化3-5分鐘，用磷酸鹽緩衝液收集消化下來的毛囊幹細胞，離心後可以傳代或凍存。
[0053]4.毛囊幹細胞的傳代和增殖:將單根毛囊生長出的毛囊幹細胞和成纖維細胞按照I: I的比例接種到IOcm培養皿中，加William』 S E完全培養基，37°C、5%C02、100%溼度的培養箱中培養，2-3天更換培養液,大約2周後細胞長滿,可繼續傳代或在液氮中凍存備用。
[0054]實施例2幹細胞螢光標記[0055]1.毛囊幹細胞的準備:復甦實施例1中製備並凍存的成年大鼠觸鬚毛囊幹細胞，按照建立的毛囊幹細胞培養體系，接種少量成纖維細胞做滋養層細胞，用William’s E完全培養基在37°C、5%C02、100%溼度的培養箱中培養。
[0056]2.毛囊幹細胞用綠色螢光蛋白標記:恢復性生長24小時後，細胞生長狀態良好；加入帶有綠色螢光蛋白基因的慢病毒儲存液(購自Invitrogen公司)，感染24小時後，換為新鮮William』 s E完全培養基，48小時可以觀察到綠色細胞。
[0057]3.綠色螢光蛋白標記的毛囊幹細胞的純化和擴增:首先利用毛囊幹細胞貼壁緊的特點，用消化液(質量百分含量為0.1%的胰蛋白酶+0.008%的EDTA的磷酸鹽緩衝液)在室溫下消化，顯微鏡下觀察，待成纖維細胞脫落後，用磷酸鹽緩衝液(pH為7.3左右)將成纖維細胞洗掉，剩餘仍然貼壁的都是毛囊幹細胞；然後加消化液在37°C繼續消化，收集毛囊幹細胞；用適量磷酸鹽緩衝液重懸，用流式細胞儀進行分選，只保留綠色螢光較強的細胞；將分選出的高表達綠色螢光蛋白的毛囊幹細胞接種到IOcm細胞培養皿中擴增，加少量成纖維細胞做共培養，培養條件為William』 s E完全培養基在37°C、5%C02、100%溼度的培養箱中培養，2-3天更換一次培養液，將綠色螢光蛋白標記的毛囊幹細胞增殖到需要的細胞量備用。
[0058]實施例3新生大鼠真皮細胞的製備
[0059]將出生後24小時之內的大鼠冰中處死後，用75%酒精浸泡消毒3_5分鐘，隨後在超淨工作檯中操作，先用無菌生理鹽水洗2遍，使用消毒後的剪刀和鑷子將整個背部的皮膚剪下，用生理鹽水洗一遍，然後用解剖刀輕刮去皮下脂肪，隨後用生理鹽水洗7遍。將皮膚表皮朝上鋪於培養皿內，小心加入消化液(0.25%的胰酶和Dispase酶(Gibco公司)體積比1: 1)，使皮膚漂於液面，4°C消化過夜。第二天揭去表皮，將真皮部分置於四型膠原酶中37°C消化45min。用400目的篩布過濾消化後的真皮細胞懸液，收集濾過的單細胞懸液，1000rpm, IOmin離心收集細胞，計數，用DMEM/F12重懸後備用。
[0060]實施例4矽凝膠料和待移植細胞準備
`[0061]1.預先購買矽凝膠敷料(美國Biodermis公司所生產的矽膠貼產品)，撕去包裝後，裁剪成直徑3.5cm左右的圓片，浸泡於75%的酒精中待用；使用前取出，於超淨臺中吹乾，再用DMEM/F12培養液浸泡涮洗，最後放置於IOcm的培養皿中備用。
[0062]2.將培養的綠色螢光標記的成年大鼠觸鬚毛囊幹細胞用0.1%的胰酶在室溫下消化，用磷酸緩衝液洗掉滋養層成纖維細胞；加0.25%的胰酶在37°C繼續消化，收集毛囊幹細胞，計數後用DMEM/F12重懸後備用。
[0063]3.將毛囊幹細胞與真皮細胞以1: 5的比例混合，3.5X106個毛囊幹細胞和
1.8X IO7個真皮細胞用DMEM/F12培養基混合為一份，用於一隻裸鼠的移植；混勻兩種細胞，而後再與冰上溶解的基質膠混勻；將以上液體滴加到已吹乾及漂洗過的矽膠貼上，形成直徑1.5釐米的液滴，置於37°C培養箱中孵育2小時；取出後打開培養皿上蓋，在超淨工作檯中以0.3m/s的低風速吹約20分鐘至形成膠凍狀，置於冰上待移植。
[0064]實施例5皮膚重建手術
[0065]1.手術操作臺提前用紫外線消毒，手術器械用高壓滅菌消毒；裸鼠腹部皮膚消毒，腹腔注射經過過濾除菌的麻醉劑；待裸鼠麻醉後，注射適量青黴素-鏈黴素溶液；整個背部皮膚依次用碘伏和75%酒精擦拭消毒，使用環形印章沓出外徑1.5釐米的空心圓，用眼科剪沿此圓圈外剪出創口，將皮下結締組織清除乾淨，露出肌肉層；小心地用鑷子夾起已準備好的附有細胞的矽膠貼，細胞面朝向傷口，迅速置於裸鼠背部創傷處；使用醫用膠水將矽膠貼邊緣與裸鼠背皮粘合，最後用醫用絲綢膠帶包紮一圈半，以加固矽膠貼；整個過程要求無菌操作。
[0066]2.手術I周后，裸鼠背上的矽膠貼基本自然脫落，傷口逐漸癒合；定期觀察裸鼠傷口癒合及長毛情況。
[0067]實施例6形態學觀察
[0068]1.手術4周後，麻醉裸鼠後，在螢光體視鏡下觀察裸鼠背部；並可以取背部疤痕部位皮膚，立即轉移到-80°C保存；用冰凍切片包埋劑(OCT)包埋皮膚組織，冰凍切片，切片厚度40微米。
[0069]2.用4%的中性多聚甲醛溶液於室溫固定10分鐘，磷酸緩衝液洗3遍，用防淬滅劑DABCO封片，-20°C保存；用螢光顯微鏡觀察時，綠色的組織即為綠色螢光蛋白標記的毛囊幹細胞分化形成的組織，可以發現毛囊幹細胞已經成功分化為結構正常的表皮、毛囊和皮脂腺。
[0070]其中，圖2中A圖是手術後4周裸鼠背部明顯長出的新毛；B圖是A圖所示裸鼠背部的俯拍圖，可見綠色虛線框所示的創傷癒合區域中已長出不同於裸鼠自身畸形毛髮的新毛；C圖為A圖的局部放大圖。圖3中A圖是手術後4周在螢光體視鏡下拍到的裸鼠背部創傷癒合區域的局部放大圖，可見圖2B中長毛區域相較於外周的非創傷皮膚呈現明顯綠色，說明這一區域正是由毛囊幹細胞參與重建的皮膚組織；B圖為A圖中白色虛線框的局部放大圖，可見毛幹基部有綠色亮斑，說明此毛囊是由移植的綠色螢光蛋白標記的毛囊幹細胞重建而來。圖4是手術後 4周裸鼠背部創口及附近皮膚冰凍切片後，在螢光顯微鏡下觀察到的由綠色螢光蛋白標記的毛囊幹細胞分化形成的表皮、毛囊、和皮脂腺結構。
【權利要求】
1.一種皮膚重建的方法，所述方法以毛囊幹細胞為種子細胞，以矽凝膠敷料作為細胞移植載體進行皮膚重建，包括以下步驟: 1)培養擴增毛囊幹細胞； 2)培養真皮細胞； 3)將步驟I)培養擴增的毛囊幹細胞與步驟2)培養的真皮細胞混合； 4)將步驟3)的混合細胞滴加於矽凝膠敷料上孵育； 5)將步驟4)的細胞和矽凝膠敷料移植到需要皮膚重建的部位。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述步驟I)中的毛囊幹細胞來源於哺乳動物毛囊隆突部，優選為大鼠觸鬚。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中將所述步驟I)中的毛囊幹細胞和成纖維細胞按2: 1-1: 2的比例接種到培養皿中培養； 優選地，所述步驟I)中的毛囊幹細胞和成纖維細胞按1:1的比例接種到培養皿中培養。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述毛囊幹細胞是利用器官培養的方法，採用William』 s E完全培養基對毛囊進行培養並分離純化而製備的。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述步驟2)中的真皮細胞來源於新生大鼠，優選24小時內出生的新生大鼠。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其中步驟3)還包括在混合前，將毛囊幹細胞和真皮細胞分別使用DMEM/F12重懸的步驟； 優選地，步驟3)還包括混勻後，加入基質膠的步驟；優選地，所述基質膠在冰上溶解；優選地，將所述基質膠與細胞混合液按體積比1: 2-1: 4混合；更優選地，所述基質膠與細胞混合液的體積之比為1: 3; 優選地，所述步驟3)中毛囊幹細胞和真皮細胞的混合比例為1: 1-1: 10，更優選1:4-1: 6，最優選 1: 5。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其中將所述步驟5)中的重懸液吹成膠凍狀；優選地，在超淨工作檯中以0.2-0.5m/s的風速將所述重懸液吹15-25分鐘至形成膠凍狀即可，優選地，所述風速為0.3m/s。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述矽凝膠敷料為醫用自粘性矽凝膠敷料，所述醫用自粘性矽凝膠敷料優選為醫用自粘性矽凝膠膜或醫用自粘性矽凝膠貼； 優選地，步驟5)中使用醫用粘合劑將矽凝膠敷料與需要皮膚重建的部位粘合；優選地，所述粘合劑為軟組織醫用粘合劑，優選地，所述醫用粘合劑為α-氰基丙烯酸正丁酯。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的方法，其中，所述方法還包括用綠色螢光蛋白標記毛囊幹細胞的步驟；優選地，所述綠色螢光蛋白標記毛囊幹細胞是通過慢病毒感染法。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的方法重建的皮膚類產品。
11.根據權利要求10所述的皮膚類產品在製備用於治療皮膚損傷的產品中的用途，優選地，所述皮膚損傷包括燒傷或燙傷。
【文檔編號】A61L27/38GK103550828SQ201310487717
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月17日 優先權日:2013年10月17日
【發明者】段恩奎, 趙華山, 張會閃, 張守兵, 喬靜巧 申請人:中國科學院動物研究所