來自大麗輪枝菌的分泌型激發子蛋白及其編碼基因與應用的製作方法

2023-07-22 08:47:01 1

專利名稱：來自大麗輪枝菌的分泌型激發子蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種分泌型激發子蛋白及其編碼基因與應用，特別涉及一種來源於大麗輪枝菌的分泌型激發子蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
由土壤絲狀真菌大麗輪枝菌(Verticilliu dahliae Kleb.)所引起的棉花黃萎病是威脅棉花生產的主要病害，多年來一直嚴重影響著我國棉花的品質和產量。棉花黃萎病1914年始見於美國的費吉尼亞州，隨後在其它州和世界各植棉國先後發現，1935年隨引進美棉品種傳入我國，但危害不重。到二十世紀50年代以後，黃萎病在我國南北局部棉區陸續發生，擴散蔓延速度加快。80年代末，黃萎病已遍及全國478個植棉縣(市)。進入90年代以來，我國棉花黃萎病擴展蔓延迅猛，尤其是1993、1995、1996、2002年在全國範圍內連續大發生，損失嚴重。至今，我國大部分主產棉區已成為黃萎病重病區。黃萎病致病菌為大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.),屬半知菌亞門，叢梗抱目，淡色孢科，輪枝菌屬。大麗輪枝菌的寄主範圍很廣，涉及十字花科、薔薇科、豆科、茄科、唇形花科、菊科等，目前已達660多種植物，並且還在逐年擴大。由於棉花黃萎病危害的嚴重性和寄主的廣泛性，世界上不少國家的科技工作者對其進行了深入研究。關於棉花黃萎病的致病機制有多種解釋，其中以導管堵塞和毒素致萎兩種觀點為主。60年代人們對該病菌致病機制的認識是由於菌體在導管內定殖，並大量繁殖，同時刺激鄰近的薄壁細胞產生膠狀物質及侵填體而堵塞導管，阻礙水分的運轉，從而導致棉株萎焉。馬遠莉等(馬遠莉；甘莉；呂金殿；棉花各部位黃萎病菌在導管中的分布[J];陝西農業科學；1990年05期)對棉花各部位黃萎病菌在導管中的分布情況研究後認為，正常的次生木質部導管的潛在輸水能力遠遠超過植物的總需水量，而且被堵塞的導管數佔整個維管束的比例不大(最大的有17.7% )，因此導管堵塞不是導致棉花萎焉的主要原因。Keen等(Keen NT, Long M, Erwin DC(1972)Possible involvement of pathogen-producedprotein-1ipopoIysaccharide complex in Verticillium wilt of cotton.Physiol PlantPathol 2:317-331.)認為，黃萎病菌在代謝過程中產生的毒素為有毒的蛋白質，是一種酸性蛋白質——脂多糖的複合體。該複合物對感病棉花品種的葉片與根組織的細胞膜具有破壞作用，使細胞內K+和Na+大量滲漏。而抗病品種的細胞膜不具備毒素作用的受體位點而不受毒素破壞。越來越多的研究結果表明，大麗輪枝菌分泌的毒素是導致棉株萎焉，產生病症的主要因素。在植物與病原物的識別過程中，激發子起著非常重要的作用。激發子可能是來源於病原菌的物質分子，也可能是在病原菌的作用下植物釋放的化合物。激發子可以分為兩大類，非特異性的激發子和小種特異性的激發子。非特異性的激發子能夠在寄主和非寄主植物上引起防衛反應，而小種特異性激發子只能在特異品種的植物上引起防衛反應。在大麗輪枝菌與植物的互做過程中， 大麗輪枝菌分泌酸性蛋白質——脂多糖複合體形式的毒素蛋白，其中可能含有大量的激發子蛋白。大麗輪枝菌新的分泌激發子基因的克隆將為我們深入研究棉花黃萎病病原大麗輪枝菌與寄主植物互作的分子機理，控制黃萎病的發生奠定堅實的基礎。

發明內容
本發明的目的是提供一種分泌型激發子蛋白及其編碼基因。本發明所提供的分泌型激發子蛋白，名稱為VdNLP2 (Verticilliu dahliaeNepl-1ike protein 2),來自大_輪枝菌(Verticilliu dahliae Kleb.),為下述 I)或 2)或3)的蛋白質:I)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；2)由序列表中序列2的第20-239位胺基酸序列組成的蛋白質；3)將I)或2)所限定的蛋白質的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與分泌型激發子相關的由I)衍生的蛋白質。序列表中序列2由239個胺基酸組成，其中前19個胺基酸殘基為信號肽。所述VdNLP2蛋白在提高植物抗病基因表達中的應用也屬於本發明的保護範圍。編碼上述VdNLP2蛋白的基因VdNLP2也屬於本發明的保護範圍。所述VdNLP2蛋白的基因VdNLP2為如下a) _d)中任一所述的基因:a)其編碼序列是序列表中序列I的自5'末端第1-720位；

b)其核苷酸序列是序列表中的序列I ;c)在嚴格條件下與a)或b)的基因雜交，且編碼所述VdNLP2蛋白的基因；d)與a)或b)所限定的基因具有90%以上的同源性，且編碼所述VdNLP2蛋白的基因。上述嚴格條件可為用0.1 X SSPE (或0.1 X SSC), 0.1 % SDS的溶液，在DNA或者RNA雜交實驗中65°C下雜交並洗膜。序列表中的序列I由720個核苷酸組成，為所述VdNLP2蛋白的的編碼序列，其中前57個核苷酸為VdNLP2蛋白信號肽的編碼序列。所述VdNLP2基因在提高植物抗病基因表達中的應用也屬於本發明的保護範圍。含有所述VdNLP2基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬於本發明的保護範圍。所述重組表達載體為在質粒pBI121或pET_28a(+)的多克隆位點處插入所述VdNLP2基因，得到表達所述VdNLP2基因的重組質粒。所述表達盒由能夠啟動所述VdNLP2基因表達的啟動子，VdNLP2基因，以及轉錄終止序列組成。所述重組菌具體可為攜帶有所述VdNLP2基因的農桿菌，如EHA105。含有所述VdNLP2基因的重組表達載體、表達盒或重組菌在提高植物抗病基因表達中的應用也屬於本發明的保護範圍。所述提高植物抗病基因表達是按照如下步驟進行的:1)提供攜帶含有所述VdNLP2基因的重組表達載體的農桿菌，或所述VdNLP2蛋白。2)將步驟I)的農桿菌或VdNLP2蛋白注射植物葉片，誘發植物抗病基因的表達。所述VdNLP2蛋白，或所述VdNLP2基因，或上述重組表達載體、表達盒或重組菌在如下al)或a2)中的應用也屬於本發明的保護範圍:al)引起植物(葉片)形成壞死斑；a2)引起植物(葉片)產生活性氧(H2O2)。上述al)中所述的形成壞死斑和a2)中所述的產生活性氧(H2O2)均是植物過敏性反應的體現。植物過敏性反應是細胞程序性死亡的重要表現形式之一，表現為植物在不親和病原菌侵染下受侵細胞及鄰近細胞的快速死亡，從而導致病原菌生長受抑制，植物過敏性反應過程對於植物抗病性有重要意義。在植物-病原菌(真菌、細菌、病毒)相互作用過程中，由不親和病原菌所導致的植物主動防衛反應一一過敏反應的早期，發現有大量活性氧產生(氧化突發)，包括超氧陰離子、羥自由基、單線態氧和過氧化氫。這些活性氧被認為有可能通過啟動或參與植物細胞脂質過氧化，細胞壁木質化和蛋白質聚合；直接殺死病原菌；作為信號介導植保素合成等而直接介入或啟動植物過敏性反應。現初步認為「氧化突發」可能是細胞水平上植物對付病原菌侵染的第一步。上述植物為菸草(如Ncotiana benthamiana)、擬南芥(如 Arabidopsisthaliana col)或棉花(如新陸早16號)。上述抗病基因具體如下:菸草的病程相關基因NbPR-5(X03913.1)和NbPR-1a (X06361.1);擬南芥的病程相關基因AtPRl (NM_127025.2)，乙烯途徑的關鍵基因AtACS6 (NM_117199.1)以及茉莉酸途徑的關鍵基因AtPDFl.2 (NM_123809.3);棉花的病程相關基因osmotin (AF304007.1)和棉酚合成途徑中的關鍵基因CADl-Cl (AF174294.1)。擴增所述VdNLP2基因的全長或其任一片段的引物對也屬於本發明的保護範圍。如 CGGATCCATGTCGCCGTCTCTCATCAGC 和 CGAGCTCCTACAGCGCCGCCTTCTGCAGG ；或者CGGATCCGCGCCGCTGCTCGAGTCGCGCG 和 CGAGCTCCTACAGCGCCGCCTTCTGCAG。
實驗證明，本發明所提供的分泌型激發子蛋白及其編碼基因在提高植物抗病基因表達、引起植物(葉片)形成壞死斑，以及引起植物(葉片)產生活性氧(H2O2)中具有重要作用。


圖1為EHA105/pBI121_VdNLP2注射菸草葉片後誘發了菸草葉片的過敏性壞死結果。其中，葉片的左側(A)為對照組；葉片的右側⑶為實驗組。圖2為VdNLP2原核表達蛋白的純化結果。其中，泳道I為蛋白Marker ;泳道2為未經純化的總蛋白；泳道3為純化後的VdNLP2蛋白。圖3為VdNLP2原核表達蛋白在菸草、擬南芥和棉花葉片上引起的過敏性壞死斑形成及活性氧產生的結果。其中，A為擬南芥葉片；B為菸草葉片；C為棉花葉片。A、B和C中均左側(I)為對照組，右側(2)為實驗組；A、B和C中均上數第一排為壞死斑形成結果，第
二排為活性氧產生結果。圖4為VdNLP2原核表達蛋白在注射菸草、擬南芥以及棉花葉片後，誘發抗病相關基因高表達的結果。其中，A為擬南芥；B為菸草；C為棉花。具體的，A中a為以AtPRl基因為探針的northern雜交結果；b為以AtACS6基因為探針的northern雜交結果；c為以AtPDFl.2基因為探針的northern雜交結果；d為轉膜後，用亞甲基藍染色液對膜染色後的擬南芥18S rRNA的定量結果。B中a為以NbPR-5基因為探針的northern雜交結果；b為以NbPR-1a基因為探針的northern雜交結果；c為轉膜後，用亞甲基藍染色液對膜染色後的菸草18S rRNA的定量結果。C中a為以Osmotin基因為探針的northern雜交結果；b為以CADl-Cl基因為探針的northern雜交結果；c為轉膜後，用亞甲基藍染色液對膜染色後的棉花18S rRNA的定量結果。A、B和C中的泳道I均為對照組注射後12h ;泳道2均為對照組注射後48h ;泳道3均為實驗組注射後12h ;泳道4均為實驗組注射後48h。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、分泌型激發子基因VdNLP2的獲得本發明的發明人首先構建了大麗輪枝菌T-DNA插入突變體庫，然後應用熱不對稱交錯PCR (TAIL-PCR)查找部分轉化子T-DNA插入位點的序列。在對一個位點的序列分析中，獲得了基因VdNLP2的部分序列信息。然後應用RACE技術獲得了序列表中序列I的分泌型激發子基因VdNLP2的ORF序列。具體操作如下:1、突變體庫的構建大麗輪枝菌菌株V592 (菌株V592是採自新疆棉花田，現保存於本發明人實驗室，可以通過與發明人所在研究所籤定材料移轉合約購得)在PDA平板上25°C培養後將孢子接種於查氏液體培養基(1L查氏液體培養基中含有:2g NaNO3, Ig KH2P04，IgMgSO4 7H20，Ig KCL, 2mg FeSO4 7H20和30g蔗糖)中振蕩培養5-8天直至孢子濃度為1.0X 107/mL，孢子培養液用4層無菌紗布過濾以除去菌絲。4000rpm離心IOmin得到孢子並用含有終濃度為200mM的乙酞丁香酮(AS)的誘導培養基(配方參見Gao, F.，Zhou，B.J.，Li，G.Y.，Jia,P.S., Li, H., Zhao, Y.L., Zhao, P., Xia, G.X., and Guo, H.S.2010.Aglutamic acid-richprotein identified in Verticillium dahliae from an insertional mutagenesisaffects microsclerotial formation and pathogenicity.PloS one 5:el5319.)將抱子濃度調節到(1.0X IO6-L OX IO7)/mL，得到分生孢子懸浮液。將農桿菌EHA105(Gao，F.，Zhou, B.J., Li, G.Y.，Jia, P.S.，Li，H.，Zhao, Y.L.，Zhao,P., Xia, G.X., and Guo, H.S.2010.A glutamic acid-rich protein identified inVerticillium dahliae from an insertional mutagenesis affects microsclerotialformation and pathogenicity.PloS one 5:el5319.)在 30ml 基本培養基(MM)(含有 Kan50mg/L，Rif 25mg/L)中28°C培養48h，4000rpm，離心lOmin。沉澱用誘導培養基(頂)洗兩次，重懸農桿菌至OD值為0.2-0.3，並加200mM乙酞丁香酮(AS)、40mM MES以及Kan(50mg/0，281:，200印111振蕩培養611。然後吸取IOOii L上述培養物與IOOyl的前述步驟製備的分生孢子懸浮液混合，潑於放在共培養基上的孔徑為45 y m的47mm直徑的纖維素膜上，在28°C培養36h。用2mL基本培養基洗膜，收穫真菌和細菌培養物，然後取200 ii L兩塗於含100 ii g/mL氯B密磺隆(Cholorimuron)的選擇培養基平板上,抑制農桿菌的生長,挑取單個轉化子轉至選擇培養基平板進行二次篩選並保存轉化子。獲得轉化子後，提取轉化子基因組 DNA。2、TAIL-PCR及RACE技術獲得突變基因序列本發明的發明人利用熱不對稱交錯PCR(TAIL-PCR)來獲得插入位點側翼序列。根據載體的已知序列在左右分別設計3個與其邊界距離不等的嵌套的特異性引物LB1、LB2、LB3以及RB1，RB2、RB3，特異性引物的長度約20bp，退火溫度(Tm) —般為58 68°C:LBl:gggttcctatagggtttcgctcatgLB2:catgtgttgagcatataagaaaccctLB3:gaattaattcggcgttaattcagtRBl:ggcactggccgtcgttttacaacRB2:aacgtcgtgactgggaaaaccctRB3:cccttcccaacagttgcacag再按照物種普遍存在的蛋白質的保守胺基酸序列設計一系列簡併引物AD，簡併引物相對較短，長度為14bp，退火溫度(Tm)為30 48°C:ADI: (AGCT) TCGA (GC) T (AT) T (GC) G (AT) GTTAD2: (AGCT) GTCGA (GC) (AT) GA (AGCT) A (AT) GAAAD3: (AT) GTG (AGCT) AG (AT) A (AGCT) CA (AGCT) AGAAD4: TG (AT) G (AGCT) AG (AT) A (AGCT) CA (GC) AGAAD5:AG (AT) G (AGCT) AG (AT) A (AGCT) CA (AT) CA (AT) AGGAD6:CA (AT) CGIC (AGCT) GAIA (GC) GAAAD7:TC (GC) TICG (AGCT) ACIT (AT) GGAAD8: (GC) TTG (AGCT) TA (GC) T (AGCT) CT (AGCT) TGCAD9: (AT) CAG (AGCT) TG (AT) T (AGCT) GT (AGCT) CTGADlO:TCTTICG(AGCT)ACIT(AGCT)GGAADl1:TTGIAG(AGCT)ACIA(AGCT)AGG通過三輪的PCR反應獲得側翼序列。其中第一輪的模板為步驟I得到的基因組基因組DNA，第二、三輪的模板分別為第一、二輪 的PCR產物。反應程序如下:
權利要求
1.蛋白質，為下述I)或2)或3): 1)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質； 2)由序列表中序列2的第20-239位胺基酸序列組成的蛋白質； 3)將I)或2)所限定的蛋白質的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與分泌型激發子相關的由I)衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述蛋白質在提高植物抗病基因表達中的應用。
3.編碼權利要求1所述蛋白質的基因。
4.根據權利要求3所述的基因，其特徵在於:所述基因為如下a)-d)中任一所述的基因: a)其編碼序列是序列表中序列I的自5'末端第1-720位； b)其核苷酸序列是序列表中的序列I; c)在嚴格條件下與a)或b)的基因雜交，且編碼權利要求1所述蛋白的基因； d)與a)或b)所限定的基因具有90%以上的同源性，且編碼權利要求1所述蛋白的基因。
5.權利要求3或4所述基 因在提高植物抗病基因表達中的應用。
6.含有權利要求3或4所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
7.根據權利要求6所述的重組表達載體，其特徵在於:所述重組表達載體為在質粒PBI121或pET-28a(+)的多克隆位點處插入權利要求3或4所述基因，得到表達所述基因的重組質粒。
8.權利要求6或7所述的重組表達載體、表達盒或重組菌在提高植物抗病基因表達中的應用。
9.權利要求1所述蛋白，或權利要求3或4所述基因，或權利要求6或7所述的重組表達載體、表達盒或重組菌在如下al)或a2)中的應用: al)引起植物形成壞死斑； a2)引起植物產生活性氧。
10.根據權利要求2、5、8或9所述的應用，其特徵在於:所述植物為菸草、擬南芥或棉花。
全文摘要
本發明公開了一種來自大麗輪枝菌的分泌型激發子蛋白及其編碼基因與應用。本發明所提供的分泌型激發子蛋白為下述1)或2)或3)1)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；2)由序列表中序列2的第20-239位胺基酸序列組成的蛋白質；3)將1)或2)所限定的蛋白質的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與分泌型激發子相關的由1)衍生的蛋白質。實驗證明，本發明所提供的分泌型激發子蛋白及其編碼基因在提高植物抗病基因表達、引起植物(葉片)形成壞死斑，以及引起植物(葉片)產生活性氧(H2O2)中具有重要作用。
文檔編號C12N15/63GK103193874SQ201210006128
公開日2013年7月10日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者郭惠珊, 周邦軍 申請人:中國科學院微生物研究所