測定鈉-質子-交換蛋白配體功效的方法

2023-08-11 15:16:36 2

專利名稱：測定鈉-質子-交換蛋白配體功效的方法
測定鈉-質子-交換蛋白配體功效的方法本發明涉及測定離子通道配體的功效的方法。膜轉運蛋白的Na+/H+-交換蛋白或者鈉_質子-交換蛋白(NHE)家族利用細胞外到細胞內Na+梯度來驅使H+從細胞中流出。這組轉運蛋白(或者離子通道)實現的基本功能包括調節細胞體積和PH以及在細胞增殖中的許可作用和Na+的經上皮轉運。哺乳動物 NHE是一種發揮將1個細胞內質子交換1個細胞外鈉離子作用的膜內在蛋白質。通過涉及離子流動，NHE可用於調節細胞內pH和細胞體積，以及啟動細胞生長或者機能狀態的變化。 除了其生理學作用之外，NHE還在人病理學中起重要作用。在心肌梗塞期間和之後導致的人心肌膜損傷中，NHE引起的轉運起著關鍵作用，並且被認為代表在癌性細胞的致癌性轉化中的重要步驟。因此，NHE多年來已經是心血管和腫瘤學研究中的靶標，並且已經對成千上萬種化合物進行NHE抑制性和選擇性的篩選。測定NHE拮抗劑的效能的標準方法是ktiwark和其合作者(ktiwark et al., 1998,Pflugers Arch. ,336(5) :797-800)以及Wiemann和其合作者(ffiemann etal.，1999， PflugersArch. ,436(3) =255-262)描述的體外測定。在測定配體在所選的NHE上的IC5tl之後，可用相同的測定測量對其它NHE的選擇性。一般而言，選擇具有優良選擇性的有效力配體用於進一步的藥代動力學研究、配體的體內驗證研究。然而，一些非常有效力的化合物在體內研究中僅僅顯示微小的效果。其原因可能是高的蛋白質結合、低的生物利用度或者其它降低化合物在血漿中的有效濃度的作用。期望在藥物開發過程的非常早的時期排除這些化合物以節省時間和資源。由於幾種化合物的體外IC5tl與藥理學效能(功效)之間的偏差，因而需要發展測定或者模擬NHE配體或者其它離子通道配體在體內的功效的方法。因此，本發明的第一個主題是提供測定離子通道配體功效的方法。優選地，該測試應該是節約時間和成本的。在本申請的上下文中，術語離子通道理解為包括被動的離子通道以及主動的離子通道(離子轉運蛋白)。出乎意料地發現，離子通道配體的功效(尤其是NHE拮抗劑的功效)可通過使表達離子通道的細胞與動物血漿和離子通道配體接觸來測定。在該測試中，可測定離子通道配體對細胞的作用，其中該作用反映配體的體內功效。因此，本發明的第一方面提供測定離子通道配體的功效的方法，其包括下面步驟a)使表達離子通道的細胞與下面物質接觸iii)動物血漿，和iv)離子通道配體；以及b)測定離子通道配體對細胞的作用。簡而言之，該方法可如下進行將表達審議中的表達離子通道的適當細胞保持 (例如培養)在適當的條件下，並與動物血漿和所述離子通道配體進行接觸(溫育)。這兩成分可同時或者一起添加。在足以顧及對細胞的作用的時間之後，測定對細胞的作用。在所述接觸之後或者同時，觀察作用(信號)，其中對作用的檢測指示了離子通道配體對細胞的作用。在本發明的上下文中，術語「離子通道配體的功效」涉及離子通道配體的藥理學效能。與無血漿條件下的體外測定形成對比，在血漿的存在下進行的本發明方法慮及蛋白質結合量，吸收的程度和速率，配體利用度的分布、代謝和排洩和/或其它降低化合物在血漿中的有效濃度的作用。當將配體給藥於動物並從動物取出血漿時，該方法也慮及吸收的程度和速率，配體的分布、代謝和排洩。這些作用可取決於下列因素，包括但不限於藥物的物理性質(疏水性、pKa、溶解性)、藥物組成、在進食或者禁食狀態下給藥、生理節奏特性和/ 或與其它藥物、食物或者內源物質(例如酶)的相互作用。因此，術語「離子通道配體的功效」不但涉及配體與離子通道的結合和下遊信號傳導的誘導，而且還慮及配體在血漿和/或活的動物中的上述作用。這允許更方便地確認適於例如體內治療的候選藥物和/或排除具有低體內功效的化合物。配體對細胞的作用可以是對細胞的任何作用，包括但不限於形態學、生存力或者細胞內化合物的組成等的改變。該作用可以是處於任何水平的離子通道信號傳導，包括配體與離子通道的結合、離子的流出、各離子與靶標例如細胞內靶標的結合、確定細胞化合物例如第二信使(如cAMP、CGMP、Ca2+、IP3、二乙醯基甘油等)的量、確定細胞內蛋白(例如蛋白激酶A、蛋白激酶C或者MAP激酶)的激活態，確定mRNA或者蛋白質的量、任何改變的細胞機能(例如誘導細胞凋亡或者細胞周期停滯)等。該方法可用來測定或者模擬體內離子通道的配體功效。該方法的應用範圍的實例包括以下首先，可測量離子通道配體在源於用離子通道配體給藥的動物的血漿樣品中的有效濃度(例如參見實施例幻。若將配體給藥於動物，與配體的給藥量相比低的配體血漿濃度可解釋為差的生物利用度(例如由於低的血漿半衰期)。其次，可測定離子通道配體在血漿例如人血漿中的作用(例如參見實施例2)。與不含血漿的測定(這是本領域已知的)中測量的IC5tl相比，可以對配體的血漿結合和體內利用度得出結論。IC5tl與血漿中功效之間差異非常高的化合物可以較早地棄去，因此在藥物開發中能潛在地節約成本。目前，這些化合物只能在體內實驗之後才棄去。離子通道是一種通常為成孔的蛋白質，其有助於建立和控制離子通過質膜的流動。離子通道是膜內在蛋白質，或者更典型地是幾種蛋白質的組裝。這樣的多亞單元組裝通常涉及環繞貫穿質膜的孔緊密堆積的相同或者同源蛋白質的環狀排列，所述孔填充有水。 儘管一些通道僅僅基於電荷而允許離子通過，但是原型通道孔在其最窄處僅僅1或2個原子寬。其傳導特異的離子例如鈉離子或鉀離子，並將它們運輸通過膜。在一些離子通道中， 通過孔的通路由「門，，控制，該「門，，通過化學或電信號、溫度或者機械力開啟或者關閉，這取決於離子通道的種類。通常，根據門控、通過這些門的離子種類和孔數，對離子通道進行詳細說明。如果通道按門控分類，則通道分成兩類電壓門控離子通道(激活/失活取決於跨膜的電壓梯度)和配體門控離子通道(激活/失活取決於配體與通道的結合)。電壓門控通道的實例包括電壓門控鈉通道、電壓門控鈣通道、電壓門控鉀通道、一些瞬時型感受器電位通道、超極化-激活環核苷酸門控通道和電壓門控質子通道。配體門控通道的實例包括鉀通道例如內向整流鉀通道(inward-rectifier potassium channel)、 鈣激活鉀通道和雙孔結構域鉀通道、光門控通道如通道視紫紅和環核苷酸門控通道。當按通過通道的離子分類時，離子通道一般分為下面幾種氯離子通道、鉀通道(例如電壓門控鉀通道、鈣離子鈣激活鉀通道、內向整流鉀通道和雙孔結構域鉀通道)、鈉通道、鈣通道、質子通道(例如電壓門控質子通道)和相對非特異性離子的通用的離子通道(包括大多數瞬時型感受器電位通道)。一些離子通道影響細胞內pH，如碳酸氫鈉協同轉運蛋白和鈉離子質子交換蛋白 (NHE)。離子通道的活性可受到與審議中的離子通道結合的天然或人工產生的配體的影響。 這些配體的眾所周知的實例包括阻斷鈉通道的河豚毒素、海藻毒素、利多卡因和奴佛卡因以及阻斷鉀通道的樹突毒素、非洲蠍毒素(iberiotoxin)和蜘蛛毒素(heteropodatoxin)。如上所述，離子通道配體是與離子通道特異性結合的任意化學物質。「與離子通道特異性結合」根據本發明包括但不限於解離常數Kd不超過10_4mol/l優選不超過10_5mol/ 1的結合。解離常數Kd可以在例如本領域技術人員所熟知的競爭性結合實驗中根據下式測定B [L] = [L] / {[L] +KDL (1+ [L*] /KDLJ，其中[L]和[Li分別代表審議中的離子通道配體的濃度和可檢測的(例如標記的)離子通道配體如離子通道的放射性配體的濃度。Km和Kdw分別是審議中的離子通道配體和可檢測的配體的解離常數，B[L] (0%至100% )是在具體濃度的離子通道配體時的結
口 O在本發明的一種優選實施方案中，待確定的配體是激動劑或者拮抗劑。激動劑與離子通道結合併激活離子通道(例如通過引起構象變化來激活)。拮抗劑或者阻斷劑也與離子通道結合併使其失活。如果配體改變了離子通道的狀態(活性狀態或無活性狀態)，則激活和失活可引起可檢測的信號。優選，配體是使審議中的離子通道失活的拮抗劑。通過本發明方法表徵的配體可以用作有用於治療和預防與離子通道相關的障礙或疾病的潛在藥物。在本發明的一種優選實施方案中，離子通道是鈉-質子-交換蛋白(NHE)或者鈉-碳酸氫根-協同轉運蛋白。由於在細胞中起作用的蛋白質例如酶的結構極大地受到PH 的影響，存在蛋白質作用的最佳PH。基於該原因，保持和調節細胞內pH對於細胞保持細胞機能的體內穩態是極其重要的。在細胞的PH調節中涉及NHE以及鈉-碳酸氫根-協同轉運蛋白。鈉-碳酸氫根-協同轉運蛋白由細胞膜內外的Na+濃度梯度驅動，並將1個Na+以及1個或多個HCO3-離子一起運入細胞內。由於鈉-碳酸氫根-協同轉運蛋白存在於細胞膜中並且通過鈉-碳酸氫根-協同轉運蛋白運入細胞內的HC03_中和了細胞質中的H+，鈉-碳酸氫根-協同轉運蛋白在調節細胞內PH中起著重要的作用。同樣，NHE也在調節細胞內pH中起著重要的作用。迄今，已經在哺乳動物NHE家族中確定了 9種異形體(NHE1至NHE9)。異形體共有約25 70%的序列同一性，其計算相對分子量的範圍為約74000 93000。交換蛋白的結構分析表明它們具有相似的膜拓撲，其中氨基端膜結構域由12個跨膜段組成，而羧端細胞質結構域差異較大。很早就已知NHE對於腫瘤生長是重要的，因為當將缺少Na+/H+交換活性的腫瘤細胞移植入喪失免疫的小鼠時，它要麼不能生長腫瘤要麼顯示嚴重的遲緩生長。現在明顯的是，NHEl引起多種變異和/或惡性細胞內PH梯度的逆轉從而細胞內環境是鹼性而細胞外環境是酸性。該『惡性酸中毒』被認為代表致癌性轉化中的關鍵步驟且是發展和維持變異表型所必需的。此外，NHE尤其是NHEl牽涉幾種疾病的生理學，其中大部分研究集中在NHEl在心臟病和癌症中的作用。正常情況下，在心肌膜中NHEl移去過量的細胞內酸以交換細胞外鈉離子。增多的細胞內鈉離子被調控膜蛋白移去，所述調控膜蛋白包括Na+/K+ATP酶和Na+/ Ca2+交換蛋白。隨著在心肌梗塞期間和之後發生在人類心肌膜中的質子產生的增加，心肌膜出現問題。NHEl異形體是交換蛋白的『管家』異形體，且在基本上所有組織的質膜中普遍地表達。NHEl異形體是在心肌膜的質膜中發現的主要的NHE異形體。NHE2至NHE5異形體也位於質膜中，但是具有更有限的組織分布。NHE2和NHE3主要位於上皮的頂膜中且高度表達在腎和腸中。與它們成對比的是，NHE4主要富集於胃中，但是也表達在腸、腎、腦、子宮和骨骼肌中，而NHE5主要表達在腦中(但是也可能低水平地存在於其它非上皮組織(包括脾、睪丸和骨骼肌)中)。異形體NHE6至NHE9普遍地表達和存在於細胞內室中。這些細胞器膜 NHE被假定為調節細胞內室的腔內pH和陽離子濃度。NHE6在心、腦和骨骼肌中表達最高， 並位於早期循環核內體。NHE7異形體主要位於轉運高爾基氏體網絡，並因其介導Na+或者 K+流入以交換H+而不同於其它NHE異形體。最高的NHE8表達見於骨骼肌和腎，並且該異形體主要位於中間-至轉運-高爾基氏體室。最近鑑定出的NHE9異形體發現位於晚期循環核內體。NHE是利尿化合物阿米洛利(amiloride)及其類似物和苯甲醯胍衍生物抑制的靶標。對比不同的NHE異形體顯示對於這些抑制劑它們具有不同的親和性，在相似的實驗條件下具有下面的敏感順序NHE1 ^ NHE2 > NHE5 > NHE3 > NHE4。由於NHEl是對抑制最敏感的異形體且似乎是存在於心肌膜的質膜中的最重要的異形體，因此可以治療上利用這些抑制劑的選擇性質。在本發明的優選實施方案中，所述離子通道是NHE，例如NHE1、NHE2、NH3、NHE4、 NHE5、NHE6、NHE7、NHE8 或者 NHE9，優選 NHE1、NHE2、NHE3 或者 NHE5，尤其是 NHEl 或者 NHE3， 特別是NHEl。NHEl異形體是NHE家族的最佳表徵的異形體。NHEl為815胺基酸長，其中殘基1 至500代表膜結構域，殘基501至815代表胞質尾區。對於離子轉運，NHEl的膜結構域不但是必要的而且是充分的，而細胞溶質結構域涉及調節交換蛋白的活性。經由交換蛋白的離子流動受到跨膜Na+梯度的驅使，並且看來不需要直接的代謝能量輸入。如上所詳述，離子通道配體優選為激動劑或者拮抗劑。但是，由於NHE的臨床重要性，配體優選為NHE激動劑，更優選為NHE拮抗劑。如果審議中的離子通道在缺少配體時是失活的，那麼在激動劑的存在下監控拮抗劑的作用可能是必須的。在此情形下，拮抗劑的作用是使激動劑激活的離子通道失活。根據本發明，將細胞與配體和血漿一起溫育。所述細胞可以是表達審議中的離子通道的任何適當細胞。表達審議中的離子通道配體的細胞可以是天然表達離子通道的細胞。作為選擇，也可以將細胞進行基因修飾以表達離子通道。如本領域技術人員所知的那樣，可以對細胞進行分離(任選地，基因修飾的)，保持和培養。除了溫度和氣體混合物之外，在細胞培養系統中最常見的變量是生長培養基。 生長培養基的處方可在PH、葡萄糖濃度、生長因子和其它營養成分的存在等等方面上變化。 用於補充培養基的生長因子常常源於動物血液例如小牛血清。如本領域技術人員所知的那樣，基因修飾的細胞可以通過插入離子通道的全長編碼序列來獲得。本領域技術人員知道使用分子生物學的標準技術如何去得到離子通道蛋白的核酸序列編碼以及如何分離或產生這樣的核酸序列。這可通過例如利用限制性酶來使用和組合現有的序列完成。核酸可以與其它要素例如啟動子、轉錄起始和終止信號、以及翻譯起始和終止信號進行組合，以提供離子通道序列的表達。所形成的核酸序列可以例如利用病毒作為載體或者通過轉染(包括例如通過電穿孔、熱激、磁力轉染(magnetofection)、細胞核轉染(nucleofection)和使用轉染劑)引入細胞中。任選地，細胞可以是組織的一部分；但是本發明方法是離體法。在本發明的一種優選實施方案中，細胞來自細胞系(其中多數是充分表徵的，並提供恆定的條件且便於操作)，具體是哺乳動物細胞系，更具體是人或小鼠細胞系，尤其是小鼠LTK-細胞系 LAPl (Franchi et al. , 1986, Proc NatlAcad Sci U SA. 83 (24) :9388-9392)。適當的細胞系的實例包括但不限於 HEK 293、745-A、A-431、BxPC3、C5N、Caco-2、Capan-l、CC531、CFPAC、 CHO、CHO KU COS-U C0S-7、CV-U EAHY, EAHY 926、F98、GH3、H-295R、H-4-II-E、HACAT, HACAT A131、HEK、HEL、HeLa、H印 G2、High Five,Hs 766T、HT29、HUV_EC R24、HUV_EC_C、IEC 17、IEC 18, Jurkat, K 562、KARPAS-299、L 929、LIN 175、MAt-LYLU、MCF-7、MNEL、MRC-5、 MT4、N64、NCTC 2544,NDCK II,Neuro 2A、NIH 3T3、NT2/D1、P19、SF9、SK-UT-1、ST、SW 480、 SWU-20S、U-373、U-937和Yl。其它適當的細胞是本領域技術人員已知的那些。優選的細胞系是HEK 293細胞(原代人胚胎腎細胞)、3T3細胞(鼠胚胎成纖維細胞)、CH0細胞(中國倉鼠卵細胞)、C0S-7細胞(非洲綠猴細胞系)、HeLa細胞(人上皮樣子宮頸癌細胞)、JURKAT細胞(人T-細胞白血病細胞)、BHK 21細胞(倉鼠正常腎，成纖維細胞)和MCF-7細胞(人乳腺癌細胞)，尤其是小鼠LTK-細胞系LAPl。在本發明方法中，將細胞(如上所指出的)與動物的血漿一起溫育。所述動物可以是脊椎動物，具體是哺乳動物，尤其是大鼠、小鼠、兔子、豚鼠或者貓，它們提供在實驗室中方便和安全的操作。為了提供最有意義的人醫學結果，血漿也可以源於人類。因此，靜脈血可以由人供體的靜脈穿刺獲得，其中對於本發明方法(參見實施例)通常僅僅少量樣品例如5ml至 25ml血液樣品就足夠了。血液通常從前臂前區(肘的中隆內的一側)上的肘正中靜脈獲得。該靜脈靠近皮膚的表面，此處沒有大的神經分布。在發達國家中的大多數血液採集藉助由塑料針座、皮下注射針和真空管組成的抽真空管系統完成。根據本發明方法，測定離子通道配體的功效。功效通過測定在血漿的存在下離子通道配體對細胞的作用來確定。如上所詳述，可在信號傳導的各水平時評價配體對細胞的作用，包括配體與離子通道的結合，各離子與靶標的結合，確定細胞化合物例如第二信使的量，確定mRNA或者蛋白質的量，任何改變的細胞機能(例如誘導細胞凋亡或者細胞周期停滯)等。測定配體與靶標的結合的方法是本領域技術人員熟知的，包括本文指出的那些。確定mRNA或者蛋白質的量的方法也是本領域技術人員熟知的。觀察細胞機能的改變的方法很大程度取決於細胞機能的類型，並且也是技術人員熟知的。
7
測定離子通道配體對細胞的作用的方法可能包括異相或者單相測定。本文中使用的異相測定是包括一個或多個洗滌步驟的測定，而在單相測定中，這樣的洗滌步驟不是必須的。試劑和化合物僅僅進行混合和測量。本發明方法也可包括離子通道下遊信號特異性的抗體。所述測定可以是ELISA(酶聯免疫吸附測定)、DELFIA(解離放大鑭系螢光免疫測定)、SPA(閃爍親近測定)、flaShplate測定、FRET (螢光共振能量轉移)測定、TR-FRET (時間分辨螢光共振能量轉移)測定、FP (螢光極化)測定、ALPHA (放大螢光親近單相測定)、 EFC(酶片段互補)測定、二雜環測定或者共免疫沉澱測定。在本發明的另一種實施方案中，檢測功效的方法可以包括測量一種或多種第二信使例如cAMP或者磷脂，優選磷脂醯肌醇磷酸酯。該測量可包括測定一種或多種第二信使的濃度。測定一種或多種第二信使的濃度的手段和方法是本領域技術人員熟知的，包括涉及例如標記的前體優選標記的第二信使前體(例如[32P]ATP或者[3H]肌醇)的那些，其中包括通過例如柱色譜或者質譜純化。磷脂的改變通常在鈣通道處尤其相關。如果審議中的離子通道例如NHE或者鈉-碳酸氫根-協同轉運蛋白影響pH值，則通過本發明方法測定的作用是PH值的改變，優選細胞內pH值的改變。在本發明的一種優選實施方案中，離子通道配體對審議中的離子通道例如NHE或者鈉-碳酸氫根-協同轉運蛋白的作用通過螢光測定。螢光是一種光學現象，其中光子的分子吸收引發以更長的波長發射另一光子。吸收光子與發射光子之間的能量差以分子振動或者熱形式耗散。通常，吸收光子在紫外光區而發射光在可見光區，但是這取決於具體螢光團的吸收曲線和斯託克位移。螢光應用在生物醫學和相關科學中越來越廣泛。在些領域中的分析方法也越來越多，儘管是日益增多的以縮寫形式的令人遺憾的命名FLIM、FLI、FLIP、CALI, FLIE、FRET、FRAP、FCS, PFRAP、 smFRET、FIONA、FRIPS、SHREK、SHRIMP、TIRF。這些技術的大多數依賴於螢光顯微鏡。這些顯微鏡使用高強度的光源(通常汞或者氙的燈、LED或者雷射)來在待觀測的樣品中激發螢光。然後濾光片將激發光與發出的螢光分開，用眼睛或者(CCD)相機或其它光檢測器(光電倍增管、攝譜儀等)檢測。為了檢測審議中的信號(此處為離子通道配體的作用)，通常使用螢光染料或者標誌或標記。螢光染料包含螢光團。類似於生色團，螢光團是引起分子發螢光的分子成分。 它是分子中將吸收特定波長能量再發出不同(但也是特定的)波長的能量的官能團。發出的能量的數量和波長取決於螢光團和該螢光團所處的化學環境。異硫代氰酸酯螢光素(螢光素的反應衍生物)已經成為一種最常見的與其它非螢光性分子進行化學連接以產生用於各種應用的新的螢光性分子的螢光團。其它歷史上常用的螢光團是若丹明、香豆素和花青的衍生物。螢光染料的實例包括但不限於7-氨基-放射菌素D、吖啶橙、吖啶黃、Alexa Fluor、AnaSpec、金胺0、金胺-若丹明染色劑、苯並蒽酮、9，10-二(苯基乙炔基)蒽、5， 12-二(苯基乙炔基)丁省、CFDA-SE、CFSE、鈣黃綠素、羧基螢光素、l-氯-9，10-二(苯基乙炔基)蒽、2-氯-9，10-二 (苯基乙炔基)蒽、香豆素、花青、DAPI、Dioc6、DyLight Fluor、溴化乙錠、螢光素、Fura-2、Fura_2-乙醯氧基甲基酯、綠色螢光蛋白、Hilyte Fluor、Hoechst 染色劑、Vidian黃、Indo-Ι、熒蟲素、二萘嵌苯、藻膽色素、藻紅蛋白、藻紅素、碘化丙錠、螢光黃(pyranine)、若丹明、RiboGreeru紅熒烯、三(4，7-二苯基-1，10-菲繞啉酯)釕(II) (ruthenium(II) tris (bathophenanthroline disulfonate))、STOR 綠、均二苯乙烯、磺醯羅丹明101、TSQ、Texas紅、傘形酮、黃色螢光蛋白或者BCECF。根據一種優選的實施方案，使用BCECF。BCECF為2'，7'-雙(羧乙基)_5 (6)-羧基螢光素，C27H2tlO11),M = 520，45g/mol，CAS 號:85138-49_4，存儲；2 至 8°C，避光。BCECF 是羧基螢光素的類似物，由於其在細胞內增強的保留因而能更好地用於在淋巴細胞中PH測定。為了充分攝入完整細胞中，BCECF可以以乙醯氧基甲基酯BCECF/AM的形式使用，其在細胞內剪切成更不能滲透的BCECF。70nM的BCECF溶液的最大激發位於500nm。BCECF的螢光強度可以受到幾種試劑的影響，所述試劑例如甘油、蔗糖、聚乙二醇或者聚乙烯吡咯酮。 BCECF的適當濃度為5 μ M(最終濃度)。在本發明的上下文中，螢光染料對於離子通道配體對離子通道的作用是敏感的。 該作用可以是對通道本身的直接作用(例如構象變化、結合特性的變化等)或者審議中的離子通道的下遊的信號途徑變化，具體是通過審議中的離子通道轉運的離子的細胞內濃度變化。所述離子可以是例如H+、HC0」 K+、Na+、Cl—或者Ca2+。適當的pH依賴性螢光標誌 (針對H+和HCO3-)包括但不限於H+選擇性螢光生色團ETH 5294, S NAFL, SNARF, HPTS、螢光素、羧基螢光素、BCECFO' ,7' -二(2-羧乙基)5(和6)羧基螢光素)和BCPCFO'， 7' -二(2-羧丙基)-5(和6)羧基螢光素)。鈣離子可通過使用下面物質檢測水母素 (待分離的第一發光蛋白)、用Alexa-488或者photina標記的鈣調蛋白(Axxam SpA，義大利米蘭)、Fluo4 (甘氨酸，N-[4-[6-[(乙醯基氧基)甲氧基]_2，7- 二氟-3-氧代-3H-夾氧雜蒽-9-基]-2-[2-[2-[ 二 [2-[(乙醯基氧基)甲氧基]-2-氧代乙基]氨基]-5-甲基苯氧基]乙氧基]苯基]-N-[2-[(乙醯基氧基)甲氧基]-2-氧代乙基]-，(乙醯基氧基)甲基酯，C51H50F2N2O23)，M = 1096. 95g/mol, CAS 號:273221-67-3,存儲2 至 8 °C，避光)或者Fura-2(5-噁唑羧酸，2-(6-( 二乙醯基氧基)甲氧基)_2_氧代乙基)氨基)-5-0-(2-( 二(2-((乙醯基氧基)甲氧基)-2-氧代乙基)氨基)-5-甲基苯氧基)乙氧基)-2-苯並呋喃基)_(乙醯基氧基)甲基酯，C44H47N3O24)，M = 1001. 86g/mol, CAS號 108964-32-5，存儲-20°C，避光)。為了檢測鈉離子和鉀離子，可使用離子載體X和離子載體BME-44。上述方法可如下進行，其中下面僅供示例說明用。本領域技術人員會理解可以以不同方式進行一個或多個步驟(例如如本發明的說明書所述)細胞可以通過從組織中分離來獲得，用於離體培養。例如可將組織的片段置於生長培養基中，長出的細胞可用於培養。該方法被稱為移植培養。作為選擇，可使用細胞系 (例如確立或者永生化細胞系)。存在許多種代表具體細胞類型的確立細胞系(也參見前述)O細胞可培養在適當的培養基(例如可商購的包含血清和抗生素的培養基)。細胞通常培養在適當的氛圍(例如5% CO2)、相對溼度(例如90% )和溫度(例如在37°C )中。 為了高通量篩選和/或常規操作，細胞可培養在多孔板例如96孔板、M孔板等。如上所詳述，可使用螢光標誌測定細胞內pH變化。適當的標誌包括SNARF-I、 BCECF和CMFDA。激發和發射是激發485，發射590nm(對於羧基SNARF-1)；激發500，發射538nm(對於BCECF)；以及激發485，發射538nm(對於CMFDA)。激發和發射帶寬可以分別是20nm和25nm。測量細胞內pH的適當裝置例如是FLUOstar 97螢光計多孔板讀數器 (BMGLabTechnologies, Inc, Durham, NC)或者實施例中所述的裝置。
根據一種實施方案，使用螢光染料BCECF，即2'，7' -二(羧乙基)_5 (6)-羧基螢光素，C27H2tlO11)，M= 520，45g/mol，CAS 號:85138-49_4，存儲2 至 8°C，避光。BCECF 是羧基螢光素的類似物，由於其在細胞內增強的保留因而能更好地用於在淋巴細胞中PH測定。為了充分攝入完整細胞中，BCECF可以以乙醯氧基甲基酯BCECF/AM的形式使用，其在細胞內剪切成更不能滲透的BCECF。70nM的BCECF溶液的激發最大位於500nm。BCECF的螢光強度可以受到幾種試劑的影響，所述試劑例如甘油、蔗糖、聚乙二醇或者聚乙烯吡咯酮。BCECF 的適當濃度為5 μ M(最終濃度)。下面是製備用於細胞內PH測定的細胞的一個示例性方法細胞可以生長至例如 90%鋪滿，用例如胰蛋白酶收穫，並立即用含有例如10%胎牛血清的培養基淬滅，造粒，然後淋洗1次。將細胞粒再混懸於新鮮的培養基中，使其復原(例如在5%C02，37°C條件下1 小時)，用例如不含碳酸氫鹽的緩衝液(例如130mM NaCl,4. 7mM KCl、1. 2mM MgSO4U. 2mM KH2PO4Ul. 7mM D-葡萄糖、1.3mM CaCl2UOmM HEPES，pH 7.4)淋洗例如兩次，然後加載上面的標記物(染料)。根據另一實施方案，在加載染料之前，細胞未用胰蛋白酶處理。染料加載例如可以如下進行在室溫將細胞用5 μ M的5-(和-6)-羧基SNARF-I/ AM (Molecular Probes, Eugene, OR)溫育在不含碳酸氫鹽但含有 (wt/vol) Pluronic F-127 (Sigma Chemicals, St Louis,MO)的Krebs-H印es 緩衝液(pH 7.4)中 30 分鐘。細胞可以在室溫在緩衝液中用例如ΙμΜ的2，7-二(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基螢光素(BCECF/ AM) (Molecular Probes)加載45分鐘。細胞可以在37°C在緩衝液中用5 μ M CellTracker 綠色CMFDA(5-氯甲基螢光素二乙酸酯)(Molecular Probes)加載45分鐘。用一種或多種其它上述染料加載可以根據合適且熟知的規程類似地進行。在加載之後，細胞可以例如用緩衝液淋洗一次或多次(例如2次)，並再混懸於新鮮的培養基中，使其在5% CO2於371復原1小時或更長時間(例如過夜)。在染料加載和復原時間之後，可將細胞用合適的緩衝液例如不含碳酸氫鹽的Krebs-ifepes緩衝液(pH 7. 4或者6. 0)淋洗一次或多次(例如3次)，再混懸成最終濃度2. 5x IO6個細胞/毫升並保持在4°C。細胞可稀釋和平均地分布(約35000個細胞/孔)至不透明的白色96孔板(或者任何其它適當的板，例如具有透明底的黑色板)。血漿和僅僅的緩衝液或者含有配體的緩衝液可先後注入各孔中，並以合適的間隔(例如20秒)記錄螢光強度。在各注入之前，以合適的間隔(例如20秒間隔)記下幾個(例如5個)基線讀數。在各實驗結束時，用已知的離子通道配體(例如針對H+/K+交換蛋白，奈及利亞菌素)進行原位校準的方法可用於使螢光強度與PH值相關。這例如可以如此完成通過使細胞在去極化高 K+緩衝液(140mM KClU. 2mM MgSO4U. 2mM KH2PO4Ul. 7mM D-葡萄糖、1.3mM CaCl2UOmM HEPES, pH 6. 0至8. 0，在20 μ M奈及利亞菌素存在下)中暴露於不同的pH緩衝液，將K+/H+交換蛋白離子載體設置[K+]o= [K+] i和pHo = pHi。為了校正校準與實驗之間的小的細胞密度偏差和照明強度不穩定，通過在各實驗結束時用0. 1% Triton X-100 透化處理細胞並用KOH調節pH至11來測量CMFDA濃度。此外，可通過分離出來自漏出的和細胞內染料的貢獻來跟蹤染料漏出。為此，可將細胞以不同時間間隔離心例如30秒。然後，可測量各上清液和再懸浮細胞裂解物溶液的螢光強度。上清液的螢光強度反映染料從細胞中漏出，上清液和細胞裂解物的合併螢光強度
10可用於定義染料的總量。對照(沒有染料)的螢光強度可從各部分中減去，漏出可報導為螢光強度(上清液/總量)之比對時間的關係。進一步示例性方法描述在下面的實施例中。作為選擇，離子敏感性微電極(包括離子選擇性離子載體例如鈉離子載體二 (12-冠醚-4)，鉀離子選擇性離子載體二(苯並-15-冠醚-5)，鈣離子選擇性離子載體HDOPP-Ca)或者離子敏感性酶(例如鉀依賴性脲醯胺分解酶、丙酮酸激酶(美國專利 5，501，958和5，334，507)或者甘油脫氫酶(美國專利5，719，036))可以用於檢測穿過細胞膜的離子流出。其它PH敏感性方法包括弱酸或鹼的分布、31P-NMR光譜和pH敏感性綠色螢光蛋白[GFP]。優選地，採用高通量篩選的方法。在該方法中，針對審議中的離子通道，在全細胞測定中對大量化合物進行篩選。通常，這些篩選利用基於自動機器工作檯的技術或者以較高密度陣列(「晶片")格式在96孔板中進行。在本發明方法的一種實施方案中，將離子通道配體例如NHE配體給藥於細胞以及血漿。這可通過將配體給藥於非人類動物來實現。配體可以以任何適當的途徑給藥，包括腸胃外(例如靜脈、動脈內、肌肉、心內、皮下、皮內、鞘內、腹膜內)，腸內(例如口腔或者直腸)，表面(例如上表皮、吸入、鼻內或者陰道)等給藥。優選餵食給藥。在足以使配體存在於血漿中的時間量之後，對動物採集血漿。為了實施本發明方法，將包含配體的血漿加入細胞中，測定配體對細胞的作用。該作用的測定可包括測定血漿中配體濃度(同樣參見實施例幻。如果將給藥於動物的配體的量與血漿中存在的配體量進行比較，則可從該比較中得出關於例如吸收的程度和速率以及配體的分布、代謝和排洩的結論。根據本發明，測定離子通道配體作用的方法可用於測定配體的血漿濃度。這可通過將具有未知配體濃度的血漿的作用與標準例如標準曲線進行比較來完成(參見例如實施例2)。本發明方法可用於篩選預防和/或治療涉及離子通道機能障礙的疾病尤其是預防和/或治療心血管疾病或者癌症的藥物。如果用於篩選目的，測試的配體可以是已知的離子通道配體或者功能仍然未知的或者還未與離子通道相關的物質。因此，本發明方法可以用於確認新的離子通道配體。作為選擇，可利用本發明方法對已知的離子通道配體測試其功效。可將該功效與在不含血漿的系統中的配體作用(例如結合親合力)進行比較，從而評價血漿對配體活性的影響和估計配體的體內活性。配體可以以化合物庫的形式提供。化合物庫包括大量化合物，並且彙編自多種來源中的任一種(包括化學合成的分子和天然產物)，或者通過組合化學技術產生。它們尤其適於高通量篩選。它們可以由具有特定結構的化合物或者特定生物例如植物的化合物構成。在本發明的上下文中，所述化合物庫優選包含小分子的化合物庫。下面通過附圖
和實施例來說明本發明，這不意在限制本發明的範圍。附1顯示在大鼠血漿中的計算功效的卡立泊來德校準曲線(EC5tl = 115nM)。圖2顯示在大鼠血漿中的計算功效的新型化合物X校準曲線(EC5tl = 662nM)。圖3顯示利用NHEl體外測定估計的卡立泊來德和化合物X血漿濃度。實施例實施例1 建立一種測定來確定在動物血漿樣品中NHE拮抗劑有效濃度血漿樣品得自紐西蘭雄兔(2. 5-3. 5kg)，該標準兔子食用0. 3 %卡立泊來德(NHE 抑制劑)。在一周之後從耳動脈採取血樣，用於測定卡立泊來德的血漿濃度。測定卡立泊來德的血漿濃度如下所述進行將NHE-基因(SLC9A1，Franchi A. etal. ,Proc Natl Acad Sci USA.，1986Dec ； 83(24) =9388-92.)克隆至pMamneo-載體然後引入到LAPl (小鼠LTK-細胞系)細胞中。穩定的細胞系由轉染的細胞產生。將穩定表達人NHEl (hNHEl)的LAPl (小鼠LTK-細胞系)細胞以密度25，000個細胞/孔/100 μ 1培養基(Iscove-培養基，10%FCS，2mM L-穀氨醯胺，100u/ml青黴素/鏈黴素，50 μ g/ml慶大黴素，400 μ g/ml G418)在透明底的96孔黑色微量板(Costar , Corning Inc.，Corning, NY)上接種。將細胞在37°C>5% CO2和90%溼度的條件下溫育過夜。在測量之前棄去培養基，並加入100 μ 1/孔的染料緩衝液OOmM HEPES,用KOH調節至ρΗ 7. 4， 20mMNH4Cl，115mM 氯化膽鹼，ImM MgCl2, ImM CaCl2, 5mM KC1，5mM 葡萄糖，5 μ M BCECF)。在 37°C溫育20分鐘之後，用不含Na+的洗滌緩衝液(5mM HEPES，用KOH調節至ρΗ 7.4,133. 8mM 氯化膽鹼，4. 7mM KCl，1. 25mM CaCl2,1. 25mM MgCl2,0. 97mM K2HPO4,0. 23mM KH2PO4, 5mM葡萄糖)洗滌細胞3次，使每孔剩餘90μ 1洗滌緩衝液。用FLIPR(Fluorometric Imaging Plate Reader,Molecular Devices, Sunnyvale, CA ；雷射功率 0. 3W，孔徑 4，測量間隔 k，測量時間 120s)測量ρΗ恢復。在測量期間，向各孔加入90 μ 1血漿溶液(90%的來自未餵食拮抗劑的動物的動物血漿，10%的Na+-緩衝液IOmM HEPES，用KOH調節至pH 7.4,133. 8mM NaCl, 4. 7mM KCl，1. 25mM MgCl2,1. 25mM CaCl2,0. 97mM Na2HPO4,0. 23mM NaH2PO4, 5mM 葡萄糖)。由於緩衝液中的Na+，NHEl開始從細胞中轉運出H+，導致細胞內ρΗ升高和產生螢光。高對照 血漿溶液，無拮抗劑。低對照血漿溶液，具有20 μ M卡立泊來德(10 μ M最終濃度)。在製備後將卡立泊來德加入血漿中。加入10 μ M卡立泊來德導致完全阻斷NHEl活性。為了校準，在製備後將不同量的卡立泊來德和測試拮抗劑加入血漿中以確定在動物血漿中的功效。為了計算NHEl活性，計算第12秒和第32秒之間的螢光增大。高對照設為100% 的NHEl活性，而低對照確定為0%的NHEl活性。樣品通過與對照進行比較來計算樣品的％ 活性。表1 用源自兔子的血漿進行的血漿測定實施例
權利要求
1.測定離子通道配體的功效的方法，其包括下面步驟a)使表達離子通道的細胞與下面物質接觸i)動物血漿，和ii)離子通道配體；以及b)測定離子通道配體對細胞的作用。
2.權利要求1的方法，其中所述離子通道是鈉-質子-交換蛋白(NHE)或者鈉-碳酸氫根-協同轉運蛋白。
3.權利要求1或2的方法，其中所述NHE是NHEl、NHE2、NHE3或者NHE5，尤其是NHEl 或者NHE3，特別是NHE1。
4.權利要求1至3中任一項的方法，其中所述離子通道配體尤其NHE配體，是激動劑或者拮抗劑，尤其是NHE拮抗劑。
5.權利要求1至4中任一項的方法，其中所述細胞是細胞系，具體是哺乳動物細胞系， 特別是人或小鼠細胞系，尤其是小鼠LTK-細胞系LAP1。
6.權利要求1至5中任一項的方法，其中所述動物是脊椎動物，具體是哺乳動物，尤其是大鼠、小鼠、兔子、豚鼠或者貓。
7.權利要求1至5中任一項的方法，其中所述動物是人。
8.權利要求1至7中任一項的方法，其中所述作用是改變pH值。
9.權利要求1至8中任一項的方法，其中所述作用是改變細胞內pH值。
10.權利要求1至9中任一項的方法，其中所述作用通過螢光得到測定。
11.權利要求1至6和8至10中任一項的方法，其中NHE配體已被給藥於所述動物，該動物是非人類動物。
12.權利要求1至11中任一項的方法，其中所述方法用於測定配體的血漿濃度。
13.權利要求1至12中任一項的方法，其中所述方法用於篩選用來預防和/或治療涉及離子通道機能障礙的疾病的藥物。
14.權利要求1至13中任一項的方法，其中所述方法用於篩選用來預防和/或治療心血管病或者癌症的藥物。
全文摘要
本發明涉及測定離子通道配體的功效的方法，包括(a)使表達離子通道的細胞與(i)動物血漿和(ii)離子通道配體接觸，以及(b)測定離子通道配體對細胞的作用。
文檔編號G01N33/58GK102227640SQ200980147360
公開日2011年10月26日 申請日期2009年9月25日 優先權日2008年9月26日
發明者厄休拉·欣德勒, 託馬斯·利徹, 史蒂芬·謝弗, 漢斯-威利·詹森 申請人:賽諾菲-安萬特