一步法胚胎玻璃化冷凍保存的製作方法

2023-08-11 16:29:41 1

專利名稱：一步法胚胎玻璃化冷凍保存的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種胚胎生物技術，特別是一種胚胎冷凍保存技術。
1972年Whittingham等首先利用小鼠2～8細胞胚胎冷凍保存(傳統冷凍方法)成功並移植後獲得後代，他們採用二甲基亞碸(Dimethylsulfoxide:DMSO)為主體抗凍保護劑，濃度為1.5Mol/L，使用降溫冷凍儀，以-0.33℃/min的速度降至-30～-35℃，然後再以-1.0℃/min的速度降至-80℃後投入液氮中，整個程序約需3小時。冷凍解凍後胚胎成活率為50～70％。妊娠率為65％，產仔率為48％。
1985年Rall等發明了胚胎玻璃化冷凍方法，他們利用DMSO、乙醯胺(Acetamide)、丙二醇(Propylene glycol)為主體的抗凍保護劑，配製成濃度高達6Mol/L的玻璃化溶液(VS1)，不使用降溫冷凍儀，在室溫下對小鼠2-細胞、8-細胞和桑椹胚進行冷凍保存，該方法需要分三步降溫(22℃下胚胎於25％VS液中平衡15分鐘→4℃下於50％VS液中平衡10分鐘→4℃下於100％VS液中平衡10分鐘)，整個程序需要35分鐘，由於所用抗凍保護劑對胚胎的化學毒性較大，冷凍後胚胎的成活率不穩定(46％～95％)，產仔率較低(22％～38％)。
本發明的目的在於提供一種冷凍時間短；成本低；操作簡單；無冰晶；適用範圍廣；胚胎成活率、移植妊娠率、產仔率高。
為達到上述發明目的，1995年以來，發明者篩選了抗凍保護劑，利用化學毒性較小、滲透較快的乙二醇(Ethylene glycol:EG)為主體抗凍保護劑，並與葡聚糖(Dextran)和海藻糖(Trehalose)組合，研製成和玻璃化溶液，濃度大於7.0Mol/L，在室溫(20～25℃)下，對小鼠桑椹胚～囊胚進行一步法玻璃化冷凍保存。即將胚胎移入含有EDT溶液的塑料細管中平衡0.5或1分鐘直接投入液氮，即快速簡易玻璃化冷凍保存法。
一步法胚胎玻璃化冷凍保存，其特點在於將葡聚糖(Dextran)和海藻糖(Trehalose)用PBS液稀釋成30％和0.5Mol/L濃度的混合液，然後與乙二醇8∶2(或7∶3或6∶4)(v/v)混合後配製成EDT20(或EDT30或EDT40)玻璃化溶液。
在室溫(20～25℃)下，將胚胎移入含有EDT20(或EDT30或EDT40)玻璃化溶液的0.25ml塑料細管中平衡0.5～1分鐘，封口後直接投入液氮中冷凍保存。
將冷凍保存的細管由液氮中取出後直接浸入20～25℃水浴中，約10秒鐘完成解凍程序。
本發明的有益效果在於(1)冷凍時間短改變了傳統方法的時間長，即一個冷凍程序3小時縮短為0.5或1分鐘；(2)成本低、操作簡單傳統方法中使用降溫冷凍儀(約4萬美元/臺)冷凍胚胎。本方法在室溫(20～25℃)下徒手操作；(3)無冰晶傳統冷凍方法有冰晶生成。本方法無冰晶生成，即呈玻璃化狀態，可避免冰晶對胚胎的物理性損傷；(4)適用範圍廣傳統冷凍方法需要在實驗室內進行。本方法不僅在實驗室內，也可在現場操作，特別是在無電和邊遠牧區更為實用；
(5)胚胎成活率、移植妊娠率、產仔率高與傳統的方法相比，本方法冷凍後小鼠胚胎成活率(94～96％)、移植妊娠率(57～75％)和產仔率(52％～66％)，總體水平提高了5～10％。
本發明始於1995年，目的是開發一種操作簡單、速度快、成本低、效率高的哺乳動物胚胎玻璃化冷凍方法。由於傳統的冷凍方法(Whittingham等，1972)操作時間長、效率低，更不適應邊遠牧區的胚胎冷凍保存。而Rall等(1985)發明的胚胎玻璃化冷凍保存方法中利用DMSO、乙醯胺等為主體的抗凍保護劑，配製成的玻璃化溶液對胚胎的化學毒性較強，造成解凍後胚胎成活率小高，且實驗的重複性不佳。根據上述問題，發明人首先對幾種抗凍保護劑進行篩選，通過對胚胎的毒性試驗及胚胎細胞膜的通透性測定，證明乙二醇的化學毒性最小且通透性強，其次是丙三醇、丙二醇、DMSO、乙醯胺。為此，發明者以乙二醇為主體抗凍保護劑，添加大分子物質葡聚糖和產生滲透壓作用的海藻糖配製成EDT液，其濃度大於7.0Mol/l。為避免其對胚胎的化學毒害作用，胚胎經短時間處理(0.5～1分鐘)後，直接投入液氮冷凍保存。這種方法即能使抗凍保護劑乙二醇充分滲透入胚胎細胞內部，又能在冷凍的瞬間形成玻璃化狀態；即降低了抗凍保護劑對胚胎的化學毒性，又克服了對胚胎的物理性損傷。冷凍保存後的小鼠桑椹胚～囊胚的成活率達95％以上，並獲得了較高的移植妊娠率。本方法對其他家畜如兔、牛和綿羊胚胎的冷凍保存也有同樣效果。
下面是本發明的兩個實施例實施例一將葡聚糖(Dextran)和海藻糖(Trehalose)用PBS液稀釋成30％和0.5Mol/L濃度的混合液，然後與乙二醇7∶3(v/v)混合後配製成EDT30玻璃化溶液。
在室溫20℃下，然後將胚胎移入含有EDT30玻璃化溶液的0.25ml塑料細管中平衡0.5～1分鐘，封口後直接投入液氮中冷凍保存。
需要解凍時，將冷凍保存的細管由液氮中取出後直接浸入20℃水浴中，約10秒鐘完成解凍程序。
實施例二將葡聚糖(Dextran)和海藻糖(Trehalose)用PBS液稀釋成30％和0.5Mol/L濃度的混合液，然後與乙二醇6∶4(v/v)混合後配製成EDT40玻璃化溶液。
在室溫25℃下，然後將胚胎移入含有EDT40玻璃化溶液的0.25ml塑料細管中平衡0.5～1分鐘，封口後直接投入液氮中冷凍保存。
需要解凍時，將冷凍保存的細管由液氮中取出後直接浸入25℃水浴中，約10秒鐘完成解凍程序。
權利要求
1.一步法胚胎玻璃化冷凍保存，其特徵在於將葡聚糖(Dextran)和海藻糖(Trehalose)用PBS液稀釋成30％和0.5Mol/L濃度的混合液，然後與乙二醇8∶2(或7∶3或6∶4)(v/v)混合後配製成EDT20(或EDT30或EDT40)玻璃化溶液。在室溫(20～25℃)下，將胚胎移入含有EDT20(或EDT30或EDT40)玻璃化溶液的0.25ml塑料細管中平衡0.5～1分鐘，封口後直接投入液氮中冷凍保存。需要解凍時，將冷凍保存的細管由液氮中取出後直接浸入20～25℃水浴中，約10秒鐘完成解凍程序。
2.如權利要求l所述的一步法胚胎玻璃化冷凍保存，其特徵在於將葡聚糖(Dextran)和海藻糖(Trehalose)用PBS液稀釋成30％和0.5Mol/L濃度的混合液，然後與乙二醇7∶3(v/v)混合後配製成EDT30玻璃化溶液。在室溫20℃下，將胚胎移入含有EDT30玻璃化溶液的0.25ml塑料細管中平衡0.5～1分鐘，封口後直接投入液氮中冷凍保存。需要解凍時，將冷凍保存的細管由液氮中取出後直接浸入20℃水浴中，約10秒鐘完成解凍程序。
3.如權利要求1所述的一步法胚胎玻璃化冷凍保存，其特徵在於將葡聚糖(Dextran)和海藻糖(Trehalose)用PBS液稀釋成30％和0.5Mol/L濃度的混合液，然後與乙二醇6∶4(v/v)混合後配製成EDT40玻璃化溶液。在室溫25℃下，將胚胎移入含有EDT40玻璃化溶液的0.25ml塑料細管中平衡0.5～1分鐘，封口後直接投入液氮中冷凍保存。需要解凍時，將冷凍保存的細管由液氮中取出後直接浸入25℃水浴中，約10秒鐘完成解凍程序。
全文摘要
本發明涉及一種胚胎生物技術,特別是一種胚胎冷凍保存技術。其特點在於:將葡聚糖(Dextran)和海藻糖(Trehalose)用PBS液稀釋成30%和0.5mol/L濃度的混合液,然後與乙二醇8∶2(或7∶3或6∶4)(v/v)混合後配製成EDT20(或EDT30或EDT40)玻璃化溶液。在室溫(20～25℃)下,將胚胎移入含有EDT20(或EDT30或EDT40)玻璃化溶液的0.25ml塑料細管中平衡0.5～1分鐘,封口後直接投入液氮中冷凍保存。將冷凍保存的細管由液氮中取出後直接浸入20～25℃水浴中,約10秒鐘完成解凍程序。
文檔編號A01N1/02GK1322467SQ0010628
公開日2001年11月21日 申請日期2000年5月8日 優先權日2000年5月8日
發明者朱士恩, 曾申明, 左琴, 張忠誠 申請人:朱士恩