一種分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試方法及裝置製造方法

2023-07-11 16:29:51

一種分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試方法及裝置製造方法
【專利摘要】本發明屬於顯微光譜成像探測【技術領域】，涉及一種分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試方法及其裝置。本發明將分光瞳雷射差動共焦顯微技術與雷射拉曼光譜探測技術有機結合，採用分割焦斑差動探測來實現三維幾何位置的精密成像，其既簡化了傳統差動共焦顯微系統的光路結構，又繼承了原有雷射差動共焦系統和分光瞳共焦系統的優勢，僅通過軟體切換處理便可實現分光瞳雷射差動共焦顯微探測、雷射共焦拉曼光譜探測、雷射差動共焦拉曼光譜探測的多模式切換與處理。本發明為納米級微區三維幾何位置與光譜的探測提供新的技術途徑，可用於生物醫學、工業精密檢測等領域，具有廣泛的應用前景。
【專利說明】一種分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試方法及裝置
【技術領域】
[0001]本發明屬於顯微光譜成像【技術領域】，將差動共焦顯微技術與光譜探測技術相結合，涉及一種「圖譜合一」的高空間分辨光譜成像與探測方法及裝置，可用於各類樣品的微區拉曼光譜高空間分辨成像與探測。
技術背景
[0002]1990年，G.J.Puppels等學者在觀測單細胞和染色體的形態與組成時首先發明了共焦拉曼光譜顯微技術並成功用於實驗。雷射共焦拉曼光譜技術通過入射雷射引起分子(或晶格)產生振動而損失(或獲得)部分能量，使散射光頻率發生變化，通過對散射光進行分析來探知分子的組分、結構及相對含量等，雷射共焦拉曼光譜技術亦被稱為分子探針技術。該技術既繼承了共焦顯微術的高分辨層析成像特徵，又可以對樣品進行光譜分析，雷射共焦拉曼光譜測試技術作為一種極其重要的材料結構測量與分析的基本技術手段，廣泛應用於物理、化學、生物醫學、材料科學、環境科學、石油化工、地質、藥物、食品、刑偵和珠寶檢定等領域，可對樣品進行無損傷鑑定和深度光譜分析，同時，還可以進行樣品掃描和低溫分析、材料的光致發光研究等。
[0003]傳統共焦拉曼光譜探測儀的原理如圖1所示，光源系統發出激發光束透過偏振分光鏡、四分之一波片和聚焦物鏡後，聚焦在被測樣品上，激發出載有樣品光譜特性的拉曼散射光；通過三維掃描系統移動被測樣品，使對應被測樣品不同區域的拉曼散射光再次通過四分之一波片並被偏振分光鏡反射，第一聚光鏡將偏振分光鏡反射的光進行會聚，利用位於第一針孔後面的光譜探測器測得載有被測樣品光譜信息的拉曼散射光譜。
[0004]傳統的共焦顯微技術在雷射激發焦點附近的區域內，也能激發出樣品的拉曼光譜，並能被針孔後的光譜探測系統探測。因而共焦拉曼光譜顯微技術的實際探測位置往往處於離焦位置。隨著現代科技的快速發展，人們對微區光譜探測能力及空間分辨探測能力提出了更高的要求。在光學探測系統中，當測量聚焦光斑位於焦點時其尺寸最小，激發光強最強，若要獲得最佳空間分辨力和最優的光譜探測能力，必須對系統進行精確定焦。
[0005]總體而言，現有共焦顯微測量方法通常有兩類:一類是利用共焦強度響應的斜邊直接對被測樣品進行測量，另一類是利用共焦強度響應的最大值對樣品進行焦點跟蹤來實現測量。但現有共焦顯微測量系統存在以下不足:當利用共焦強度響應斜邊進行測量時，無法實現絕對位移測量，且測量精度受限於共焦強度響應曲線斜邊測量區間的非線性、光源強度波動、被測表面散射和反射特性等因素；當利用焦點跟蹤測量時，由於共焦顯微測量系統焦點對應共焦強度響應靈敏度最差的頂點，因而制約了此類共焦傳感器焦點跟蹤精度的進一步提高，進而限制了傳統共焦拉曼系統的焦點跟蹤精度和應用範圍。
[0006]同時，應用拉曼光譜進行共焦定位信噪比較低，並且由於針孔的遮擋作用會進一步降低拉曼光譜的能量，而擴大針孔尺寸提高光譜通過率則會增加共焦軸向定位曲線的半高寬，降低其定位精度，現有共焦拉曼系統中的共焦針孔尺寸通常在Φ150μπι?Φ200μπι之間，所用針孔尺寸相對較大，亦不能很好的起到定焦作用。上述原因限制了共焦拉曼光譜顯微系統探測微區光譜的能力，制約了其在更精細微區光譜測試與分析場合中的應用，因而提高系統的定焦精度是提高其空間分辨力的關鍵。
[0007]此外，由於拉曼散射光十分微弱，為了獲得精確、豐富的測量信息，拉曼光譜成像時既需較長時間的單點拉曼光譜探測，又需進行多點拉曼光譜探測，因此拉曼光譜成像需要較長的時間。但是，儀器長時間成像過程中受環境溫度、振動、空氣抖動等的影響較大，易使儀器系統產生漂移，從而導致樣品被探測位置離焦；由於現有共焦拉曼光譜探測技術不具備實時焦點跟蹤和位置矯正能力，因而在整個成像過程中，無法保證其激發光斑的位置處在物鏡焦點位置，實際激發光斑遠大於物鏡聚焦光焦斑，其結果制約了可探測區域的微小化，限制了共焦拉曼光譜儀器的微區光譜探測能力。
[0008]為克服傳統共焦拉曼系統存在的上述不足，北京理工大學的趙維謙等人曾提出了一種具有很強微區光譜探測能力的差動共焦拉曼光譜測試方法，其將共焦探測光路系統分為兩部分，並將這兩個探測系統的點探測器分別置於焦前和焦後位置進行差動探測，繼而實現雙極性絕對零點跟蹤測量等。差動共焦拉曼光譜測試技術在專利ZL2008101156011(發明人:趙維謙等)中，以題為「差動共焦拉曼光譜測試方法」已公開，其原理如圖2所示，該方法旨在實現樣品精細微區的光譜成像檢測，為樣品微區三維尺度及光譜特性的測量與分析提供新手段。但是，該差動共焦拉曼光譜測試方法由於採用了雙路物理針孔結構，造成差動共焦測量系統結構相對複雜，並且對離焦位置要求嚴格，裝調困難，增加了誤差源:此外，由於差動共焦顯微系統受到原理限制，通常難以兼顧分辨能力、工作距離和視場。
[0009]通常樣品散射的拉曼光譜強度為反射的瑞利光束強度的10_3?10_6倍，而現有的共焦拉曼光譜探測儀器均探測樣品散射的微弱拉曼光譜而遺棄強於拉曼散射光IO3?IO6倍的瑞利光束，因而，利用現有光譜探測系統中遺棄的瑞利光束進行輔助探測是改善現有共焦拉曼光譜探測技術空間分辨力的新途徑。

【發明內容】

[0010]本發明的目的是為克服現有技術的不足，提出一種分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試方法及其裝置。通過利用共焦拉曼光譜探測中遺棄的瑞利散射光構建分光瞳共焦顯微成像系統來實現樣品三維幾何位置的高分辨成像，並利用分光瞳差動共焦顯微成像裝置的「過零點」與其焦點精確對應這一特性來控制光譜探測器精確捕獲物鏡聚焦點處激發的拉曼光譜信息，進而實現對樣品微區幾何位置與光譜信息的高精度探測即「圖譜合一」的高空間分辨探測，並同時達到分辨能力和量程範圍的有效兼顧。本發明可以探測包括螢光、布裡淵散射光、康普頓散射光等的散射光譜。
[0011]本發明的目的是通過下述技術方案實現的。
[0012]一種分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試方法，包括以下步驟:
[0013]首先，在測量物鏡的光瞳面上放置照明光瞳和收集光瞳；光源系統發出激發光束，激發光束透過照明光瞳後，聚焦在被測樣品上，激發出載有被測樣品光譜特性的拉曼散射光，同時反射出瑞利光；拉曼散射光和瑞利光經收集光瞳後到達二向色分光系統；二向色分光系統對拉曼散射光和瑞利光進行無損分離；
[0014]經二向色分光系統反射的瑞利光進入分光瞳雷射差動共焦探測系統；分光瞳雷射差動共焦探測系統利用探測器橫向偏移能夠使分光瞳共焦顯微系統的軸向響應特性曲線產生相移的特性，採用單光路、單探測器分割焦斑差動方法，實現對被測樣品微區幾何位置的探測，具體過程為:對接收瑞利光的分光瞳雷射差動共焦探測系統所獲得的探測光斑進行分割處理，得到探測區域A和探測區域B ;當對A、B兩個探測區域的信號進行差動相減處理時，能夠進行高空間分辨的三維尺度層析成像；
[0015]與此同時，經二向色分光系統透射的拉曼散射光進入拉曼光譜探測系統，利用分光瞳雷射差動共焦響應曲線的「過零點」與測量物鏡焦點位置精確對應特性，將分光瞳雷射差動共焦響應曲線的「過零點」精確對應測量物鏡的焦點，通過「過零點」觸發來精確捕獲激發光斑焦點位置的光譜信息，實現高空間分辨的光譜探測。
[0016]當對接收拉曼散射光的拉曼光譜探測系統獲得的光譜信號進行處理時，系統能夠進行拉曼光譜探測；當對接收瑞利光的分光瞳雷射差動共焦探測系統獲得的差動信號和接收拉曼散射光的拉曼光譜探測系統獲得的光譜信號進行處理時，系統能夠進行高空間分辨的微區圖譜層析成像，即實現對被測樣品「圖譜合一」的分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜高空間分辨成像與探測。
[0017]特別的，可以通過設置探測區域A和探測區域B的位置參數以匹配不同反射率的樣品，從而擴展其應用領域。
[0018]特別的，在本發明方法中，所述照明光瞳和收集光瞳可以是圓形、D形或者其他形狀。
[0019]在本發明方法中，所述激發光束可以是線偏光、圓偏光等偏振光束；還可以是由光瞳濾波技術生成的結構光束。偏振光與光瞳濾波技術結合可以壓縮測量聚焦光斑尺寸，提高系統的橫向分辨力。
[0020]在本發明方法中，還可以探測包括螢光、布裡淵散射光、康普頓散射光的散射光
-1'TfeP曰。
[0021]在本發明方法中，僅通過計算機系統軟體處理即可實現對不同NA值的測量物鏡的匹配，而無需重新對系統進行任何硬體裝調。
[0022]一種分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試裝置，其特徵在於:包括產生激發光束的光源系統、測量物鏡、照明光瞳、收集光瞳、二向色分光裝置、拉曼光譜探測裝置、分光瞳雷射差動共焦探測裝置、三維掃描裝置、位移傳感器以及數據處理單元；
[0023]其中，在測量物鏡的光瞳面上放置照明光瞳和收集光瞳，照明光瞳和測量物鏡依次位於光源系統的激發光束出射方向上，照明光瞳與激發光束同軸；二向色分光系統位於收集光瞳之後；拉曼光譜探測系統位於二向色分光系統的透射方向上；分光瞳雷射差動共焦探測系統位於二向分光系統的反射方向上；被測樣品固定在三維掃描裝置的載物臺上；
[0024]數據處理單元包括分割焦斑探測模塊、差動相減模塊和數據融合模塊；其中，分割焦斑探測模塊和差動相減模塊用於處理圖像採集系統探測到的光斑，得到分光瞳雷射差動共焦響應曲線，由此得到被測樣品的位置信息；數據融合模塊用於融合位置信息和光譜信息，完成被測樣品的三維重構及光譜信息融合；三者關聯關係為:分割焦斑探測模塊將圖像採集系統採集到的艾利斑進行分割並探測，得到的信號進入差動相減模塊進行差動相減後，得到分光瞳雷射差動共焦響應曲線進入數據融合模塊；
[0025]計算機處理系統與位移傳感器、三維掃描裝置、數據融合模塊相連接；圖像採集系統和分割焦斑探測模塊相連接。數據融合模塊與第一探測器相連接；[0026]通過計算機處理系統控制三維掃描裝置移動被測樣品，使不同區域瑞利光及對應該區域被測樣品的拉曼散射光通過測量物鏡和收集光瞳。
[0027]在本發明裝置中，二向色分光系統與收集光瞳軸線的夾角是可變的。可選擇適當的角度以滿足分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試裝置的結構設計，從而提高結構設計的靈活性。
[0028]在本發明裝置中，拉曼光譜探測系統可以是普通拉曼光譜探測系統。包括沿光路依次放置的第一聚光鏡、位於第一聚光鏡焦點位置的光譜探測器，以及位於光譜探測器之後的第一探測器，用於被測樣品的表層光譜探測；還可以是共焦拉曼光譜探測系統，包括沿光路依次放置的第一聚光鏡、位於第一聚光鏡焦點位置的第一針孔、位於第一針孔後的光譜探測器，以及位於光譜探測器之後的第一探測器，可以有效濾除焦點之外的雜散光，提高光譜探測的信噪比。
[0029]在本發明裝置中，可通過增加圖像放大系統，放大圖像採集系統探測到的艾利斑。包括沿光路依次放置的第二聚光鏡、與第二聚光鏡共焦點的圖像放大系統以及位於圖像放大系統焦點處的圖像採集系統，以提高分光瞳雷射差動共焦探測系統的採集精度。
[0030]在本發明裝置中，可通過在光源系統和照明光瞳之間增加光束調製系統。包括沿光路依次放置的第三聚光鏡、位於第三聚光鏡焦點處的第二針孔、以及焦點位於第二針孔處的第四聚光鏡，用於對光源系統發出的激發光束進行調製，以得到更高空間分辨力和更好的激發效果。
[0031]有益效果
[0032]本發明方法，對比已有技術具有以下創新點:
[0033]1、本發明將分光瞳雷射差動共焦顯微技術與拉曼光譜探測技術有機結合，融合了分光瞳差動共焦顯微技術的高精度物鏡聚焦點位置跟蹤捕獲能力，可探測到精確對應最小激發聚焦光斑區域的樣品光譜特性，在大幅提高現有共焦拉曼光譜顯微鏡的微區光譜探測能力的同時也大大簡化了系統的光路結構，這是區別於現有拉曼光譜探測技術的創新點之
[0034]2、由於採用單光路分割焦斑差動探測實現幾何位置的成像，其既大幅簡化傳統差動共焦顯微系統的光路結構，又保留了雷射差動共焦系統和原有分光瞳差動共焦系統的優勢，僅通過軟體切換處理便可實現分光瞳雷射差動共焦顯微探測、雷射共焦拉曼光譜探測、分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜探測多模式切換與處理。這是區別於現有拉曼光譜探測技術的創新點之二；
[0035]3、由於採用分割焦斑的方法來獲取差動信號，可通過改變在圖像探測系統探測焦面上所設置的兩個微小區域的參數以匹配不同的樣品的反射率，從而可以擴展其應用領域；還可以僅通過計算機系統軟體處理即可實現對不同NA值的測量物鏡的匹配，而無需重新對系統進行任何硬體裝調。實現了系統對分辨力和量程的有效兼顧，有利於實現儀器的通用性。這是區別於現有拉曼光譜探測技術的創新點之三；
[0036]4、利用二向色分光裝置對瑞利光和拉曼散射光進行無損分離，瑞利光進入差動探測系統，拉曼散射光進入拉曼光譜探測系統，提高系統光譜探測靈敏度，二向色分光裝置可以根據需要調整角度，有利於低波數拉曼光譜的探測。這是區別於現有拉曼光譜探測技術的創新點之四。[0037]5、單光路、單探測器分割焦斑差動相減探測方式可有效抑制光源光強波動、探測器電子漂移、環境狀態差異等產生的共模噪聲，大幅簡化探測光路系統，消除因兩探測器離軸放置不對稱、探測器響應特性不一致等引起的誤差，改善了共焦拉曼光譜顯微鏡的離焦特性；
[0038]6、分光瞳雷射差動共焦測具有絕對零點，可進行雙極性絕對測量，且絕對零點位於特性曲線靈敏度最大處、並與測量系統「焦點位置」精確對應，極便於進行焦點跟蹤測量，可實現幾何尺度絕對測量；
[0039]7、可實現量程範圍與分辨能力的有效兼顧，通過設置在焦斑上所取兩個微小區域的參數，以匹配不同反射率的被測樣品，應用範圍得到擴展；
[0040]8、採用分割焦斑的橫向差動共焦方式，便於系統根據需求更換不同NA值的物鏡，調節方便；
[0041]9、二向色分光系統的使用增強光譜探測系統所接收到的拉曼光譜，提高光譜探測的信噪比，使共焦拉曼光譜顯微鏡的微區光譜探測能力顯著提高，也可以降低系統對激發光源的光強要求；還可以根據需求進行調整，以提高系統低波數探測能力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1為共焦拉曼光譜成像方法示意圖；
[0043]圖2為差動共焦拉曼光譜成像方法示意圖；
[0044]圖3為本發明所述分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試過程示意圖；
[0045]圖4為D形分光瞳雷射差動共焦拉曼光瞳測試不意圖；
[0046]圖5為本發明所述分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試裝置示意圖；
[0047]圖6為本發明所述非垂直出射的分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試裝置示意圖；
[0048]圖7為本發明所述具有共焦光譜探測系統的分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試裝置不意圖；
[0049]圖8為本發明所述具有光束調製系統的分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試裝置示意圖；
[0050]圖9為本發明所述具有探測焦斑放大系統分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試裝置不意圖；
[0051]圖10為本發明所述分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試方法與裝置實施例示意圖；
[0052]圖11為本發明所述分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試方法的分光瞳差動共焦響應曲線及拉曼光譜響應曲線示意圖。
[0053]其中，1-光源系統、2-測量物鏡、3-照明光瞳、4-收集光瞳、5-被測樣品、6- 二向色分光系統、7-拉曼光譜探測系統、8-第一聚光鏡、9-光譜探測器、10-第一探測器、11-分光瞳雷射差動共焦探測系統、12-第二聚光鏡、13-圖像採集系統、14-探測區域A、15-探測區域B、16-三維掃描系統、17-位移傳感器、18-數據處理單元、19-分割焦斑探測模塊、20-差動相減模塊、21-數據融合模塊、22-計算機處理系統、23-第一針孔、24-光束調製系統、25-第三聚光鏡、26-第二針孔、27-第四聚光鏡、28-圖像放大系統、29-分光瞳雷射差動共焦響應曲線、30-拉曼光譜響應曲線、31-偏振分光鏡、32-四分之一波片、33-聚焦物鏡、34-第一保偏分光鏡、35-第二保偏分光鏡、36-第五聚光鏡、37-第六聚光鏡、38-第三針孔、39-第四針孔、40-第二探測器、41-第三探測器、42-差動共焦數據處理單元。
【具體實施方式】
[0054]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0055]一種分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試方法，包括以下步驟:
[0056]如圖3所示，首先，在測量物鏡2的光瞳面上放置照明光瞳3和收集光瞳4 ;光源系統I發出激發光束，激發光束透過測量物鏡2的照明光瞳3後，聚焦在被測樣品5上，激發出載有被測樣品5光譜特性的拉曼散射光，並反射出瑞利光；拉曼散射光和瑞利光經測量物鏡2的收集光瞳4到達二向色分光系統6 ;二向色分光系統6對拉曼散射光和瑞利光進行無損分離；經二向色分光系統6反射的瑞利光進入分光瞳雷射差動共焦探測系統11 ；分光瞳雷射差動共焦探測系統11利用探測器橫向偏移能夠使分光瞳共焦顯微系統的軸向響應特性曲線產生相移的特性，實現對被測樣品5微區幾何位置的探測；與此同時，經二向色分光系統6透射的拉曼散射光進入拉曼光譜探測系統7中進行光譜探測。被測樣品5可以通過增強拉曼光譜納米粒子等拉曼增強技術進行處理，以提高拉曼散射光的強度。
[0057]當對接收瑞利光的分光瞳雷射差動共焦探測系統獲得的差動信號和接收拉曼散射光的拉曼光譜探測系統獲得的光譜信號進行處理時，系統能夠進行高空間分辨的微區圖譜層析成像，即實現對被測樣品「圖譜合一」的分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜高空間分辨成像與探測。
[0058]特別的，可將圓形的照明光瞳3和收集光瞳4替換為其他形狀(如D形，形成D形分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試，如圖4所示)。
[0059]特別的，激發光束可以是線偏光、圓偏光等偏振光束；還可以是由光瞳濾波技術生成的結構光束，偏振光與光瞳濾波技術結合可以壓縮測量聚焦光斑尺寸，提高系統的橫向分辨力。
[0060]特別的，可以採用計算機處理系統22控制三維掃描系統16移動被測樣品5，使不同區域瑞利光及對應該區域被測樣品5的拉曼散射光通過測量物鏡2和收集光瞳4。
[0061]一種分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試裝置，如圖5所示，包括產生激發光束的光源系統1、測量物鏡2、二向色分光系統6、拉曼光譜探測系統7、分光瞳雷射差動共焦探測系統11、三維掃描系統16、位移傳感器17、數據處理單元18和計算機處理系統22。
[0062]其中，在測量物鏡2的光瞳面上放置照明光瞳3和收集光瞳4。其中，照明光瞳3和測量物鏡2依次位於光源系統I的激發光束出射方向上，照明光瞳3與激發光束同軸；二向色分光系統6位於收集光瞳4之後，且二向色分光裝置6與收集光瞳4的軸線的夾角β為 45。。
[0063]拉曼光譜探測系統7位於二向色分光系統6的透射方向上；拉曼光譜探測系統7包括第一聚光鏡8、光譜探測器9和第一探測器10。其中，光譜探測器9的探測面位於第一聚光鏡8的焦點處，第一探測器10位於光譜探測器9之後。
[0064]分光瞳雷射差動共焦探測系統11位於二向分光系統6的反射方向上；分光瞳雷射差動共焦探測系統11包括第二聚光鏡12和圖像採集系統13，其中，圖像採集系統13的探測面位於第二聚光鏡12的焦點處。[0065]數據處理單元18包括分割焦斑探測模塊19、差動相減模塊20和數據融合模塊21 ;其中，分割焦斑探測模塊19和差動相減模塊20用於處理圖像採集系統13探測到的光斑，得到分光瞳雷射差動共焦響應曲線29，由此得到被測樣品5的位置信息；數據融合模塊21用於融合位置信息I (u，vM)和光譜信息I (r)，完成被測樣品5的三維重構及光譜信息融合I (X，y, z, r)。三者關聯關係為:分割焦斑探測模塊19將圖像採集系統13採集到的艾利斑進行分割並探測，得到的信號進入差動相減模塊20進行差動相減後，得到分光瞳雷射差動共焦響應曲線29進入數據融合模塊21。
[0066]計算機處理系統22與位移傳感器17、三維掃描系統16、數據融合模塊21相連接。圖像採集系統13和分割焦斑探測模塊19相連接。數據融合模塊21與第一探測器10相連接。
[0067]通過計算機處理系統22控制三維掃描系統16移動被測樣品5，使不同區域瑞利光及對應該區域被測樣品5的拉曼散射光通過測量物鏡2和收集光瞳4。
[0068]如圖6所示，二向色分光裝置6與收集光瞳4的軸線的夾角β可以不為45°，從而構成非垂直出射的分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試裝置。
[0069]如圖7所示，在第一聚光鏡8的焦點位置安放第一針孔23，從而構成具有共焦光譜探測系統的分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試裝置。
[0070]如圖8所不，在光源系統I和照明光睛3之間安放光束調製系統24 ;光束調製系統24包括沿光路依次放置的第三聚光鏡25、位於第三聚光鏡25焦點處的第二針孔26、以及焦點位於第二針孔26處的第四聚光鏡27,構成具有光束調製系統的分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試裝置。
[0071 ] 如圖9所示，在分光瞳雷射差動共焦探測系統11中，增加圖像放大系統28，能夠放大圖像採集系統13探測到的艾利斑，從而提高分光瞳雷射差動共焦探測裝置的採集精度；沿光路依次放置第二聚光鏡12、圖像放大系統28和圖像採集系統13，其中，圖像放大系統28與第二聚光鏡12共焦點，圖像採集系統13位於圖像放大系統28的焦點處。
[0072]實施例
[0073]本實施例中，二向色分光系統6為Notch filter，光譜探測器9為拉曼光譜探測器，圖像採集系統13為CCD，圖像放大系統28為放大物鏡。
[0074]如圖10所示，分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜探測方法，其測試步驟如下:
[0075]首先，在測量物鏡2的光瞳面上放置照明光瞳3和收集光瞳4。由雷射器構成的光源系統I發出可激發出被測樣品5拉曼光譜的激發光，激發光經第三聚光鏡25會聚後進入第二針孔26成為點光源，再經第四聚光鏡27準直擴束後，形成平行的激發光束。激發光束透過照明光瞳3、測量物鏡2後，聚焦在被測樣品5上，返回激發出的載有被測樣品5光譜特性的拉曼散射光和瑞利光。
[0076]然後，通過計算機處理系統22控制三維掃描系統16移動被測樣品5，使不同區域瑞利光及對應該區域被測樣品5的拉曼散射光通過測量物鏡2和收集光瞳4，二向色分光系統6對瑞利反射光和拉曼散射光進行無損分離。
[0077]經二向色分光系統6反射的瑞利光進入分光瞳雷射差動共焦探測系統11，經第二聚光鏡12會聚後進入放大物鏡28，被放大後的光斑被圖像採集系統13探測，圖像採集系統13探測到的光斑進入分割焦斑探測模塊19，在探測焦斑中的&軸上設置兩個微小區域探測區域A14和探測區域B15，兩個探測區域關於yd軸對稱並相對於yd軸偏移vM，測得這兩個區域的響應分別為Ia(U，-vM)和Ib(u，vM);差動相減模塊20將得到的信號進行差動相減，得到分光瞳雷射差動共焦響應曲線29:
[0078]I (u, vM) =Ia (u, -vM) -1b (u, _vM)
[0079]其中，I (u, vM)為分光瞳雷射差動共焦響應；u為軸向歸一化光學坐標，Vm為針孔軸向偏移量。分光瞳雷射差動共焦響應曲線29的「過零點」與激發光束的聚焦焦點精確對應，通過響應曲線29的「過零點」獲得被測樣品5表面的高度信息，結合位移傳感器17反饋的位置信息重構出被測樣品5的表面三維形貌。
[0080]經二向色分光系統6透射的拉曼散射光進入拉曼光譜探測系統7，經第一聚光鏡8及其焦點上的第一針孔23後進入拉曼光譜探測器9以及其後的第一探測器10，測得載有被測樣品5光譜信息的拉曼散射光譜響應曲線I (r)30，其中r為被測樣品5受激發光所激發出拉曼散射光的波長；
[0081]對接收瑞利光的分光瞳雷射差動共焦探測系統11獲得的探測光斑進行分割處理，得到探測區域A14和探測區域B15。
[0082]若對兩個探測區域的信號進行差動相減處理，得到分光瞳雷射差動共焦響應I (U，vM)，再通過其絕對零點，精確捕獲激發光斑的焦點位置，系統可以進行高空間分辨的三維尺度層析成像。
[0083]若對接收拉曼散射光的拉曼光譜探測系統7獲得的光譜響應曲線I (r)30進行處理時，系統可以進行光譜探測。
[0084]若對接收瑞利光的分光瞳雷射差動共焦探測系統11獲得的分光瞳雷射差動共焦響應I (U，vM)和拉曼散射光的拉曼光譜探測系統7獲得的光譜信號I (r)進行處理時，系統可以進行高空間分辨的微區圖譜層析成像，即實現被測樣品5幾何位置信息和光譜信息的高空間分辨的「圖譜合一」探測效果。
[0085]如圖10所示，分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜探測裝置包括產生激發光束的光源系統1、測量物鏡2、照明光瞳3、收集光瞳4、NotchFilter6、拉曼光譜探測系統7、分光瞳雷射差動共焦探測系統11、三維掃描系統16、位移傳感器17以及數據處理單元18 ;其中，在測量物鏡2的光瞳面上放置照明光瞳3和收集光瞳4 ;測量物鏡2和照明光瞳3放置在光源系統I的光束出射方向上，照明光瞳3與激發光束同軸，NotchFilter6放置在收集光瞳4之後，拉曼光譜探測系統7放置在NotchFiltere的透射方向上，分光瞳雷射差動共焦探測系統11在的反射方向上，數據處理單元18用於融合併處理拉曼光譜探測系統7、分光瞳雷射差動共焦探測系統11和位移傳感器17採集到的數據；NotChFilter6與收集光瞳軸線的夾角β是可變的，可選擇適當的角度β以滿足分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試裝置的結構設計；拉曼光譜探測系統7中第一聚光鏡8的焦點處放置第一針孔23對雜散光進行濾除，以提高光譜探測信噪比；光源系統I通過包括第三聚光鏡25、位於第三聚光鏡25焦點處的第二針孔26、以及焦點位於第二針孔26處的第三聚光鏡27構成的光束調製系統24對光源系統I發出的激發光束進行調製，以保證激發光束的質量；分光瞳雷射差動共焦探測系統11中第二聚光鏡12焦面上的像通過放大物鏡28放大後進入圖像採集系統13，以便於探測器進行分割焦斑探測，提高探測精度。
[0086]以上結合附圖對本發明的【具體實施方式】作了說明，但這些說明不能被理解為限制了本發明的範圍，本發明的保護範圍由隨附的權利要求書限定，任何在本發明權利要求基礎上進行的改動都是本發明的保護範圍。
【權利要求】
1.一種分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試方法，其特徵在於包括以下步驟: 首先，在測量物鏡(2 )的光瞳面上放置照明光瞳(3 )和收集光瞳(4);光源系統(I)發出激發光束，激發光束透過照明光瞳(3)後，聚焦在被測樣品(5)上，激發出載有被測樣品(5)光譜特性的拉曼散射光，同時反射出瑞利光；拉曼散射光和瑞利光經收集光瞳(4)後到達二向色分光系統(6) ;二向色分光系統(6)對拉曼散射光和瑞利光進行無損分離； 經二向色分光系統(6)反射的瑞利光進入分光瞳雷射差動共焦探測系統(11);分光瞳雷射差動共焦探測系統(11)利用探測器橫向偏移能夠使分光瞳共焦顯微系統的軸向響應特性曲線產生相移的特性，採用單光路、單探測器分割焦斑差動方法，實現對被測樣品(5)微區幾何位置的探測，具體過程為:對接收瑞利光的分光瞳雷射差動共焦探測系統(11)所獲得的探測光斑進行分割處理，得到探測區域A和探測區域B ;當對A、B兩個探測區域的信號進行差動相減處理時，能夠進行高空間分辨的三維尺度層析成像； 與此同時，經二向色分光系統(6)透射的拉曼散射光進入拉曼光譜探測系統(7)，利用分光瞳雷射差動共焦響應曲線(29)的「過零點」與測量物鏡焦點位置精確對應特性，將分光瞳雷射差動共焦響應曲線的「過零點」精確對應測量物鏡的焦點，通過「過零點」觸發來精確捕獲激發光斑焦點位置的光譜信息，實現高空間分辨的光譜探測。 當對接收拉 曼散射光的拉曼光譜探測系統獲得的光譜信號進行處理時，系統能夠進行拉曼光譜探測；當對接收瑞利光的分光瞳雷射差動共焦探測系統獲得的差動信號和接收拉曼散射光的拉曼光譜探測系統獲得的光譜信號進行處理時，系統能夠進行高空間分辨的微區圖譜層析成像，即實現對被測樣品「圖譜合一」的分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜高空間分辨成像與探測。
2.根據權利I所述的分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試方法，其特徵在於:照明光瞳(3)和收集光瞳(4)可以是圓形的；還可以是D形或者其他形狀。
3.根據權利I所述的分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試方法，其特徵在於:激發光束可以是線偏光、圓偏光等偏振光束；還可以是由光瞳濾波技術生成的結構光束，偏振光與光瞳濾波技術結合可以壓縮測量聚焦光斑尺寸，提高系統的橫向分辨力。
4.根據權利I所述的分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試方法，其特徵在於:該系統還可以探測包括螢光、布裡淵散射光、康普頓散射光等的散射光譜。
5.一種分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試裝置，其特徵在於:包括產生激發光束的光源系統(I)、測量物鏡(2)、照明光瞳(3)、收集光瞳(4)、二向色分光裝置(6)、拉曼光譜探測裝置(7)、分光瞳雷射差動共焦探測裝置(11)、三維掃描裝置(16)、位移傳感器(17)以及數據處理單元(18)； 其中，在測量物鏡(2)的光瞳面上放置照明光瞳(3)和收集光瞳(4)，照明光瞳(3)和測量物鏡(2)依次位於光源系統(I)的激發光束出射方向上，照明光瞳(3)與激發光束同軸；二向色分光系統(6)位於收集光瞳(4)之後；拉曼光譜探測系統(7)位於二向色分光系統(6)的透射方向上；分光瞳雷射差動共焦探測系統(11)位於二向分光系統(6)的反射方向上；被測樣品(5)固定在三維掃描裝置(16)的載物臺上； 數據處理單元(18)包括分割焦斑探測模塊(19)、差動相減模塊(20)和數據融合模塊(21);其中，分割焦斑探測模塊(19)和差動相減模塊(20)用於處理圖像採集系統(13)探測到的光斑，得到分光瞳雷射差動共焦響應曲線(29)，由此得到被測樣品(5)的位置信息；數據融合模塊(21)用於融合位置信息和光譜信息，完成被測樣品(5)的三維重構及光譜信息融合；三者關聯關係為:分割焦斑探測模塊(19)將圖像採集系統(13)採集到的艾利斑進行分割並探測，得到的信號進入差動相減模塊(20)進行差動相減後，得到分光瞳雷射差動共焦響應曲線(29 )進入數據融合模塊(21); 計算機處理系統(22)與位移傳感器(17)、三維掃描裝置(16)、數據融合模塊(21)相連接；圖像採集系統(13)和分割焦斑探測模塊(19)相連接。數據融合模塊(21)與第一探測器(10)相連接； 通過計算機處理系統(22)控制三維掃描裝置(16)移動被測樣品(5)，使不同區域瑞利光及對應該區域被測樣品(5)的拉曼散射光通過測量物鏡(2)和收集光瞳(4)。
6.如權利要求5所述的一種分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試裝置，其特徵在於，二向色分光裝置(6)與收集光瞳(4)軸線的夾角β可變。
7.如權利要求2所述的一種分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試裝置，其特徵在於，拉曼光譜探測系統(7)包括第一聚光鏡(8)、光譜探測器(9)和第一探測器(10);其中，光譜探測器(9)的探測面位於第一聚光鏡(8)的焦點處，第一探測器(10)位於光譜探測器(9)之後。
8.如權利要求4所述的一種分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試裝置，其特徵在於，在第一聚光鏡(8)的焦點位置安放有第一針孔(23)，且光譜探測器(9)位於第一針孔(23)之後。
9.如權利要求2所述的一種分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試裝置，其特徵在於，分光瞳雷射差動共焦探測系統(11)包括第二聚光鏡(12)和圖像採集系統(13)，其中，圖像採集系統(13)的探測面位於第二聚光鏡(12)的焦點處。還可以包括圖像放大系統(28)，圖像放大系統(28)與第二聚光鏡(12)共焦點，圖像採集系統(13)位於圖像放大系統(28)的焦點處。
10.如權利要求2所述的一種分光瞳雷射差動共焦拉曼光譜測試裝置，其特徵在於，在光源系統(I)和照明光瞳(3 )之間安放光束調製系統(24 );光束調製系統(24 )包括沿光路依次放置的第三聚光鏡(25)、位於第三聚光鏡(25)焦點處的第二針孔(26)以及焦點位於第二針孔(26)處的第四聚光鏡(27)。
【文檔編號】G01N21/65GK103969239SQ201410083285
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年3月7日 優先權日:2013年9月6日
【發明者】趙維謙, 盛忠, 邱麗榮, 邵榮君 申請人:北京理工大學