一種乙型腦炎病毒懸浮培養方法與流程

2023-08-12 11:03:16 1

本發明涉及獸用生物製品技術領域，進一步涉及抗原的製備技術，具體涉及一種乙型腦炎病毒懸浮培養方法。

背景技術：

流行性乙型腦炎是由黃病毒科(Flaviviridae)、黃病毒屬(Flavivirus)的乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一種人獸共患蟲媒性傳染病。人、豬、馬屬動物等對該病毒均易感，其中對豬的危害最大。豬乙型腦炎主要表現為懷孕母豬流產、死胎、產弱仔、公豬睪丸炎等，常常給養豬業造成嚴重的經濟損失。

傳統滅活苗的製造工藝簡單，易保存，安全性好，但注射劑量大，需多次重複注射，且免疫效果較弱毒活疫苗差，在實際應用中使用很少。目前，弱毒活疫苗的使用已替代滅活苗。但如今乙型腦炎病毒一般以傳統轉瓶培養工藝進行增殖，其生產周期長、操作機械化程度低，汙染機率提高，諸多因素可影響抗原的生產及質量。儘管有研究者嘗試利用規模化的生物反應器進行連續式培養，但這種條件下一方面加大了生產成本，另一方面還存在著質量不穩定、汙染機率高等問題。

技術實現要素：

本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種乙型腦炎病毒懸浮培養方法，以解決現有技術的JEV病毒生產方法產量低、質量不穩定的技術問題。

本發明要解決的另一技術問題是現有技術中JEV病毒的大規模培養方法佔地面積較大、生產成本較高的技術問題。

為實現以上技術目的，本發明採用以下技術方案：

一種乙型腦炎病毒懸浮培養方法，包括以下步驟：

1)取微載體加入生物反應器，以每克微載體對應200～300ml PBS緩衝液的比例加入PBS緩衝液，浸泡2～3h，更換PBS緩衝液再浸泡1～2h，期間持續攪拌，棄去PBS緩衝液；以每克微載體對應100～150ml PBS緩衝液的比例加入PBS緩衝液，溼熱滅菌，冷卻後棄去PBS緩衝液，以培養基洗滌微載體2～3遍，加入新鮮培養基，冷卻至2～8℃，平衡8～12h，備用；

2)取步驟1)處理後的微載體，平衡其溫度至25～30℃，補充培養基至其中微載體濃度為2～3g/L；將Vero細胞以5×105～7×105cell/L的濃度接種，攪拌混勻，靜置；

3)調節生物反應器溫度36～38℃，在攪拌條件下培養，培養總時間35～40h時流加補料，培養總時間70～100h時接種乙型腦炎病毒；

4)以0.1～0.5的MOI值接種病毒，36～38℃靜置吸附，而後在攪拌條件下培養，此後16～24h時流加補料、50～70h時收穫病毒。

作為優選，所述微載體型號為cytodex1。

作為優選，所述生物反應器為攪拌式生物反應器，其攪拌器為推進式。

作為優選，所述生物反應器是潮汐式、旋轉式或灌注式微載體懸浮培養生物反應器。

作為優選，步驟1)中所述持續攪拌的轉速是10～15r/min。

作為優選，所述培養基中含有2～4％的新生牛血清。

作為優選，步驟2)中所述攪拌的轉速為45～55r/min。

作為優選，步驟3)的培養過程中，空氣飽和度為40～60％，pH值為7.1～7.4。

作為優選，步驟3)和步驟4)所述補料的成分為葡萄糖和穀氨醯胺的50～70倍濃縮液，流加的速率為3～5ml/18h。

作為優選，步驟4)中所述攪拌的轉速為60～80r/min。

作為優選，步驟4)的培養過程中，空氣飽和度為70～90％，pH值為7.1～7.4。

作為優選，步驟2)中所述靜置的時間為2～3h。

作為優選，步驟4)中靜置吸附的時間為1～3h。

作為優選，步驟1)中所述PBS緩衝液的pH值為7.0～7.2。

作為優選，步驟3)所述的乙型腦炎病毒是SA14-14-2株。

本發明提供了一種乙型腦炎病毒懸浮培養方法，該技術方案依託於動物細胞的微載體培養技術展開。由於微載體為單層貼壁細胞的生長繁殖提供了更大的表面積，因此為細胞生長提供了一個均質的懸浮培養系統，利用微載體作為細胞定殖的物理支撐，再結合優化的培養條件，從而提高了細胞及病毒的培養密度。

本發明實現了乙型腦炎病毒的規模化培養，提供大量的優質病毒抗原。同時，本發明克服了傳統轉瓶培養動物原代細胞生產的單批產量不高、批間差異大、產品質量不穩定、生產成本和汙染機率高等缺陷。此外，本發明能連續培養、佔地小、生產規模大、對細胞傷害小，克服了傳統工藝佔地空間大，培養不連續，生產成本高等缺點。

具體實施方式

以下將對本發明的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節，在以下實施例中對屬於公知的結構或功能將不進行詳細描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。

以下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值；以下實施例中的％，如無特別說明，均為質量百分含量。

本發明實施例中優先使用攪拌式微載體懸浮培養生物反應器，其它微載體懸浮培養生物反應器，如：潮汐式、旋轉式或灌注式微載體懸浮培養生物反應器，均可以使用。

本發明使用攪拌式微載體懸浮培養生物反應器，易於控制和規模放大，具有良好流體混合能力和氧氣輸送能力，保證了培養過程中培養基和溶解氧的供應，滿足GMP生產要求，適合病毒的規模化增殖培養。

實施例1

(1)微載體製備：取60g微載體cytodex1加入生物反應器，以200ml/g比例加入PBS(pH值7.0)浸泡2.5h，去掉PBS，重新加入PBS，10r/min攪拌，浸泡2h，棄去PBS。

以100ml/g比例加入PBS，121℃，高壓30min，冷卻後棄去PBS，以培養基洗滌2遍，加入新鮮培養基，冷卻至8℃，平衡10h，備用。

(2)滅菌微載體平衡至28℃，補充培養基，微載體濃度為2g/L；將Vero細胞以5×105cell/L比例接種，45r/min攪拌混勻，靜置2h，重複2次，使細胞充分分布。

(3)細胞和微載體混合後，調節溫度37℃，45r/min攪拌，以50％空氣飽和度和控制pH值7.2進行培養，36h後流加葡萄糖和穀氨醯胺補料(50倍濃縮液)，流加速率為5ml/18h。培養80h接種病毒(SA14-14-2株)。

(4)以0.3病毒感染複數(M.O.I.)接種病毒，37℃靜置吸附3h，調節轉速為85r/min，75％空氣飽和度和控制pH值7.2進行培養，16h後流加葡萄糖和穀氨醯胺補料(50倍濃縮液)，60h後收穫病毒。根據Reed-Muench法計算病毒TCID50，每1.0ml含病毒＞107.9TCID50。

實施例2

(1)微載體製備：取90g微載體cytodex1加入生物反應器，以300ml/g比例加入PBS(pH值7.2)浸泡2h，去掉PBS，重新加入PBS，15r/min攪拌，浸泡1h，棄去PBS。

以150ml/g比例加入PBS，121℃，高壓30min，冷卻後棄去PBS，以培養基洗滌3遍，加入新鮮培養基，冷卻至6℃，平衡12h，備用。

(2)滅菌微載體平衡至25℃，補充培養基，微載體濃度為3g/L；將Vero細胞以7×105cell/L比例接種，50r/min攪拌混勻，靜置2.5h，重複3次，使細胞充分分布。

(3)細胞和微載體混合後，調節溫度37℃，55r/min攪拌，以48％空氣飽和度和控制pH值7.4進行培養，40h後流加葡萄糖和穀氨醯胺補料(70倍濃縮液)，流加速率為3ml/18h。培養90h接種病毒(SA14-14-2株)。

(4)以0.5病毒感染複數(M.O.I.)接種病毒，37℃靜置吸附2.5h，調節轉速為100r/min，90％空氣飽和度和控制pH值7.4進行培養，20h後流加葡萄糖和穀氨醯胺補料(70倍濃縮液)，70h後收穫病毒。根據Reed-Muench法計算病毒TCID50，每1.0ml含病毒＞107.7TCID50。

實施例3

(1)微載體製備：取75g微載體cytodex1加入生物反應器，以250ml/g比例加入PBS(pH值7.2)浸泡3h，去掉PBS，重新加入PBS，12r/min攪拌，浸泡1.5h，棄去PBS。

以130ml/g比例加入PBS，121℃，高壓30min，冷卻後棄去PBS，以培養基洗滌3遍，加入新鮮培養基，冷卻至4℃，平衡12h，備用。

(2)滅菌微載體平衡至30℃，補充培養基，微載體濃度為2.5g/L；將vero細胞以5.5×105cell/L比例接種，50r/min攪拌混勻，靜置2.5h，重複3次，使細胞充分分布。

(3)細胞和微載體混合後，調節溫度37℃，50r/min攪拌，以50％空氣飽和度和控制pH值7.1進行培養，38h後流加葡萄糖和穀氨醯胺補料(60倍濃縮液)，流加速率為4ml/18h。培養95h接種病毒(SA14-14-2株)。

(4)以0.1病毒感染複數(M.O.I.)接種病毒，37℃靜置吸附2h，調節轉速為90r/min，80％空氣飽和度和控制pH值7.3進行培養，18h後流加葡萄糖和穀氨醯胺補料(60倍濃縮液)，70h後收穫病毒。根據Reed-Muench法計算病毒TCID50，每1.0ml含病毒＞108.2TCID50。

以上對本發明的實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明。凡在本發明的申請範圍內所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。