用於測量生物液體中的分析物的自我限定大小的組合物和檢驗設備的製作方法

2023-05-29 11:18:51

專利名稱：用於測量生物液體中的分析物的自我限定大小的組合物和檢驗設備的製作方法
技術領域：
本發明主要涉及用於測定生物液體中的分析物的量的製劑。在一個重要的應用中，本發明應用於測量血液或其它液體中的葡萄糖的含量。
背景技術：
生物液體如全血中的分析物的量的測定，在某些疫病的診斷和治療方面十分重要。例如測定糖尿病患者個體血液中的葡萄糖水平，糖尿病患者必須頻繁地檢查血液中的葡萄糖水平以調整他們的飲物和藥物。可以通過一些方法測量血液中的葡萄糖的含量。一種方法是使用電化學的生物傳感器，其將葡萄糖含量與所測得的電流相聯繫。另一種方法提供葡萄糖含量的可視性指示，例如通過指示劑的反應顯現顏色。本發明在光學測量上特別有用，同時也應用於電化學生物傳感器。
已有許多專利描述了使用指示劑的方法，當它們在一系列反應的最後一步被化學氧化時顯現顏色或顯現其它可測性響應。例如，使用酶的方法，例如分析物氧化酶(例如葡萄糖氧化酶)或分析物脫氫酶(例如葡萄糖脫氫酶)。所採用的流程是相似的，但是使用了不同的酶、介質和指示劑。
許多美國專利和專利申請中教導了使用葡萄糖氧化酶的方法。代表性的是美國專利US4,211,845、US4,808,529、US5,116,729、US5,264,348、US5,620,863和US2003/0077702 A1。這些專利教導了隨著過氧化氫的釋放將葡萄糖氧化成葡萄糖酸的方法。據說過氧化氫在過氧化物酶的存在下氧化指示劑而產生可測量的顏色，其指示血液樣本中的葡萄糖的含量。最近一些專利提出了葡萄糖隨著過氧化氫的釋放首先轉換成葡萄糖酸，再轉化成葡糖酸內酯的方法。也有建議認為先形成葡糖酸內酯再水解成葡萄糖酸。不管哪種方法過程是正確的，葡萄糖氧化酶都已被廣泛地運用在乾燥帶和其他用於測量血液中葡萄糖含量的技術上。
在葡萄糖傳感器上使用了不同的指示劑，例如對二氨基聯苯型指示劑和雜環吖嗪。例如，3，3』，5，5』-四甲基聯苯胺和丁香醛連氮，發光氨，鄰聯甲苯胺，鄰聯茴香胺和其它。另指示劑家族是四唑染料前體。描述此類指示劑的專利例子包括美國專利US5,126,275、US5,322,680、US5,300,637、US5,290,536、US5,360,595和US6,586,199。在下述的發明優選實施方案中使用了四唑指示劑。
關於本發明中特別引起注意的是美國專利US6,200,773和它的原案美國專利US5,902,731中描述的方法。在這些專利中，在血液中的葡萄糖含量的檢驗中使用了葡萄糖脫氫酶，作為輔助因子的NAD或PQQ或它們的衍生物、四唑染料前體、硫辛醯胺脫氫酶或類似物和亞硝酸鹽。專利『773的圖5是通過四唑染料前體還原成甲 而顯現顏色來檢測葡萄糖的方法的圖。
涉及使用酶測定血液中葡萄糖的量的在先專利是美國專利US3,630,957。葡萄糖氧化酶和過氧化物酶均勻地分配到一個防水的聚合物膜中以與葡萄糖反應並產生顏色。該膜能被支持在基質例如聚合物膜上。其中建議可另入包括白堊、二氧化鈦、膠體矽酸(在實施例中使用了)等，並且可包括顏料以使膜不透明。將血液應用於含試劑的膜，然後在讀取所顯現的顏色前將其去除。在美國專利US5,968,765中也討論了使用不透明填充物來減少在由血紅細胞造成的對葡萄糖測量方面的幹擾。
另一個引人注意的是美國專利US4,312,834，其中描述了包括不溶性粒子的防水膜的使用，該粒子在阻礙大組分進入的同時給試劑提供通道。膜可被支撐在載體上，比如膜、箔等。考慮到確定的分子的進入，專利權人指出微粒(稱為「膜開啟者」(film opener))的量應該有一定的限度。建議了不同類型的粒子，如硅藻土膠、矽膠和石膏等。二氧化鈦被建議作為膜開啟者和提高膜緩和性質的一個途徑。一般而言，實施例中200-400μm相對厚的膜沉積在基質膜上；在某些情況下應用多層膜。如在『957專利中，過量的樣品，例如血液，在反應發生後去除。
許多專利都有測試條的描述，因為它們廣泛用於檢測生物樣本中的分析物。如果要獲得準確並且一致的結果，每個測試條應用都有其必須要解決的獨特問題。檢驗全血要求血紅細胞不幹擾指示葡萄糖存在的所顯現的顏色，也不幹擾電化學測量。在某些情況中特定成份加入到測試條中以使血紅細胞從樣本中被過濾。在其它情況中，在一段時間過去後去除樣本，可以測量顯現的顏色。當檢驗全血時遇到了涉及樣本中的血紅細胞濃度的問題。通常通過血細胞比容值來測量血紅細胞它們在樣本中的量。因為血液樣本中的血細胞比容可以在20至60％間變化，所以葡萄糖的測量也許會受影響。同時，運載葡萄糖到試劑以顯現顏色(或電化學響應)的血漿移動也許會延遲或未完成。
防止血紅細胞到達與葡萄糖反應的試劑是許多本領域技術人員的關注點。在上述『765專利的測試條中，0.002至0.2英寸(50.8到5080μm)厚的多孔膜加入了使血紅細胞從全血中分離出來的試劑，其包括混在其中的聚丙烯酸、指示劑和如二氧化鈦、滑石等的不透明填充物。塗層溶液沉積在多孔膜的表面或者吸收在膜內。
在美國專利US5,306,623中，一種能分離全血的塗層選自包括聚乙烯醇磺酸、聚乙二醇、聚苯乙烯磺酸、羥丙基纖維素、聚丙烯乙二醇、聚乙烯醇和聚丙烯酸的聚合物。分離塗層連同用於檢驗血的試劑一起沉澱在多孔基體上。
美國專利US5,789,255討論了血測試條對全血血細胞比容的敏感度。發明者發現增加0.1-2％w/v的高分子量(＞750000)丙烯酸聚合物降低了變化的血細胞比容對葡萄糖測量的影響。
用於測量全血樣本中葡萄糖的理想測試條應該對血液樣本中血細胞比容不敏感，並提供快速、準確和一致的結果。快速的響應時間加上穩定的端點(endpoint)將提供一個大大降低對時間依賴性並因此對使用者來說更為便利的檢驗。對使用者來說另一個重要方面是，測試條應該對所用血液量不敏感。下面更詳細地對很接近理想的性能的測試條進行描述。

發明內容
本發明主要涉及用於測量生物液體中分析物的光學或電化學方法中的自我限定大小(size self-limiting)的試劑製劑和含該試劑製劑的測試條。雖然葡萄糖是特別感興趣的分析物，但是其它生物液體中的其它分析物也被認為在本發明的範圍內。
該創造性製劑主要包括含標稱大小約0.05至20μm，優選約1至10μm的不溶於水粒子的水溶性可膨脹的聚合物基體和與分析物反應的酶體系。水不溶性粒子與水溶性可膨脹的聚合物基體的重量比是約1/2至2/1。
在一個優選實施方案中，本發明的試劑製劑包括作為反應物的用於與葡萄糖反應的酶體系和指示劑。酶體系包括葡萄糖脫氫酶和該酶的輔助因子如NAD、四唑鹽指示劑，以及在特別優選實施方案中作為介質的硫辛醯胺脫氫酶。試劑與含不溶於水的小粒子的水溶性可膨脹的聚合物基體結合，粒子優選二氧化鈦和碳酸鈣。聚合物基體優選選自聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和它們的共聚體。粒子與聚合物基體的重量比優選為約1/2至2/1。在製備測試條中，本發明的製劑流延成無孔基質上厚度約6至16μm的膜，優選約7至10μm。膜用包括毛細管通道的粘合層和防護頂覆蓋來完成測試條。覆蓋可以是透明的或不透明的。
另一個方面，本發明是通過光學或電化學方法檢驗生物液體中分析物如全血中葡萄糖的方法，其提供了快速穩定的響應並對樣本的量不敏感。本發明的方法使用測試條，其中薄膜被流延在無孔基質上，膜包括在水溶性可膨脹的聚合物基體中的標稱大小0.05至20μm優選1至10μm的不溶於水粒子。薄膜優選厚度約6至16μm，更優選約7至10μm；並且反射粒子與聚合物基體的重量比優選為約1/2至2/1。


圖1a、b是實施例1結果的曲線圖。
圖2a、b是實施例2結果的曲線圖。
圖3a、b、c是實施例3結果的曲線圖。
圖4a、b、c是實施例4結果的曲線圖。
具體實施方案本發明主要涉及用於測量生物液體中的分析物的製劑，分析物包括但不局限於葡萄糖、乳酸鹽、膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸、膽紅素、抗壞血酸、過氧化氫和尿酸。本發明的一個重要應用是測量全血中的葡萄糖含量，其在下面被更詳細地描述。製劑可以替代其它試劑用於測量葡萄糖，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。
測量血液中葡萄糖光學方法血液中的葡萄糖可以通過使用酶來氧化葡萄糖的試劑體系來測定，酶包括但不局限於己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖脫氫酶-PQQ和葡萄糖氧化酶。
在使用葡萄糖氧化酶的方法中，這些酶與葡萄糖反應產生氧化的葡萄糖和過氧化氫。過氧化氫在過氧化物酶存在條件下氧化指示劑化合物。氧化的指示劑產生與血液樣本中的葡萄糖含量相聯繫的顏色。
在本發明的其它實施方案中，葡萄糖脫氫酶連同輔助因子如NAD、FAD或PQQ、介質如硫辛醯胺脫氫酶和指示劑如四唑染料前體一起被使用以產生對樣本中葡萄糖含量成比例的可見響應。這種反應通常通過以下順序的反應被描述葡萄糖+GDH-輔助因子氧化→葡糖酸內酯+GDH-輔助因子還原GDH-輔助因子還原+介質氧化→GDH-輔助因子氧化+介質還原介質還原+四唑指示劑→介質氧化+甲 根據這種順序的反應，葡萄糖轉變成葡糖酸內酯同時脫氫酶-輔助因子被還原然後為了與可用的葡萄糖進一步反應通過介質被再氧化。
脫氫酶與葡萄糖特異性反應的脫氫酶稱為葡萄糖脫氫酶。它們是來自Toyobo、Kyowa、Amano、Genzyme、Biozyme及其它的商用酶和或者是天然酶或者是通過典型發酵和/或重組方法產生的重組酶。為了有效果，這種脫氫酶需要輔助因子，例如NAD(煙醯胺腺嘌呤二核苷酸)和它的衍生物、FAD(黃素腺嘌呤二核苷酸)和它的衍生物和PQQ(吡咯並喹啉苯醌)和它的衍生物。
介質介質典型地用於在葡萄糖反應形成相應內酯後再氧化被還原的脫氫酶-輔助因子。介質的例子(美國專利US6,200,773中稱為氫化物提取器)包括硫辛醯胺脫氫酶、PMS(吩嗪硫酸二甲酯)、PES(吩嗪ethosulfate)、DCIP(2，6-dichlorophenolindophenol)和二茂鐵。在電化學傳感器中一般使用的介質是氰鐵酸鹽。
四唑指示劑在美國專利US5,360,595和上面提及的其它專利中廣泛描述了四唑指示劑。美國專利US6,200,773中確定的四唑染料前體被列出作為特別用於與脫氫酶-輔助因子的組合反應。其中之一是名為WST-4的四唑化合物，在下面實施例中使用了該化合物。
支持基質本發明的試劑層典型地置於實質上無孔的支持基質上，典型地聚合物條帶或柄(handle)例如聚酯、聚碳酸酯等。這種條帶具有適於與用於讀取顯現色的儀器一起使用的維度。例如，實施例所述的帶大約為0.060×0.160英寸(1.5×4.1mm)並且厚度約0.002英寸(51μm)。儘管對發明不是關鍵性的，不過基質優選是光學透明的，並可以含有一個或多個塗層，所述塗層在加工期間用於幫助粘合於其它表面例如試劑承載層。
電化學方法在電化學傳感器中，電壓應用於與血液(或其它)樣本接觸的電極以產生電流，測量電流且與樣本中的分析物(如葡萄糖)的量相聯繫。電極與固體層接觸，固體層含有氧化樣本中的分析物的酶試劑和再氧化已被還原的酶的介質。可通過下述步驟描述反應物葡萄糖+酶氧化→酶還原+氧化的葡萄糖(葡糖酸內酯)酶還原+n介質氧化→n介質還原+酶氧化n介質氧化→介質氧化+ne-其中酶氧化和酶還原是酶氧化還原作用中心的氧化和還原形式，而介質氧化和介質還原是介質的氧化和還原形式。
通常，除了在電化學傳感器中不需要指示劑外，在電化學傳感器中使用的反應製劑與在光學方法中使用的相似。
試劑層製劑本發明的試劑層是單一的非常薄的層，試劑層含有與血液樣本中的葡萄糖反應並產生快速均一的響應的試劑。試劑層的特徵在於自我限定大小的，在試劑層中阻礙大顆粒例如血紅細胞的運動並允許期望組分的移動。它一般可描述為水溶性可膨脹的聚合物基體所述基體含有不溶於水粒子、與葡萄糖反應的酶如葡萄糖脫氫酶及其輔助因子、介質和使用光學檢測的指示劑。另外的組分可以包括除垢劑、表面活性劑、和類似物。
聚合物可以包括聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和它們的共聚體。通常這種聚合物的特徵是具有相對低的分子量，例如100至100000道爾頓，包括低分子量低聚物。這種聚合物在水溶液中具有高溶解度並典型地具有低粘性。它們典型地溶解於維持理想pH如約7.5的緩衝溶液中。聚合物在中性pH溶液如全血中再水合時將會迅速膨脹。相信這種聚合物給試劑提供了分析物(如葡萄糖)的快速通道。
粒子可以包括二氧化鈦、碳酸鈣、膨潤土、二氧化矽、硫酸鋇、粉狀金屬、膠乳和類似物。適合的粒子實質上不溶於水且標稱大小約0.05至20μm，但優選在1至10μm範圍內。粒子不應具有允許試劑或樣本組分進行不期望的移動的孔。
除垢劑和表面活性劑可以包括專有材料，例如Silwet L-7600(聚二甲基矽氧烷甲基乙氧基化物)、Gerepon T-77(N-油烯基-N-牛磺酸甲酯鈉)、Zwittergentt 3-12(N-十二烷基-N，N-二甲基-3-胺基-1-丙磺酸鹽)和其它。
其它添加劑可以包括乳化劑、潤溼劑、增稠劑、顏料和相似的添加劑。
在塗層被施用及乾燥後，反射粒子與聚合物基體的重量比典型地在約1/2至2/1之間。塗層施用時厚度可以約6至16μm，優選約7至10μm。這種塗層比現有技術中一般所用的塗層薄很多。令人驚訝地發現這種薄膜能提供快速穩定的響應，如下面實施例所說明。
用於光學方法的測試條的製備如下製備試劑層，將上述組分混合成均一的水性塗層，使用本領域技術人員熟知技術將其施用於基質例如照相凹版或Mayer-rod塗層，然後乾燥。可以使用其它塗層方法，因為施用塗層的方法不認為是成功要素。
在將塗層施用於基質後，用防護頂(protective top)將它覆蓋，所述防護頂優選親水性聚酯塗層，其可以是透明或不透明。也可以加另外的不透明層。在反應層與防護頂之間放置一粘合層其連接另外兩個層並且還為血液樣本的引入形成毛細管通道。如實施例中所見，本發明的測試條對毛細管維度不敏感。換句話說，測試條不要求使用確定數量的(或其它生物液體)。
在下面每個實施例中，所列組分通過將聚合物、緩衝液、粒子、和添加劑混入蒸餾水中先低剪切再高剪切一段時間直至均一混合以製備基料來組合。然後，診斷試劑混入基料中，並且混合的組分施用於如10μm厚塗層的實質上無孔的聚碳酸酯或聚酯支持材料的條上。加入具有50或80μm厚度的間隔-粘合劑層3M F9460。最後通過使用轉移黏合劑施用親水性聚酯塗層的防護頂(3M 9971)。一片不透明的材料被應用於聚酯頂的外部以提供額外的小量不透明度。
電化學傳感器試劑層除光學指示劑外被應用於電極以產生電化學傳感器，例如美國專利申請US2001/0042683中舉例所述的那些。
實施例1通過混合表A所列組分製備試劑層，如前所述地將它們應用於基質上，完成測試條的製備。測試條的性能如下測定，將含已知量的葡萄糖的全血小樣本(約600nL)加入試劑層中，將測試條置於小讀取區(如0.75mm直徑)漫反射係數測量儀器並讀取超過約60秒時間所顯現的顏色。結果記錄如K/S，Kubelka-Munk函數(1-R)2/2R其中R是測量係數。如圖1a中所見，超過每個葡萄糖濃度檢驗時間，測量的顏色強度保持不變。給出葡萄糖儀表的響應所相對應的葡萄糖的含量，如圖1b中所示。很明顯響應時間是快速的，而且第12秒和第52秒的結果是非常相似的。因而，能推斷本發明的測試條可提供快速的響應並且不會對讀取時間過度敏感。
表A組分 濃度磷酸鉀，pH7.5 120mm膨潤土(1)0.78％二氧化鈦(2)5％ TiO2聚丙烯酸，鈉鹽(60k)(3)1.0％Gerepon T-77(4)0.45％Silwet L-7600(5)0.10％PEG 8000(6)2.0％WST-4四唑鹽(7)40mMNAD(8)10mM硫辛醯胺脫氫酶(9)1900μ/mL葡萄糖脫氫酶(10)1100μ/mL(1)Rheox，Bentone EW
(2)Sigma-Aldrich，T-8141(3)Polysciences有限公司，18611(4)Pragmatics有限公司(5)OSi Specialties(6)Pragmatics有限公司(7)Dojindo實驗室(8)Calbiochem(9)Unitika，Diaphorase I(10)Amano Enzyme有限公司，Amano 2實施例2通過混合表B所列組分製備另一個試劑層，如前所述地將它們施用於基質上，完成測試條的製備。如實施例1所述實施用含已知量的葡萄糖的全血樣本進行一系列的檢驗。檢驗結果如圖2a-b所示。可觀察到除了在更高濃度時顯現一些另外的顏色的，顯現的顏色超過60秒時間後基本上不變。
表B組分濃度磷酸鉀，pH7.5 120mm膨潤土(1)0.78％二氧化鈦(2)5.3％ TiO2PSSA(70k)(3)1.8％丙烯酸膠乳(4)3.6％Zwittergent 3-12(5)0.2％WST-4四唑鹽(6)40mmNAD(7)10mm硫辛醯胺脫氫酶(8)1900μ/mL葡萄糖脫氫酶(9)1100μ/mL(1)Rheox，Bentone EW
(2)Sigma-Aldrich，T-8141(3)Polysciences有限公司(4)Dow，UCAR Latex 455(5)Calbiochem(6)Dojindo實驗室(7)Sigma-Aldrich(9)Unitika，Diaphorase I(10)Amano Enzyme有限公司，Amano 2實施例3通過混合表C所列組分製備試劑層，如前所述將它們施用於基質上，完成測試條的製備。如實施例1和2所述對試劑層進行檢驗。結果如圖3a，b，c所示。圖3a和3b記錄的結果與實施例1和2的結果相似。圖2a和b中記錄的更高葡萄糖濃度下的另外的顏色顯現沒有出現在本實施例中。
另外的結果如圖3c所示。測量了具有3個不同血細胞比容(20％，40％，60％)的全血樣本並且繪出結果。很明顯，本發明的測試條未受到血液中血紅細胞的濃度顯著影響。
表C組分濃度Hepes，半鈉鹽(1)0.3m膨潤土(2)1.44％二氧化鈦(3)8％ TiO2聚丙烯酸，鈉鹽(60k)(4)3.85％PEG 8000(5)2.0％Rhodasurf-ON870(6)1.0％Gerepon T-77(7)0.6％Silwet L-7600(8)0.08％
WST-4四唑鹽(9)60mmNAD(10)10mm硫辛醯胺脫氫酶(11)1085μ/mL葡萄糖脫氫酶(12)2680μ/mL(1)Research Organics(2)Rheox，Bentone EW(3)Sigma-Aldrich，T-8141(4)Polysciences有限公司(5)Pragmatics有限公司(6)Pragmatics有限公司(7)Pragmatics有限公司(8)OSi Specialties(9)Dojindo實驗室(10)Sigma-Aldrich，#N-6522(11)Unitika，Diaphorase I(12)Toyobo有限公司，#GLD311實施例4通過混合表D所列組分製備試劑層，如前所述的將它們施用於基質上完成測試條的製備。如在前實施例所述對得到的測試條進行檢驗。結果如圖4a，b，c所示。測量的顏色顯現的濃度甚至比在前實施例所見的更濃。就是說，能推斷顏色顯現在最初幾秒內就充分地完成了。
圖4c顯示了本發明的測試條的另一個優勢。比較兩個測試條設計。第一個具有50μm的毛細管間隙，通過該間隙其血液樣本得以進入，同時第二個類型具有80μm的毛細管間隙。圖4c顯示了毛細管間隙高度的差異和產生的樣本體積的變化對結果沒有顯著影響。這一結果的原因是不清楚的，但是可歸因於葡萄糖在最初被血液樣本再水合後對從血液樣本進入試劑層的擴散的無能為力。無論如何，這顯示了發明測試條的一個顯著優勢，因為這意味著它們對所施用的血液的量不敏感。
表D組分 濃度磷酸鈉，pH7.40.25mm聚丙烯酸(60k)(1)6％聚乙烯醇(6k)(2)6％TiO2(3)15％CaCO3(4)10％Gerepon T-77(5)0.6％Surfonyl DF37(6)0.5％Silwet L-7600(7)0.1％WST-4四唑鹽(8)100mMNAD(9)19mM硫辛醯胺脫氫酶(10)1800μ/mL葡萄糖脫氫酶(11)4020μ/mL(1)Polysciences有限公司(2)Polysciences有限公司(3)DuPont，R-706(4)Huber有限公司，40ptifil□(5)Pragmatics有限公司(6)Air Products and Chemicals有限公司(7)OSi Specialties(8)Dojindo實驗室(9)Sigma-Aldrich，#N-6522(10)Unitika，Diaphorase I(11)Toyobo有限公司，#GLD311替選實施方案A
一種用於測量生物液體中的分析物的量的反應製劑，包括(a)水溶性可膨脹的聚合物基體；(b)標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子；(c)與所述分析物反應的酶體系；和其中所述水不溶性粒子與所述水溶性可膨脹的聚合物基體的重量比是約1/2至2/1。
替選實施方案B替選實施方案A的反應製劑，其中所述酶體系與葡萄糖、乳酸鹽、膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸、膽紅素、抗壞血酸、過氧化氫和尿酸中的一種反應。
替選實施方案C替選實施方案A的反應製劑，其中所述分析物是葡萄糖並且酶體系包括己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖脫氫酶-PQQ和葡萄糖氧化酶中的一種。
替選實施方案D替選實施方案A的反應製劑，其中所述粒子是二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化矽、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
替選實施方案E替選實施方案A的反應製劑，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體包括聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯、和它們的共聚體中的至少一種。
替選實施方案F替選實施方案A的反應製劑，進一步包括至少一種表面活性劑、除垢劑或增稠劑。
替選實施方案G替選實施方案A的反應製劑，用作厚度約6至16μm的塗層。
替選實施方案H替選實施方案G的反應製劑，其中所述塗層厚度約7至10μm。
替選實施方案I
替選實施方案A的反應製劑，其中所述水溶性可膨脹聚合物的分子量低於約100000。
替選實施方案J替選實施方案A的反應製劑，其中所述水不溶性粒子標稱大小約1至10μm。
替選處理K通過將所述生物液體樣本施加於測試條或電化學傳感器以獲得快速穩定的、對所述樣本量不敏感的響應的測量生物液體中的分析物的量的方法，所述方法包括(a)將所述生物液體樣本施加於所述測試條或電化學傳感器，所述測試條或電化學傳感器包括無孔基質，無孔基質上沉積了含在製劑中的用於與所述分析物反應的酶體系的薄膜，其中所述製劑包括水溶性可膨脹的聚合物基體及標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子；和(b)通過光學或電化學方法測量所述樣本對所述酶體系的響應，並測定所述生物液體中存在的所述分析物的量。
替選處理L替選處理K的方法，其中所述分析物是葡萄糖，且所述生物液體是全血。
替選處理M替選處理L的方法，其中所述酶體系包括葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶。
替選處理N替選處理K的方法，其中所述薄膜厚度約6至16μm。
替選處理O替選處理N的方法，其中所述薄膜厚度約7至10μm。
替選處理P替選處理K的方法，其中所述粒子與所述聚合物基體的重量比是約1/2至2/1。
替選處理Q替選處理K的方法，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體包括聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯、和它們的共聚體中的至少一種。
替選處理R替選處理K的方法，其中所述粒子包括二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化矽、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
替選處理S替選處理K的方法，其中所述可膨脹聚合物的分子量低於約100000。
替選處理T替選處理K的方法，其中所述不溶粒子標稱大小約1至10μm。
替選實施方案U一種用於測量全血中的葡萄糖含量的反應製劑，包括(a)水溶性可膨脹的聚合物基體；(b)標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子；(c)用於氧化所述葡萄糖的酶體系；(d)指示劑；其中(b)中反射粒子與聚合物基體的重量比是約1/2至2/1。
替選實施方案V替選實施方案U的反應製劑，其中所述酶體系包括己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖脫氫酶-PQQ和葡萄糖氧化酶中的一種。
替選實施方案W替選實施方案U的反應製劑，其中所述酶體系包括葡萄糖脫氫酶、所述葡萄糖脫氫酶的輔助因子、四唑鹽指示劑和介質。
替選實施方案X替選實施方案U的反應製劑，其中所述粒子是二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化矽、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
替選實施方案Y替選實施方案U的反應製劑，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體包括聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和其共聚體中的至少一種。
替選實施方案Z替選實施方案U的反應製劑，其中所述水溶性可膨脹聚合物溶於經緩衝以維持理想pH的溶液中。
替選實施方案AA替選實施方案U的反應製劑，進一步包括至少一種表面活性劑、除垢劑或增稠劑。
替選實施方案BB替選實施方案U的反應製劑，用作厚度約6至16μm的塗層。
替選實施方案CC替選實施方案BB的反應製劑，其中所述塗層厚度約7至10μm。
替選實施方案DD替選實施方案U的反應製劑，其中所述水溶性可膨脹聚合物的分子量低於約100000。
替選實施方案EE替選實施方案U的反應製劑，其中所述不溶粒子標稱大小約1至10μm。
替選實施方案FF一種用於測量全血樣本中的葡萄糖的含量的測試條，包括(a)實質上無孔的基質；(b)置於所述基質上的試劑層，所述試劑層包括(1)水溶性可膨脹的聚合物基體，(2)標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子，(3)用於氧化所述葡萄糖的酶體系，和(4)指示劑；(c)用於(b)中所述試劑層的防護層；
(d)在所述試劑層和所述防護層之間的粘合層，所述粘合層具有接受所述血液樣本的毛細管通道。
替選實施方案GG替選實施方案FF的測試條，其中所述酶體系包括己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖脫氫酶-PQQ和葡萄糖氧化酶中的一種。
替選實施方案HH替選實施方案FF的測試條，其中所述酶體系包括葡萄糖脫氫酶、所述葡萄糖脫氫酶的輔助因子、四唑鹽指示劑和介質。
替選實施方案II替選實施方案FF的測試條，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體是聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和其共聚體中的至少一種。
替選實施方案JJ替選實施方案FF的測試條，其中所述水不溶性粒子是二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化矽、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
替選實施方案KK替選實施方案FF的測試條，其中b(2)中的反射粒子與b(1)中聚合物基體的重量比是約1/2至2/1。
替選實施方案LL替選實施方案FF的測試條，其中所述聚合物溶於經緩衝以維持理想pH的溶液中。
替選實施方案MM替選實施方案FF的測試條，其中所述試劑層(b)中進一步包括至少一種表面活性劑、除垢劑或增稠劑。
替選實施方案NN替選實施方案MM的測試條，其中所述試劑層厚度約6至16μm。
替選實施方案OO替選實施方案NN的測試條，其中所述試劑層厚度約7至10μm。
替選實施方案PP替選實施方案FF的測試條，其中所述可膨脹聚合物的分子量低於約100000。
替選實施方案QQ替選實施方案FF的測試條，其中所述粒子標稱大小約1至10μm。
替選處理RR一種測量全血樣本中的葡萄糖的量的方法，其通過將血液樣本施加於測試條以獲得快速穩定且對血液樣本量不敏感的響應，所述方法包括(a)將所述血液樣本施加於所述測試條，所述測試條包括無孔基質，無孔基質上沉積了含在製劑中的用於與所述葡萄糖反應的酶體系的薄膜，其中的製劑包括水溶性可膨脹的聚合物基體、標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子、及指示劑；和(b)測量所述指示劑的響應，並測定所述血液樣本中所述葡萄糖的量。
替選處理SS替選處理RR的方法，其中所述酶體系包括葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶。
替選處理TT替選處理RR的方法，其中所述薄膜厚度約6至16μm。
替選處理UU替選處理TT的方法，其中所述薄膜厚度約7至10μm。
替選處理VV替選處理TT的方法，其中所述粒子與所述基體的重量比是約1/2至2/1。
替選處理WW替選處理RR的方法，其中粒子標稱大小約1至10μm。
替選處理XX替選處理RR的方法，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體包括聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和其共聚體中的至少一種。
替選處理YY替選處理RR的方法，其中所述粒子是二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化矽、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
替選處理ZZ替選處理RR的方法，其中所述水溶性可膨脹聚合物的分子量低於約100000。
權利要求
1.一種用於測量生物液體中的分析物的量的反應製劑，包括(a)水溶性可膨脹的聚合物基體；(b)標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子；(c)與所述分析物反應的酶體系；和其中所述水不溶性粒子與所述水溶性可膨脹的聚合物基體的重量比是約1/2至2/1。
2.如權利要求1所述的反應製劑，其中所述酶體系配製成與葡萄糖、乳酸鹽、膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸、膽紅素、抗壞血酸、過氧化氫和尿酸中的成員反應。
3.如權利要求1所述的反應製劑，其中所述分析物是葡萄糖，並且所述酶體系包括己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖脫氫酶-PQQ和葡萄糖氧化酶中的成員。
4.如權利要求1所述的反應製劑，其中所述粒子是二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化矽、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
5.如權利要求1所述的反應製劑，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體包括聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和它們的共聚體中的至少一種。
6.如權利要求1所述的反應製劑，進一步包括至少一種表面活性劑、除垢劑或增稠劑。
7.如權利要求1所述的反應製劑，用作厚度約6至16μm的塗層。
8.如權利要求7所述的反應製劑，其中所述塗層厚度約7至10μm。
9.如權利要求1所述的反應製劑，其中所述水溶性可膨脹聚合物的分子量低於約100000。
10.如權利要求1所述的反應製劑，其中所述水不溶性粒子標稱大小約1至10μm。
11.通過將生物液體樣本施加於測試條或電化學傳感器上並獲得快速穩定且對所述樣本量不敏感的響應來測量所述生物液體中的分析物的量的方法，所述方法包括(a)將所述生物液體樣本施加於所述測試條或電化學傳感器上，所述測試條或電化學傳感器包括無孔基質，無孔基質上沉積了含在製劑中的用於與所述分析物反應的酶體系的薄膜，所述製劑包括水溶性可膨脹的聚合物基體及標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子；和(b)通過光學或電化學方法測量所述樣本對所述酶體系的響應，並測定所述生物液體中存在的所述分析物的量。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述的分析物是葡萄糖，且所述的生物液體是全血。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述酶體系包括葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶。
14.如權利要求11所述的方法，其中所述薄膜厚度約6至16μm。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述薄膜厚度約7至10μm。
16.如權利要求11所述的方法，其中所述粒子與所述聚合物基體的重量比是約1/2至2/1。
17.如權利要求11所述的方法，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體包括聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和它們的共聚體中的至少一種。
18.如權利要求11所述的方法，其中所述粒子包括二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化矽、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
19.如權利要求11所述的方法，其中所述可膨脹聚合物的分子量低於約100000。
20.如權利要求11所述的方法，其中所述不溶粒子標稱大小約1至10μm。
21.一種用於測量全血中的葡萄糖含量的反應製劑，包括(a)水溶性可膨脹的聚合物基體；(b)標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子；(c)用於氧化所述葡萄糖的酶體系；(d)指示劑；其中(b)中的反射粒子與聚合物基體的重量比是約1/2至2/1。
22.如權利要求21所述的反應製劑，其中所述酶體系包括己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖脫氫酶-PQQ和葡萄糖氧化酶中的一種。
23.如權利要求21所述的反應製劑，其中所述酶體系含有葡萄糖脫氫酶、所述葡萄糖脫氫酶的輔助因子、四唑鹽指示劑和介質。
24.如權利要求21所述的反應製劑，其中所述粒子是二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化矽、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
25.如權利要求21所述的反應製劑，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體包括聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和其共聚體中的至少一種。
26.如權利要求21所述的反應製劑，其中所述水溶性可膨脹聚合物溶於經緩衝以維持理想pH的溶液中。
27.如權利要求21所述的反應製劑，進一步包括至少一種表面活性劑、除垢劑或增稠劑。
28.如權利要求21所述的反應製劑，用作厚度約6至16μm的塗層。
29.如權利要求28所述的反應製劑，其中所述塗層厚度約7至10μm。
30.如權利要求21所述的反應製劑，其中所述水溶性可膨脹聚合物的分子量低於約100000。
31.如權利要求21所述的反應製劑，其中所述不溶粒子標稱大小約1至10μm。
32.一種用於測量全血樣本中葡萄糖含量的測試條，包括(a)實質上無孔的基質；(b)置於所述基質上的試劑層，所述試劑層包括(1)水溶性可膨脹的聚合物基體，(2)標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子，(3)用於氧化所述葡萄糖的酶體系，和(4)指示劑；(c)用於(b)中所述試劑層的防護層；(d)在所述試劑層和所述防護層之間的粘合層，所述粘合層具有接受所述血液樣本的毛細管通道。
33.如權利要求32所述的測試條，其中所述酶體系包括己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖脫氫酶-PQQ和葡萄糖氧化酶中的成員。
34.如權利要求32所述的測試條，其中所述酶體系含有葡萄糖脫氫酶、所述葡萄糖脫氫酶的輔助因子、四唑鹽指示劑和介質。
35.如權利要求32所述的測試條，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體是聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和其共聚體中的至少一種。
36.如權利要求32所述的測試條，其中所述水不溶性粒子是二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化矽、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
37.如權利要求32所述的測試條，其中b(2)中反射粒子與b(1)中聚合物基體的重量比是約1/2至2/1。
38.如權利要求32所述的測試條，其中所述聚合物溶於經緩衝以維持理想pH的溶液中。
39.如權利要求32所述的測試條，其中所述試劑層(b)中進一步包括至少一種表面活性劑、除垢劑或增稠劑。
40.如權利要求39所述的測試條，其中所述試劑層厚度約6至16μm。
41.如權利要求40所述的測試條，其中所述試劑層厚度約7至10μm。
42.如權利要求32所述的測試條，其中所述可膨脹聚合物的分子量低於約100000。
43.如權利要求32所述的測試條，其中所述粒子標稱大小約1至10μm。
44.通過將血液樣本施加於測試條上並獲得快速穩定的且對血液樣本量不敏感的響應來測量全血樣本中的葡萄糖的量的方法，所述方法包括(a)將所述血液樣本施加於所述測試條上，所述測試條包括無孔基質，無孔基質上沉積了含在製劑中的用於與所述葡萄糖反應的酶體系的薄膜，所述的製劑包括水溶性可膨脹的聚合物基體、標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子及指示劑；和(b)測量所述指示劑的響應，並測定所述血液樣本中所述葡萄糖的量。
45.如權利要求44所述的方法，其中所述酶體系包括葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶。
46.如權利要求44所述的方法，其中所述薄膜厚度約6至16μm。
47.如權利要求46所述的方法，其中所述薄膜厚度約7至10μm。
48.如權利要求46所述的方法，其中所述粒子與所述基體的重量比是約1/2至2/1。
49.如權利要求44所述的方法，其中粒子標稱大小約1至10μm。
50.如權利要求44所述的方法，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體包括聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和其共聚體中的至少一種。
51.如權利要求44所述的方法，其中所述粒子是二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化矽、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
52.如權利要求44所述的方法，其中所述水溶性可膨脹聚合物的分子量低於約100000。
全文摘要
本發明涉及用於測量生物液體中的分析物的量如全血中的葡萄糖含量的測試條或電化學傳感器，其包括有使用了用於與分析物反應的酶體系的自我限定大小的試劑製劑，所述反應體系混合到含標稱大小約0.05至20μm，優選約1至10μm的不溶於水的小粒子的水溶性可膨脹的聚合物基體中，其中水不溶性粒子與水溶性可膨脹的聚合物基體的重量比是約1/2至2/1，且所述試劑製劑沉積在無孔基質上以形成約6至16μm厚的薄層，以提供對應用的樣本產生快速穩定且對樣本量不敏感的響應。
文檔編號C12Q1/28GK101076601SQ200580042703
公開日2007年11月21日 申請日期2005年12月12日 優先權日2004年12月13日
發明者K·L·馬弗特 申請人:拜爾保健有限公司