用於醫學用途的新型幾丁低聚物組合物的製作方法

2023-07-22 14:04:31 1

專利名稱：用於醫學用途的新型幾丁低聚物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於醫學用途的新型幾丁低聚物(chitooligomer)組合物。更具體而言，本發明涉及從幾丁質製造的生物材料和藥物，它們協同地促進體內和體外的再生和抗炎作用。技術背景和現有技術第一代生物材料的開發，儘管具有可接受的機械強度，但是由於它們的功能限於支撐組織替代物，因此造成對於組織治癒的被動作用。這些第一代的生物材料釋放降解的碎片，接下來導致慢性炎症、疼痛和滲漏的發生。開發第二代生物可降解的生物材料的主要目的是消除源於第一代材料的碎片顆粒的連續釋放所致的慢性、長期問題。這就產生了能提供組織支持特性達所需時間長度(數月)的可植入的生物可降解的材料，並且它們此後經歷由周圍組織的局部降解並且隨後通過尿和/或排洩物分泌到體外。這一技術的實例是目前使用的生物可降解的血管縫合線。儘管第二代生物材料有良好的生物兼容特性，但是它們對於促進組織治癒的貢獻有限，這是因為它們在參與組織治癒和再生的生物過程中的被動作用。開發更加現代的第三代生物材料的需求在於需要開發將主動作用於組織治癒和再生過程的化合物。本申請人的早先申請WO 2006/134614公開了製造用於治療用途的高度純化的部分去乙醯化的幾丁質生物材料的方法。通過這一方法產生的低聚組合物在此稱作「治療性幾丁低聚糖」(Therapeutic Chitooligosaccharides，T-ChOS)。該治療性幾丁低聚糖的特徵在於它們4-20個單體殘基的鏈長度以及它們的D-葡糖胺(D)和N-乙醯基-D-葡糖胺 (A)的特異序列，該低聚物的內部部分具有至少足夠的葡糖胺(D)殘基來避免N-乙醯基葡糖胺殘基(A)與另一 N-乙醯基葡糖胺殘基相鄰(例如AA)。對於受損的或患病的組織基本上存在兩種方式來修復或治癒。一種是通過纖維化造成疤痕形成。由於參與纖維化組織形成的纖維原細胞不具有原始組織細胞的功能，這一修復途徑造成受損的組織功能。炎性細胞因子通常參與纖維化。認為^(L-40通過纖維原細胞生長的趨化性以及刺激在纖維化中起作用。組織修復的替代途徑是組織再生或功能性組織修復。在這一途徑中，特定組織的功能細胞，可能來自組織特異性祖細胞得以再生，造成健康功能組織的再生。在骨組織中，成骨生物材料或裝置和骨誘導生物材料或裝置通過誘導能夠發育成軟骨和/或骨組織的祖細胞的增殖來促進骨生長，並且表徵為不僅在本發明生物材料組合物提供的支架內填充空隙而且也展現造成或誘導機體產生新骨的內在特性的材料。這些材料不僅用作支架，而且也含有誘導新骨形成的蛋白質或其它物質。自體移植已經在整形外科手術中使用多年，並且是輔助機體再生能力的最常見的方法。只有一種商品化可得的產品證明了真正的骨誘導特性，近來從Medtronic引入的稱作hFUSE 的裝置整合了人骨形態發生蛋白(BMP)的重組形式。此外，已將葡糖胺大量用於治療骨關節炎。目前尚未發現能夠通過全身給藥(例如口服、皮下、肌下、靜脈內等)來促進組織再生的試劑。
發明概述在較早的專利申請(W0 2006/057011)中，發明人已經證明了植入骨缺損中的部分去乙醯化的幾丁質衍生物能夠誘導軟骨內的骨化。在證明特異氨基糖作用的體外和體內模型中，本發明證明了通過全身給藥的T-ChOS和T-ChOS+葡糖胺的再生作用。另外，證明了葡糖胺和N-乙醯基葡糖胺的二聚物和三聚物(DP2和DP;3)展現抑制作用。本發明也公開了 T-ChOS和葡糖胺作為生物活性組合物而在風溼性關節炎(RA)中促進抗炎作用和組織再生的出人意料的協同效應。在本發明的實例中進一步證明T-ChOS和葡糖胺的組合，明顯地通過與CLP蛋白家族的成員^(L-40的相互作用，而構成促進和增強軟骨外植體中II型膠原形成的活性劑。本發明的一個目的在於提供通過向有需要的人和其它哺乳動物全身或局部給予的T-ChOS和葡糖胺和/或N-乙醯基葡糖胺的協同效應來減少炎症並促進組織修復或組織再生的組合物、用途和方法。在本發明的第一方面，提供一種組合物，該組合物包括由N-乙醯基葡糖胺(A)和葡糖胺(D)組成的治療有效的幾丁低聚物(T-ChOS)，該幾丁低聚物包括必需滿足下麵條件的雜幾丁低聚物所述低聚物具有在4-20個單體殘基範圍的有效的鏈長度分布並且每條低聚物鏈能夠在低聚物鏈的任一端或兩端具有兩個N-乙醯基葡糖胺殘基(AA)。該內部鏈的序列(在每端的末端兩個殘基內的部分)為使得一個N-乙醯基葡糖胺殘基(A)不與另一 N-乙醯基葡糖胺殘基相鄰(例如AA)。該組合物進一步包括葡糖胺單體和/或N-乙醯基葡糖胺。根據本發明第一方面的組合物是展現了生物材料的主要標準，即生物兼容性、生物降解性和生物活性的一種生物材料。治療有效的幾丁低聚物(T-ChOS)和單體的適當比例可取決於特定指徵、應用、裝置和劑型。廣義地，單體和低聚物之間的比例(重量/重量)可以在約1 10至約10 1 的範圍，更優選在約1 5至約5 1的範圍，包括約1 1至約5 1的範圍。在某些實施方式中，單體的重量更高並且該範圍可在約1 1至約10 1的範圍，例如更優選在約 1 1至約5 1的範圍，包括約1 1至約4 1的範圍，例如約2 1，約4 1和更優選約3 1的比例。在其它實施方式中，更多地使用T-ChOS低聚物，使得單體和低聚物的比例在約1 1至約1 4的範圍，包括約1 1，約1 2和約1 3的比例。在本發明的第二方面，提供一種藥學組合物，包括與所添加的葡糖胺和/或N-乙醯基葡糖胺單體協同的由N-乙醯基葡糖胺(A)和葡糖胺(D)組成的治療有效的幾丁低聚物(T-ChOS)。幾丁低聚物組分包括上面限定的雜幾丁低聚物，該雜幾丁低聚物具有在4-20 個單體殘基範圍的有效的鏈長度分布並且每條低聚物鏈能夠在低聚物鏈的任一端或兩端具有兩個N-乙醯基葡糖胺殘基(AA)。所述的該內部鏈的序列為使得一個N-乙醯基葡糖胺殘基(A)不與另一 N-乙醯基葡糖胺殘基相鄰(例如AA)。該組合物進一步包括葡糖胺單體和/或N-乙醯基葡糖胺，優選按上述的重量比。這一藥學組合物可以為散劑、懸劑、凝膠、 溶膠、氣霧劑、糊劑、膜、泡沫劑、丸劑和膠囊的形式。藥學組合物可以進一步包括藥學可接受的賦形劑。在本發明的第三方面，提供本發明的組合物在製造用於抗炎和組織再生的生物材料/藥物的應用。在本發明的第四方面，提供該組合物在製造用於調控膠原合成從而在組織修復時防止疤痕形成的生物材料/藥物中的應用。該組合物包括根據本發明第一方面的由N-乙醯基葡糖胺(A)和葡糖胺(D)組成的治療有效的幾丁低聚物(T-ChOS)。發明說明本發明的組合物是在組織再生中顯示協同效應的兩種幾丁質材料的組合。已經證明治療有效的幾丁低聚物(T-ChOQ在機體中結合幾丁質酶樣蛋白(CLP)並且我們的數據顯示CLP可以在機體中的膠原合成方面起作用並且作為CLP和T-ChOS間的相互作用的結果，膠原合成被上調。在關節軟骨中II型膠原的合成是由形成原膠原起始的，該II型膠原是以兩種替代的剪接形式PIIANP和PIIBNP來合成的，其中PIIANP使TGF-β超家族的 TGF-β UBMP-2和ΒΜΡ-4固定化。這潛在地調控了發育期間的生長因子發出信號並且是調控軟骨內的骨形成的關鍵要素，該軟骨內的骨形成是涉及軟骨組織形成、軟骨組織的血管化的骨形成(軟骨內的骨化)的天然途徑，增強誘導的軟骨組織的礦化和隨後的骨化以形成板層骨。骨形態發生蛋白(BMP)在關節膠原形成以及骨形成的第一階段期間是不想要的但是當組織被導向軟骨內的骨形成途徑時被特別地釋放。由於本發明顯示出DP2-3的存在阻斷了該組合物所需的生物作用，本發明組合物的T-ChOS組分的特徵進一步在於單體、二聚體和三聚體(DPI、DP2和DP;3)的量大大減少。本發明的低聚組合物表現出該低聚組合物的治療活性的優化，所述治療活性包括生物利用度、生物穩定性和生物活性。在此的低聚組合物指「治療性幾丁低聚糖」(T-ChOS)，它已經通過WO 2006/134614公開的方法進行生產以回收高度純化的且完全溶解的部分去乙醯化的幾丁質聚合物。部分去乙醯化的幾丁質聚合物組合物用18家族-內切幾丁質酶來處理並且隨後過濾以使所需的組合物的鏈長度在4-20個單體殘基的範圍內並且每條低聚物鏈可以在該低聚物鏈的任一端或者兩端具有兩個N-乙醯基葡糖胺殘基 (AA)。所述內部鏈的序列是使得一個N-乙醯基葡糖胺殘基(A)不與另一 N-乙醯基葡糖胺殘基相鄰(即，在具有可為AA的二-殘基末端的鏈的內部部分沒有形成「AA」對)。作為這一構造的結果，鏈長度在4-20個單體殘基的組合物不能被機體內的幾丁質酶所切割。低聚物的脫乙醯作用程度優選在約30-60 %的範圍內，例如約30 %，約40 %，約 50%或約 60%。治療性幾丁低聚物的順序模式直接影響它們的生物活性，即它們如何在生物膜上運輸(生物利用度)，它們如何在生命系統中快速分解(生物穩定性)，以及它們如何與幾丁質酶樣蛋白以及其它結合幾丁質序列的特異受體相互作用(生物活性)。生物利用度，或一給定物質通過生物膜的能力，是與分子的疏水性相關。由於所有的生物膜主要是疏水性質，適用的一般規則是一物質越疏水，則它越能夠滲透此種生物膜。 N-乙醯基-葡糖胺和完全乙醯化的幾丁質低聚物比相應的葡糖胺單體或高度去乙醯化的殼聚糖低聚物更加疏水，這就暗示了幾丁質的雜低聚物隨著乙醯化作用增加將擁有增加的生物利用度。因此，優化了 T-ChOS製劑以在它們的分子結構中含有最大量的N-乙醯基-葡糖胺以便使它們的生物利用度最大化，而不會危害它們的生物穩定性。有機化合物的生物穩定性指它在活體生物中對內源酶的敏感性以及它在該生物中的半衰期。越敏感，該化合物的生物穩定性越差。在人類中，幾丁質分解酶可以分成兩類；具有高水平幾丁質分解特異性、高的比活性的酶，像18家族幾丁質酶(AMCase，殼三糖酶)；或者具有較差幾丁質分解特異性的酶，如裂解酶和可能的一些蛋白酶，它們恰好降解幾丁質和殼聚糖，只是比活性較低。通過部分去乙醯化，使T-ChOS組合物優化為對18家族幾丁質酶的水解具有最大穩定性。由於這些酶需要兩個或更多個連續的N-乙醯基-葡糖胺殘基的序列作為切割識別位點，因此T-ChOS組合物被特別優化為在分子的內部部分排除此種序列。有機物質或配體的生物活性與配體對引發生物反應的靶受體的親和性直接關聯。 儘管有跡象表明幾丁質低聚物在胚胎發育中起重要作用，但是對於幾丁質化合物在人體內的生物作用仍舊了解不多。這表明人類基因組能夠表達在結合幾丁質低聚物時被特異活化的特異受體。人體中唯一已知的幾丁質結合蛋白是幾丁質酶樣蛋白(CLP)，它們在遺傳學上屬於18家族幾丁質酶，然而它們中的大多數已經喪失了它們的酶促活性，只是仍舊保留了它們的幾丁質酶結合結構域。術語「軟骨內的骨化」指軟骨首先發育，產生最終骨的框架的骨形成過程。軟骨組織需要比成骨組織更少的局部氧張力用於它的發育和維持，因此，只要供血系統沒有達到其發育的最終階段，軟骨就將取代骨。軟骨將只在血管形成達到其後期後才被新骨代替，以保證向發育組織的必要氧供給。這一骨形成過程在胚胎階段，特別是椎骨、長骨、胸骨等中也是典型的。在這一上下文中，術語「醫療設備」通常指儀器設備、器具、儀器、工具、移植物、體外試劑或其它類似或相關的物體，包括組件部件，或旨在用於診斷疾病或其它症狀，或治癒、減輕、治療或預防疾病，特別是在人或其它動物中，或者旨在影響人或其它動物的機體的結構或任何功能的輔助物。在此的上下文中，術語「生物材料產品」與術語「醫療設備」互換使用。在此所述的藥學組合物包括與葡糖胺和/或N-乙醯基-葡糖胺協同的治療性幾丁低聚物(T-ChOS)。它們可以全身給藥並且與內源CLP結合，它們中的許多已顯示出或暗示了對若干疾病和症狀起作用。在這些與CLP表達升高相關的疾病和症狀中，有退行性疾病(例如風溼性關節炎)以及包括骨關節炎的其它疾病。發現本發明的T-ChOS組合物對於治療和/或醫治這些疾病以及與骨組織形成相關的症狀以及諸如外科手術或外傷後的骨再生的症狀是有用的。然而，和葡糖胺一起，這一作用被提高。T-ChOS低聚物和單體的適當比例優選如上所述。該組合物可進一步包括藥學可接受的賦形劑，例如加工助劑或穩定劑、稀釋劑、調味劑、營養物、或著色劑或適當的其它生物活性或非活性成分。藥學組合物應優選地以適於口服給藥的形式，例如可以容易地溶解例如在一瓶水中的乾燥形式。此種形式包括乾粉劑、懸劑、凝膠、膜、泡沫劑、溶膠、氣霧劑、顆粒、薄片、纖維和糊劑形式。然而，該組合物也可以包含在片劑或膠囊中。藥學組合物可進一步包括藥學可接受的賦形劑。在本發明的進一步的實施方式中，該組合物用於製造用於組織再生的生物材料/ 藥物，例如增強骨再生來治癒哺乳動物的斷裂的或切斷的骨。此種藥物通過活化組織特異的祖細胞進行軟骨內的骨化來增強例如骨形成。在本發明的實施方式中，生物材料包括選自磷酸鈣(包括羥磷灰石)、硫酸鈣、三聚磷酸鈉、藻酸鹽、膠原、透明質酸和殼聚糖聚合物中的一種或多種的其它組分。在其它有用的實施方式中，本發明的組合物是適於其它形式的全身給藥的形式， 例如肌內、皮下或靜脈內給藥。根據標準藥學實踐，此種適當的形式是具有藥學可接受的載
7體或賦形劑的溶液形式。所述溶液形式是無菌的，並且PH被適當調節及緩衝。對於靜脈內使用，應控制溶解物的總濃度以使製劑是等滲的。在本發明的一個實施方式中，T-ChOS單獨被用作使受損或患病組織的組織修復遠離會導致疤痕形成的纖維化的藥物，而是誘導組織再生或功能性組織修復，因而產生健康功能組織的再生。這一組織修復途徑的調控通過控制受傷或炎性組織中的膠原合成來完成的。在本發明的一個實施方式中，T-ChOS+葡糖胺被用作減少女性在更年期後體重增加的藥物。在本發明的上下文中，術語「醫療設備」通常指儀器。本發明的治療性幾丁低聚物尤其可用於多種目的的生物材料。除了展現常規殼聚糖的所有有益特徵(生物兼容性、 能與其它組分混合以生產適當的混合物用於醫療設備，如機械性植入物、藥物遞送裝置等) 外，如上所述，由於它們對機體內的CLP的高親和性，它們擁有明顯增加的溶解性以及生物或治療活性。該生物材料的製劑可以適當地包括其它有機和無機組分，例如各種生物聚合物 (藻酸鹽和其它多糖等)、膠原、磷酸鈣(包括羥磷灰石)、硫酸鈣、三聚磷酸鈉、磷酸二氫鈉、 甘油磷酸鈉、氧化鈣、氫氧化鈣和各種有機酸或羧酸等。優選實施方式的詳細說明現在將使用用於實現所主張發明的實施例和附圖更具體地公開本發明。附 1、Oligomin 和 T-ChOS 的 HPLC 分析(TSK-Oligo 柱；TosoHaas，Japan)。圖2、對於第10-23天，各種氨基糖對積累的硫酸軟骨素釋放的影響。200和 400 μ g/ml的Oligomin (01 200和01 400)以及400 μ g/ml葡糖胺(D400)顯示出硫酸軟骨素分解的顯著下降。平均值和SEM(測量的標準差)；N(組)=對。圖3、在第20天和第22天之間，T-ChOS對釋放到培養基中的II型膠原的N-末端前肽(PIINP)的影響。除了 50、100、200和400 μ g/ml的T-ChOS以外，沒有影響。平均值和 SEM ；N (組)=4。圖4、在合併的第20天和第M天之間，T-ChOS+葡糖胺⑶對釋放到培養基中的累積的II型膠原的N-末端前肽(PIINP)的影響。平均值和SEM ；N(組)=8。圖5、從第17天到第M天，T-ChOS+葡糖胺⑶、葡糖胺和IGF-I對累積的硫酸軟骨素釋放的影響。平均值和SEM ;N(組)=16。IGF-I和T-ChOS+D顯示出累積的硫酸軟骨素釋放的顯著增加。基於圖9示出的數據。圖6、在人OA軟骨外植體中，在第18天至第25天，T-ChOS對培養基中II型膠原的N-末端前肽(PIINP)水平的劑量相關誘導。只有T-ChOS顯示出誘導。星號表示通過 t-檢驗 400 μ g/ml 至 0 μ g/ml 的 T-ChOS 的顯著性(* = ρ < 0. 05，** = ρ < 0. 01，*** = ρ < 0. 001)。平均值禾口 SEM ；N(組)=4。圖7、對於該時期，三種氨基糖對IL-40表達的影響(N = 4 ；平均值和SEM)。圖8、在第15-25天，對於對照、葡糖胺、Oligomin和T-ChOS組，與PIINP表達相關的IL-40的表達。只有T-ChOS組顯示出明顯更高的PIINP表達(N = 20)。圖9、從第9天到第17天，葡糖胺、T-ChOS以及T-ChOS+葡糖胺組合對積累的踝直徑(Acc AD)的影響。0 未處理，D21 :21mg/kg/大鼠的葡糖胺，T :7. lmg/kg/大鼠的T-ChOS，
8T+D14、21、28 =T 分別地，7. lmg/kg/ 大鼠的 T_Ch0S+14、21 和 28mg/kg/ 大鼠的葡糖胺。

圖10、葡糖胺、T-ChOS (T)以及T-ChOS+葡糖胺組合(T+D21)對踝軟骨損傷分數的影響。數字表示每日劑量(mg/kg大鼠)。星號表示通過t檢測與0的顯著差異。圖11、葡糖胺、T-ChOS (T)以及T-ChOS+葡糖胺組合(T+D21)對踝骨吸收分數的影響。數字表示每日劑量(mg/kg大鼠)。星號表示通過t檢測與0的顯著差異。圖12、葡糖胺、T-ChOS (T)以及T-ChOS+葡糖胺組合(T+D21)對踝關節翳分數的影響。數字表示每日劑量(mg/kg大鼠)。星號表示通過t檢測與0的顯著差異。圖13、葡糖胺、T-ChOS (T)以及T-ChOS+葡糖胺組合(T+D21)對踝總組織病理學分數的影響。數字表示每日劑量(mg/kg大鼠)。星號表示通過t檢測與0的顯著差異。圖14、葡糖胺(D21) ,T-ChOS(T)以及T-ChOS+葡糖胺組合(T+D)對膝蓋關節翳形成的影響。數字表示每日劑量(mg/kg大鼠)。星號表示通過t檢測與0的顯著差異。圖15、葡糖胺(D21) ,T-ChOS(T)以及T-ChOS+葡糖胺組合(T+D)對膝蓋骨吸收的影響。數字表示每日劑量(mg/kg大鼠)。星號表示通過t檢測與0的顯著差異。圖16、葡糖胺(D21) ,T-ChOS(T)以及T-ChOS+葡糖胺組合(T+D)對膝蓋總組織病理學分數的影響。數字表示每日劑量(mg/kg大鼠)。星號表示通過t檢測與0的顯著差
已圖17、01igomin、單獨T-ChOS以及T-ChOS組合N-乙醯基葡糖胺(A)或葡糖胺(D) 對風溼性關節炎(RA)病患的疼痛和炎症的影響。評級為0(未減輕)到10(徹底減輕)。 每日劑量為Oligomin :2200mg,T-ChOS :700mg，N-乙醯基葡糖胺(A)或葡糖胺(D) :1500mg。 箭頭表示單體何時加入T-ChOS。
實施例實施例1 在合成代謝和分解代謝條件下，特異氨基糖在牛和人軟骨外植體中的再生作用這些實驗的目的是評估在非刺激條件下，氨基糖對關節軟骨中的軟骨形成的影響。這些實驗可以將這些氨基糖的可能的軟骨合成代謝效應鑑定為潛在的骨關節炎藥物。 100ng/ml胰島素樣生長因子_1 (IGF-I)用作軟骨外植體的陽性合成代謝刺激對照。材料和方法所用所有試劑均為分析級。培養基包括含有青黴素和鏈黴素(Life Technologies, US)的 Dulbecco，s Modified Eagle Medium(D-MEM)。人重組制瘤素 M(OSM) 來自Sigma Aldrich (UK)，而人重組腫瘤壞死因子α (TNF- α )來自R&D Systems，UK。氨基糖生產和分析Oligomin.由Genis以中試規模(lot G061023)生產幾丁低聚糖。簡言之，用幾丁質酶使部分去乙醯化的幾丁質(DDA 45% )幾乎徹底水解。對溶液進行超濾(IOkDa)以除去幾丁質酶和不溶物並進行噴霧乾燥。T-ChOS.由Genis以中試規模(lot G051128)從Oligomin生產具有極大降低的 DP1-4量的幾丁低聚物組合物。通過超濾除去單體(DPI或N-乙醯基葡糖胺)以及減少較短的低聚物。將產物噴霧乾燥。N-乙醯基葡糖胺(A)和葡糖胺(D)購自YSK，Japan。對於所有氨基糖的分析，使用Beckman Gold體系來應用HPLC。使用TSK-oligo柱(TosoHaas，Japan)，通過分子量來分離ChOS (DPI、DP2等)。溶劑是5mM氫氧化銨，pH 10.0，流速為 0. 5ml/min，光吸收為205nm，注射體積為20 μ 1並且氨基糖濃度為10mg/ml。對於軟骨外植體實驗，所檢測的氨基糖濃度如下。Oligomin和T-ChOS在培養基中為50、100、200和400μ g/ml。N-乙醯基葡糖胺(A)和葡糖胺(D)在培養基中為200和 400 μ g/ml。在每種培養基中，A+D組合為200 μ g/ml。軟骨外植體合成代謝條件將牛關節軟骨外植體培養物用作軟骨退行性疾病的模型，其使得實驗處於穩健且簡單的檢測-模型/檢測法中，而可以調查生長因子和藥物對軟骨代謝的影響[Olsen， Α. K.等人，Anabolic and catabolic function of chondrocyte es vivo is reflected by the metabolic processing of type II collagen. Osteoarthritis and Cartilage, 2007. 15(3)第 335-342 頁]。關節軟骨外植體的製備在LAF工作檯中於半滅菌條件下打開膝蓋。在一步移動策略中除去表面關節軟骨的切口，只除去最外層。太深的切口將包含下面的軟骨下骨/軟骨架構材料(subchondral bone/chondrosteous material)。從股骨和脛骨收穫均一的外植體。避免在髁處來自軟骨的外植體。將外植體轉移到含有PBS+pen/str印(青黴素/鏈黴素)的Petri-盤中。製備和培養對外植體單獨稱重並在半滅菌條件下，在氣流工作檯中轉移至滅菌的96孔板。之前，用200μ L PBS+pen/str印填充孔並在稱重之後保持外植體溼潤。然後除去PBS，並且根據計劃，以200 μ L/孔將含有不同類型和濃度的氨基糖的培養基施加到孔中。對於每個實驗使用4個外植體重複。將板在37°C和5% CO2下以50rpm振蕩孵育。用(X)2可滲透的塑膠袋蓋住板以限制/避免孢子汙染。每兩天-三天替換條件培養基，並將上清轉移到新的 96孔板中並於-20°C儲存直到實驗最後。根據每兩天-三天的計劃，以200 μ L/孔將不同類型和濃度的氨基糖的新鮮培養基施加到孔中。在實驗的最後日期天)，除去上清液並且通過Alamar Blue來測量細胞存活率以調查細胞數和存活率。也在實驗的最後日期，處理軟骨來以多種檢測法從軟骨提取蛋白質。測量上清液中的II型膠原形成(PIINP)，用於聚蛋白多糖酶介導的聚蛋白多糖的 j)·^· (aggrecanase-mediated aggrecan degradation) 0 iliMife f=| Nordic Bioscience 的 ELISA試劑盒。細胞存活率和細胞數測量為了確保氨基糖的特異且非毒性作用，通過Alamar Blue測量軟骨細胞的代謝活性，之前已顯示出該活性與細胞數和細胞存活率相關。軟骨TURNOVER的評估聚蛋白多糖酶介導的聚蛋白多糖的分解聚蛋白多糖片段374ARGS的檢測在夾心ELISA體系中，將檢測N-末端374ARGS的聚蛋白多糖酶源片段的ELISA與兩種單克隆抗體組合。下面的方法描述於Karsdal等人，Arthritis & Rheumatism，2007. 56 (5)第 1549-1558 頁。
總蛋白聚糖含量-SGAG的測量為了檢測硫酸葡糖氨基葡聚糖(也就是硫酸軟骨素，sGAG)釋放，根據製造商的說明書(WieSlab，S)使用用於體外分析GAG釋放的定量染料結合檢測法。II 型膠原形成PIINP ELISA基於識別PIINP分子外顯子2 (PIIANP)外的表位的抗體，通過特異的ELISA檢測法測量II型膠原形成。因此，ELISA對於IIA或IIB形式並非特異的而是與這兩種形式反應。軟骨提取提取軟骨來測定相比於分泌到培養基中的軟骨，不同蛋白質的軟骨含量。在液氮中冷凍軟骨外植體。使用Bessman Tissue Pulverizer根據製造商提供的說明書研磨該冷凍的外植體。使用冷凍的手術刀將粉末放Hml試管中。加入冰冷卻的 Digestive Buffer (50mM 含有 0. IM NaCl 和 0· Triton X-IOO 的 Tris · HCl 緩衝液，pH 7.4)並且使用 Polytron PT-MR 3000 均質器(Brinkmann, Littau-Switzerland)使溶液均質化30sec。然後在15，OOOrpm離心分離該均質物20min並且收集上清並在進一步分析前於-80°C儲存。總膠原含量羥脯氨酸的測量使用 Podenphant (Podenphant，J.，N. Larsen, and C. Christiansen，An easy and reliable method for determination of urinary hydroxyproline. Clinica Chimica Acta 1984. 142 第145-148頁)所述方法的改良版本，通過測量外植體中的羥脯氨酸含量來評估總膠原。結果氨基糖分析圖1示出Oligomin和Τ-ChOS幾丁低聚糖的比較。對於Oligomin，單體至三聚物 (DP1-DP3)是主要組分(58.4% )並且DP4以及更高的低聚物是41. 6%。對於T-ChOS，沒有檢測到單體(DPI)並且DP1-DP3部分只有6. 1 %。八聚物(DP8) 是T-ChOS中的主要低聚物。DP4和更長的低聚物是主要的部分或為93. 9%。N-乙醯基葡糖胺(A)和葡糖胺(D)的HPLC分析揭示單體(DPI)是主要組分並且沒有檢測到低聚物(結果未示出)。牛軟骨外植體研究不同氨基糖的影響合成代謝條件軟骨外植體存活率沒有受到氨基糖的影響，通過Alamar Blue檢測法在處理後期判斷，在各種氨基糖和對照組之間沒有觀察到顯著差異。從第3天到第23天以2-3天的間隔測量在外植體培養基中的硫酸軟骨素(ChS) 釋放。對於後期(第10-23天；線性回歸)，存在oligomin劑量相關的減少影響。當分析第10-23天的積累的ChS釋放時(圖2)，對該時期存在清楚的Oligomin誘導的ChS釋放的減少(對於 Oligomin 200 和 400μ g/ml，p < 0. 05 減少)。葡糖胺(D 400 μ g/ml) 具有相同的影響(P < 0. 05)。T-ChOS和N-乙醯基葡糖胺(A)對於該時期積累的硫酸軟骨素釋放沒有顯著影響(圖2)。
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11型膠原的N-末端前肽(PIINP)在所有檢測的生物標記中，II型膠原形成(PIINP濃度)是受氨基糖影響最明顯的。這是隨著在2-3天的間隔從軟骨外植體釋放到培養基中來測量的。只有T-ChOS具有強劑量相關效應。這一效應僅在氨基糖孵育的後期被觀察到。在第20天，在活體外沒有觀察到不同氨基糖的影響。PIINP濃度在0. 1和0.2ng/mlmg軟骨之間。在第22天，存在明顯的PIINP劑量相關的增加，但僅僅是通過T-ChOS (圖幻。該影響在所有濃度(50，100，200 和400yg/ml)下都與零(M)顯著不同並且最大影響為0. 62ng/ml mg軟骨或者對照的17 倍。在相同濃度範圍下，沒有發現通過Oligomin的影響。單糖葡糖胺(D)和N-乙醯基葡糖胺(A)沒有影響(圖幻。因此，在所有檢測的氨基糖中，僅有T-ChOS對PIINP表達具有強劑量相關效應。對於提取的軟骨蛋白含量，在各種氨基糖(或它們的濃度)和對照之間沒有發現顯著差異。然而，隨著Oligomin濃度增加，軟骨蛋白含量存在顯著的線性減少(p = 0. 027 ； N= 20)。對於Oligomin，隨著積累的硫酸軟骨素(ChQ釋放增加，存在軟骨蛋白含量的線性增加(P = 0. 019 ；N = 20)。T-ChOS 和葡糖胺的組合(T-ChOS+D)在這一組牛外植體實驗中，葡糖胺ΟΟΟμ g/ml)與T-ChOS (5和400 μ g/ml)組合來檢測。對照是僅有T-ChOS (5和400 μ g/ml)，僅有Oligomin (5和400 μ g/ml)或僅有葡糖胺。lOOng/ml胰島素樣生長因子-I(IGF-I)用作陽性合成代謝刺激對照。11型膠原的N-末端前肽(PIINP)存在對PIINP釋放的強T-ChOS誘導並且T-ChOS+葡糖胺000 μ g/ml+200 μ g/ml) 進一步誘導ΡΠΝΡ。這在觀察積累效應時明顯(圖4)。Mudent』 s檢驗揭示了 T-ChOS和 T-ChOS+D之間對積累的PIINP釋放的顯著差異(圖4)。單獨的葡糖胺沒有影響。在第20 和24天，具有或沒有200 μ g/ml葡糖胺(D)的50-400 μ g/ml Oligomin對PIINP釋放沒有任何影響。T-ChOS, T-ChOS+D和IGF-I對積累的硫酸軟骨素釋放(第17- 天)的的影響示出於圖5。IGF-I和T-ChOS+D都具有積累的硫酸軟骨素釋放(第17- 天)的顯著增加， 但是單獨的T-ChOS或者單獨的葡糖胺的確都沒有任何顯著效應(圖5)。在第M天提取的軟骨蛋白檢測法沒有揭示T-ChOS，T-ChOS+D或IGF-I的任何顯
著影響。人軟骨外植體研究從罹患骨關節炎的40歲女性的膝蓋獲得軟骨外植體。將外植體在合成代謝條件下於生長培養基中保持25天。每2-3天施加新鮮培養基。從第0到第25天將氨基糖 (Oligomin, T-ChOS，A和D ；不同濃度)保持在培養基中。在第9天，聚蛋白多糖酶介導的聚蛋白多糖分解(聚蛋白多糖片段 374ARGS-ELISA)未受到不同氨基糖的影響。II型膠原形成(PIINP濃度)是受氨基糖影響最明顯的。這是隨著在2-3天的間隔(第18-25天)從軟骨外植體釋放到培養基中來測量的。只有T-ChOS具有強劑量相關效應。這一效應僅在氨基糖孵育的後期被觀察到(第18、20、22和25天；圖6)。最大效應是在第22天為1. 37ng/ml mg軟骨或者對照的3. 9倍。在相同濃度範圍下，沒有發現通
12過Oligomin的影響。葡糖胺(D)沒有影響。因此，在所有檢測的氨基糖中，僅有T-ChOS對 PIINP表達具有強劑量相關效應。由於YKL-40是推薦的T-ChOS的受體，在第4、11、15、20和25天，在用400 μ g/ml 的T-ChOS，Oligomin和葡糖胺⑶處理的外植體中分析培養基中的細胞外IL-40釋放。 圖7示出對於該時期的不同氨基糖的影響。對於對照，在第10和20天之間存在IL-40表達的顯著降低。對於後期(第15-25天)，Oligomin在較小程度上以及T-ChOS都維持高 IL-40表達。在第15天檢測到顯著差異，其T-ChOS維持高IL-40表達。葡糖胺沒有影響(圖7)。圖8示出對於第15-25天期間，對所有檢測組在IL-40和PIINP表達之間的關係。只有T-ChOS誘導PIINP釋放並且維持高IL-40表達(明顯的線性回歸)。這一關係在從數據中排除T-ChOS組時消失(非線性回歸)。在第25天，總硫酸軟骨素含量(硫酸軟骨素的提取)未受到各種氨基糖的影響。 在第25天，外植體中的總蛋白水平(BioRad蛋白檢測法)和總羥脯氨酸水平都未受到影響。在第25天，通過氨基糖誘導人OA關節軟骨外植體的細胞存活率(Alamar Blue檢測法)。在檢測的所有三種氨基糖中都有劑量相關的效應(線性回歸；P < 0. 05)。通過 Oligomin的效應最強，然後是通過T-ChOS以及最小是通過葡糖胺。實施例2 使用II型膠原誘導的風溼性關節炎大鼠模型，T-ChOS組合葡糖胺對風溼性關節炎的影響介紹這一實施例使用RA大鼠模型描述了殼低聚糖的可能效應的動物研究。所檢測的 ChOS混合物是T-ChOS組合物。這一研究的目的是調查葡糖胺和T-ChOS的組合是否將比單獨的T-ChOS具有更強的影響。材料和方法所用動物是對於關節炎誘導組為每組10隻，對於非誘導對照組為每組4隻，每籠住4-5隻。對於關節炎誘導組，用異氟烷麻醉動物並且在第O和6天在尾巴基部以及背部兩位點給予 300 μ 1 含有 2mg/ml 的牛 II 型膠原(Elastin Products, Owensville, MO)的 Freund' s Incomplete Adjuvant (Difco, Detroit, MI)的皮下 / 皮膚內(SC/ID)注射。在研究的第O天開始通過口服途徑服用各種低聚物和/或單體組合物(QD在M小時間隔) 並且持續16天。實驗組如表1所示表1
組N處理時期0-16天14正常對照+水媒介210關節炎+水媒介310關節炎+T-ChOS (7. lmg/kg)410關節炎+D(2l.%g/kg)
1權利要求
1.一種組合物，包括-由N-乙醯基葡糖胺(A)和葡糖胺(D)組成的治療有效的幾丁低聚物，其中該幾丁低聚物包括滿足下麵條件的雜幾丁低聚物-所述低聚物具有5-20個單體殘基的鏈長，-每條低聚物鏈能夠在低聚物鏈的任一端或兩端具有兩個N-乙醯基葡糖胺殘基(AA)，-低聚物的剩餘內部部分具有至少足量的D殘基以避免所述內部鏈的序列包括一個 N-乙醯基葡糖胺殘基(A)與另一個N-乙醯基葡糖胺殘基(A)相鄰(例如AA)，-與葡糖胺和/或N-乙醯基葡糖胺組合。
2.根據權利要求1的組合物，其中所述治療有效的幾丁低聚物的脫乙醯化程度(DD)是在30-60%的範圍內。
3.根據權利要求1或2的組合物，其中葡糖胺和/或N-乙醯基葡糖胺的單體與所述治療有效的幾丁低聚物的比例在約1 10至約10 1之間的範圍內。
4.根據權利要求3的組合物，其中單體和低聚物的所述比例在約1 5至約5 1之間的範圍內。
5.根據權利要求4的組合物，其中單體和低聚物的所述比例在約1 2至約4 1之間的範圍內。
6.根據前述任一權利要求的組合物，用於製造生物材料/藥物。
7.根據權利要求1-6中任一項的組合物，用於製造抑制炎症和/或增強組織再生的生物材料/藥物。
8.根據權利要求1-6中任一項的組合物，該生物材料/藥物用於治療能夠將哺乳動物幾丁質酶/幾丁質酶樣蛋白當作治療靶標的任何疾病或症狀。
9.根據前述任一權利要求的組合物，其中該生物材料/藥物在治癒哺乳動物的斷裂的、切斷的、或患病的軟骨或骨時增強組織再生。
10.根據前述任一權利要求的組合物，其中該生物材料也包括選自下面的組分磷酸鈣、包括羥磷灰石、硫酸鈣、三聚磷酸鈉、藻酸鹽、膠原、透明質酸和殼聚糖聚合物。
11.一種包括根據權利要求1或2的治療有效的幾丁低聚物和葡糖胺和/或N-乙醯基葡糖胺的藥學組合物。
12.權利要求11的藥學組合物，其形式選自由粉劑、懸劑、凝膠、溶膠、氣霧劑、糊劑、 膜、泡沫劑、丸劑和膠囊組成的組。
13.權利要求11的藥學組合物，包括藥學可接受的賦形劑。
14.根據權利要求1-12中任一項的組合物在製造用於組織再生和/或抗炎症的生物材料/藥物中的應用。
15.一種組合物在調控膠原合成以在組織修復時預防疤痕形成中的應用，該組合物包括-由N-乙醯基葡糖胺(A)和葡糖胺(D)組成的治療有效的幾丁低聚物，其中該幾丁低聚物包括滿足下麵條件的雜幾丁低聚物-所述低聚物具有4-20個單體殘基的鏈長，-每條低聚物鏈能夠在低聚物鏈的任一端或兩端具有兩個N-乙醯基葡糖胺殘基(AA)，-低聚物的剩餘內部部分具有至少足量的D殘基間隔物以避免所述內部鏈的序列包括一個N-乙醯基葡糖胺殘基(A)與另一個N-乙醯基葡糖胺殘基相鄰(例如AA)，和 -葡糖胺和/或N-乙醯基葡糖胺。
16. 一種組合物在治療選自風溼性關節炎和骨關節炎的疾病中的應用，該組合物包括-由N-乙醯基葡糖胺(A)和葡糖胺(D)組成的治療有效的幾丁低聚物，其中該幾丁低聚物包括滿足下麵條件的雜幾丁低聚物-所述低聚物具有4-20個單體殘基的鏈長，-每條低聚物鏈能夠在低聚物鏈的任一端或兩端具有兩個N-乙醯基葡糖胺殘基(AA)， -低聚物的剩餘內部部分具有至少足量的D殘基間隔物以避免所述內部鏈的序列包括一個N-乙醯基葡糖胺殘基(A)與另一個N-乙醯基葡糖胺殘基相鄰(例如AA)，和 -葡糖胺和/或N-乙醯基葡糖胺。
全文摘要
用於治療自體免疫疾病的新型組合物，本發明涉及通過在有需要的人類和其它哺乳動物中全身或局部給予的T-ChOS和葡糖胺和/或N-乙醯基葡糖胺的協同效應來減少炎性並促進組織修復或組織再生的組合物、用途和方法。
文檔編號A61P19/02GK102159218SQ200980136783
公開日2011年8月17日 申請日期2009年7月20日 優先權日2008年7月18日
發明者喬恩·M·埃納爾松, 約翰尼斯·吉斯拉森, 黃俊豪 申請人:傑尼斯Ehf公司