用於檢測物質致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型的製作方法

2023-07-11 02:44:01

專利名稱：用於檢測物質致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種人工表皮體外模型，具體地說，涉及一種用於檢測物質致敏性以 及用於皮膚外用免疫調節藥物的篩選或藥效學評價的人工表皮體外模型，屬於生物醫學技 術領域。
背景技術：
近年來，隨著環境汙染加重，化學品濫用，外界有害物質刺激增多，皮膚過敏的發 生率呈逐年上升趨勢。對於物質致敏性的評價越來越引起人們的注意，傳統的評價方法主 要是以動物試驗為主，但在全球動物保護運動的影響下，發達國家普遍開展了以替代、減少 和優化為核心的「3R」運動，體外替代試驗將逐步取代動物試驗。目前，許多國家都在對動 物替代評價體系進行研究，基於細胞的動物替代試驗方法是研究的熱點。現階段基於細胞的動物替代實驗方法包括細胞的二維或三維培養。細胞的二維培 養檢測體系缺乏角質層的屏障結構，與在體情況不符，而且對難溶性物質或製劑無法檢測； 細胞的三維培養，即構建人工表皮，包括兩種模式角質形成細胞構建的人工表皮，以及角 質形成細胞與Langerhans前體細胞構建的人工表皮。其中，角質形成細胞構建的人工表皮 由於缺乏Langerhans相關功能的細胞，導致物質致敏性判斷的敏感度和特異性差。另一方 面，目前使用的Langerhans前體細胞包括⑶34+造血幹細胞和外周血單核細胞。經過誘導 得到Langerhans細胞後，與角質形成細胞一起構建出人工表皮，用於檢測物質的致敏性。 但是，由於Langerhans前體細胞來源有限且存在明顯的個體差異，容易對結果的判斷產生 幹擾，同時前體細胞誘導分化效率低，同時存在批次間差異，因此導致的試驗周期長，難以 商品化等問題。對於物質致敏性終末指標的判斷，有兩種方法，即流式細胞法分析細胞表面標記 分子的變化和ELISA法檢測相關細胞因子的分泌。大量研究表明各種替代Langerhans細 胞的免疫細胞，其表面的CD86、CD54，細胞培養液中IL-I β的表達水平與物質致敏性有很 強的相關性，三者聯合作為判斷終點具有很高的敏感度、特異性和準確性。單核細胞系是建系的單核細胞，研究表明在致敏物作用下單核細胞系可以表現出 Langerhans細胞的功能，細胞表面高表達⑶86和⑶54，同時分泌大量的IL-I β，且具有獲 取容易、培養簡單、便於大規模擴增的優點，是理想的Langerhans替代細胞，可用於檢測物 質的致敏性。另外單核細胞系的細胞經過誘導培養可得到樹突狀細胞，作為一種專業的抗原遞 呈細胞，它能夠表達各種炎症相關因子，如TNF- α、IL-I β、IL_6及IL_8等，在各種免疫調 節藥物的作用下，這些細胞因子的表達水平會發生相應改變，可以根據這些改變來進行免 疫調節藥物的篩選以及藥效學評價。但是，目前用單核細胞系細胞建立的模型均為單細胞二維培養模型，缺乏角質層 屏障，因此只能用來檢測可溶性物質的致敏性，不能用來檢測不溶性物質及外用製劑的致 敏性，也不能反映外用免疫調節藥物的透皮性能。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足之處，提供一種能夠用於檢測物質致敏性以 及用於皮膚外用免疫調節藥物的篩選或藥效學評價的人工表皮體外模型。本發明的用於檢測物質致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型，是由人工表皮和 單核細胞系細胞共培養而得。優選地，所說的單核細胞系選自THP-1、MUTZ-3、KG-1或U937細胞系。本發明的用於檢測物質致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型的構建方法，包括 下列步驟1)用人角質形成細胞構建人工表皮；2)將單核細胞系細胞與步驟1)中得到的人工表皮進行共培養，獲得人工表皮體 外模型。優選地，本發明的用於檢測物質致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型的構建方法，包括 下列步驟1)取人角質形成細胞懸液，接種到插入式培養皿的上室內，接種前預先在插入式 培養皿的下室內種滿人成纖維細胞，接種後在37°C、含5% CO2的培養箱中培養1-5天，待 細胞生長至匯合狀態後，轉至氣液界面培養10-20天，得到人工表皮；2)將單核細胞系細胞以(2-8) X IO5個/ml的密度接種於孔板內，將步驟1)中得 到的人工表皮連同插入式培養皿的上室一起轉移至培養有單核細胞系細胞的孔內，共培養 12-48小時至穩定狀態，得到人工表皮體外模型。所說的單核細胞系選自THP-1、MUTZ-3、KG_1或U937細胞系。本發明的用於檢測物質致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型，不僅能夠用於檢 測物質的致敏性，而且能夠用於皮膚外用免疫調節藥物的篩選或藥效學評價，應用範圍廣 泛，具有如下技術效果1、本發明將人工表皮與單核細胞系的細胞共培養，建成穩定的體外模型，能克服 現有的二維或三維試驗方法的弱點。由於模型中存在角質層的屏障結構，更接近在體情況， 可以用於各種化合物或外用製劑致敏性的檢測；同時由於採用的是單核細胞系的細胞，能 大大提高物質致敏性判斷的敏感度、特異性和準確性，也克服了 Langerhans前體細胞來源 有限而不易產業化的問題；在檢測物質的致敏性時，通過檢測模型中相關細胞因子及細胞 表面標記物的變化，可評價各種化合物、皮膚外用製劑及化妝品的致敏性，檢測方法簡單、 靈敏度高，應用範圍廣；2、本發明的人工表皮與單核細胞系的細胞共培養體外模型，在各種皮膚外用免疫 調節藥物的作用下，體外模型中的相關細胞因子會發生變化，通過對細胞因子的變化情況 進行檢測，可以對皮膚外用免疫調節藥物進行篩選或藥效學評價；3、本發明的人工表皮體外模型構建成本低，批間差異小，質量容易控制；4、本發明的人工表皮體外模型所用的材料易得，便於規模化生產。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
來對本發明作進一步地詳細說明。實施例中所用的THP-1、MUTZ-3、KG-I和U937細胞系均購買自ATCC。人角質形成細胞的製備參照下列文獻中的方法=Boyce ST, Ham RG. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol,1983,81(ISuppl) :33s_40s.。人成纖維細胞的製備參照下列文獻中的方法Gray ΒΑ, Gollin SM. Rapid cell culture procedure for tissue samples. Am J Med Genet,1987,28 (2) :521_6.。實施例11、本實施例中的用於檢測物質致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型，是由人工 表皮和THP-I細胞系細胞共培養而得。2、本實施例中，人工表皮體外模型的構建方法包括下列步驟1)取人角質形成細胞懸液，以5X 105/ml的密度接種到插入式培養皿的上室內，接 種前預先在插入式培養皿的下室內種滿人成纖維細胞，接種後在37°C、含5% CO2的培養箱 中培養3天，待細胞生長至匯合狀態後，轉至氣液界面培養14天，得到人工表皮；2)將THP-I細胞系細胞以5X105/ml的密度接種於孔板內，將得到的人工表皮連 同插入式培養皿的上室一起轉移至培養有THP-I細胞系細胞的孔內，共培養24小時達到穩 定狀態，即得到人工表皮體外模型。3、利用本實施例的人工表皮體外模型來檢測物質DNFB (2,4- 二硝基氟苯)的致敏 性實驗組將3mg DNFB均勻置於人工表皮體外模型表面，在37°C、含5% CO2的培養 箱中培養24小時，收集THP-I細胞及其培養液，培養液用於檢測或冷凍保存。對照組人工表皮體外模型上不使用DNFB，直接收集THP-I細胞及其培養液，培養 液用於檢測或冷凍保存。對照組和實驗組平行進行。對實驗組和對照組收集的細胞和細胞液進行分析，用流式細胞儀檢測實驗組的 THP-I細胞表面⑶86和⑶54分子的變化，用ELISA試劑盒檢測實驗組和對照組所獲得的培 養液中IL-I β的含量。檢測結果(1)流式檢測實驗組的THP-I細胞表面⑶86的RFI值為191，⑶54的RFI值為 329 ；(2)實驗組中IL-I β的含量為248. 8108士 1. 998ng/L，空白對照組中IL-I β的含 量為 155. 0082 士 1. 268ng/L，有統計學意義(P 120，並且細胞 培養液中IL-I β的含量高於對照組IL-I β的含量，且有統計學意義時，以上指標聯合判斷 物質具有致敏性；否則判斷物質不具有致敏性。檢測結果表明DNFB具有致敏性。實施例2
1、本實施例中的用於檢測物質致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型，是由人工 表皮和MUTZ-3細胞系細胞共培養而得。2、本實施例中，人工表皮體外模型的構建方法包括下列步驟1)取人角質形成細胞懸液，以2X 105/ml的密度接種到插入式培養皿的上室內，接 種前預先在插入式培養皿的下室內種滿人成纖維細胞，接種後在37°C、含5% CO2的培養箱 中培養5天，待細胞生長至匯合狀態後，轉至氣液界面培養14天，得到人工表皮；2)將MUTZ-3細胞系細胞以2X105/ml的密度接種於孔板內，所用的培養基是含 20% FBS和10%飼養層5637細胞條件培養基的MEM培養基。其中飼養層5637細胞條件 培養基的製備方法為用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養該細胞至匯合狀態後，換 液，繼續培養48小時，收集培養液上清，過濾，凍存備用。將構建的人工表皮連同插入式培養皿的上室一起轉移至培養有MUTZ-3細胞系細 胞的孔內，共培養24小時達到穩定狀態，即得到人工表皮體外模型。3、利用本實施例的人工表皮體外模型來檢測物質DNCB (2,4- 二硝基氯苯)的致敏 性實驗組將3mg DNCB均勻置於得到的人工表皮體外模型表面，於37°C、含5% CO2 的培養箱中培養24小時，收集MUTZ-3細胞及其培養液，培養液用於檢測或冷凍保存。對照組人工表皮體外模型上不使用DNCB，收集MUTZ-3細胞及其培養液，培養液 用於檢測或冷凍保存。對照組和實驗組平行進行。對實驗組和對照組收集的細胞和細胞液進行分析，用流式細胞儀檢測實驗組的 MUTZ-3細胞表面⑶86和⑶54分子的變化，用ELISA試劑盒檢測實驗組和對照組所獲得的 培養液中IL-I β的含量。檢測結果(1)流式檢測實驗組的結果是CD86的RFI值180，CD54的RFI值為128。(2)實驗組中IL-I β的含量為158. 0572士0. 6632ng/L，空白對照組中IL-I β的 含量為 110. 5537 士 0. 7758ng/L，有統計學意義(P < 0. 05)。判斷標準同實施例1，檢測結果表明DNCB具有致敏性。實施例31、本實施例中的用於檢測物質致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型，是由人工 表皮和KG-I細胞系細胞共培養而得。2、本實施例中，人工表皮體外模型的構建方法包括下列步驟1)取人角質形成細胞懸液，以8X 105/ml的密度接種到插入式培養皿的上室內，接 種前預先在插入式培養皿的下室內種滿人成纖維細胞，接種後在37°C、含5% CO2的培養箱 中培養1天，待細胞生長至匯合狀態後，轉至氣液界面培養14天，得到人工表皮；2)將KG-I細胞系細胞以5XlO5Ail的密度接種於孔板內，用含10% FBSUOng/ mlGM-CSF、50pg/ml IL-4和40ng/ml TNF_a的1640培養基誘導培養3天。將得到的人工表 皮連同插入式培養皿的上室一起轉移至培養有KG-I細胞系細胞的孔內，共培養24小時達 到穩定狀態，建立人工表皮體外模型。3、利用本實施例的人工表皮體外模型來檢測物質DNCB (2,4- 二硝基氯苯)的致敏性實驗組將3mg DNCB均勻置於構建的人工表皮體外模型表面，於37°C、含5% CO2 的培養箱中培養24小時，收集KG-I細胞及其培養液，培養液用於檢測或冷凍保存。對照組人工表皮體外模型上不使用DNCB，收集KG-I細胞及其培養液，培養液用 於檢測或冷凍保存。對照組和實驗組平行進行。對實驗組和對照組收集的細胞和細胞液進行分析，用流式細胞儀檢測實驗組的 KG-I細胞表面⑶86和⑶54分子的變化，用ELISA試劑盒檢測實驗組和對照組所獲得的培 養液中IL-I β的含量。檢測結果(1)流式檢測實驗組的結果是⑶86的RFI值139，⑶54的RFI值為148 ；(2)實驗組中IL-I β的含量為203. 2301 士0. 876ng/L，空白對照組中IL-I β的含 量為 120. 5532 士 0. 6852ng/L，有統計學意義(P < 0. 05)。判斷標準與實施例1中相同，檢測結果表明DNCB具有致敏性。實施例41、本實施例中的用於檢測物質致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型，是由人工 表皮和U937細胞系細胞共培養而得。2、本實施例中，人工表皮體外模型的構建方法包括下列步驟1)取人角質形成細胞懸液，以5 X 105/ml的密度接種到插入式培養皿的上室內，接 種前預先在插入式培養皿的下室內種滿人成纖維細胞，接種後在37°C、含5% CO2的培養箱 中培養3天，待細胞生長至匯合狀態後，轉至氣液界面培養14天，得到人工表皮；2)將U937細胞系細胞以8 XlO5Ail的密度接種於孔板內，用含10% FBS和50pg/ ml IL-4的RPMI1640培養基培養，將構建的人工表皮連同插入式培養皿的上室一起轉移至 培養有U937細胞系細胞的孔內，共培養12小時達到穩定狀態，即得到人工表皮體外模型。3、利用本實施例的人工表皮體外模型來檢測物質DNCB (2,4- 二硝基氯苯)的致敏 性實驗組將3mg DNCB均勻置於構建的人工表皮體外模型表面，於37°C、含5% CO2 的培養箱中培養24小時，收集U937細胞及其培養液，培養液檢測或冷凍保存。對照組人工表皮體外模型上不使用DNCB，收集U937細胞及其培養液，培養液用 於檢測或冷凍保存。 對照組和實驗組平行進行。對實驗組和對照組收集的細胞和細胞液進行分析，用流式細胞儀檢測實驗組的 U937細胞表面⑶86和⑶54分子的變化，用ELISA試劑盒檢測實驗組和對照組所獲得的培 養液中IL-I β的含量。檢測結果(1)流式檢測實驗組的結果是CD86的RFI值273，CD54的RFI值為236 ；(2)實驗組中IL-I β的含量為197. 562士0. 749ng/L，空白對照組中IL-1 β的含 量為 106. 112 士 0. 7958ng/L，有統計學意義(P < 0. 05)。判斷標準與實施例1中相同，檢測結果表明DNCB具有致敏性。
權利要求
一種用於檢測物質致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型，其特徵在於，所說的模型是由人工表皮和單核細胞系細胞共培養而得。
2.根據權利要求1所述的用於檢測物質致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型，其特 徵在於，所說的單核細胞系選自THP-1、MUTZ-3、KG-1或U937細胞系。
3.一種用於檢測物質致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型的構建方法，其特徵在 於，包括下列步驟1)用人角質形成細胞構建人工表皮；2)將單核細胞系細胞與步驟1)中得到的人工表皮進行共培養，獲得人工表皮體外模型。
4.根據權利要求3所述的人工表皮體外模型的構建方法，其特徵在於，包括下列步驟1)取人角質形成細胞懸液，接種到插入式培養皿的上室內，接種前預先在插入式培養 皿的下室內種滿人成纖維細胞，接種後在37°C、含5% CO2的培養箱中培養1-5天，待細胞 生長至匯合狀態後，轉至氣液界面培養10-20天，得到人工表皮；2)將單核細胞系細胞以(2-8)X105個/ml的密度接種於孔板內，將步驟1)中得到的人 工表皮連同插入式培養皿的上室一起轉移至培養有單核細胞系細胞的孔內，共培養12-48 小時至穩定狀態，得到人工表皮體外模型。
5.根據權利要求3或4所述的人工表皮體外模型的構建方法，其特徵在於，所說的單核 細胞系選自THP-1、MUTZ-3、KG-1或U937細胞系。
全文摘要
本發明提供了一種用於檢測物質致敏性以及用於皮膚外用免疫調節藥物的篩選或藥效學評價的人工表皮體外模型，所說的模型是由人工表皮與單核細胞系細胞共培養而得。本發明的人工表皮體外模型具有如下技術效果1、通過檢測模型中相關細胞因子及細胞表面標記物的變化，可評價各種化合物、皮膚外用製劑及化妝品的致敏性；在判斷物質致敏性時，具有很高的敏感度、特異性和準確性，檢測方法簡單，應用範圍廣；2、可以用於皮膚外用免疫調節藥物的篩選或藥效學評價；3、模型構建成本低，批間差異小，質量容易控制；4、模型所用的材料易得，便於規模化生產。
文檔編號C12N5/071GK101955908SQ20101023379
公開日2011年1月26日 申請日期2010年7月22日 優先權日2010年7月22日
發明者劉維達, 周武慶, 曹玉萍, 馬鵬程 申請人:中國醫學科學院皮膚病研究所