一種逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的中藥製劑及其製備方法

2023-07-13 14:12:21

專利名稱：：一種逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的中藥製劑及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及一種逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的中藥製劑及其製備方法，屬於醫藥生物領域。
背景技術：
：腫瘤細胞多藥耐藥是化療失敗的主要原因，也是腫瘤患者死亡的重要因素，腫瘤細胞可通過多種途徑產生多藥耐藥出現化療抗性，這些途徑可以簡要概括為以下幾個方面在細胞膜水平，膜蛋白如P170、MRP、LRP、BCRP等表達升高，加速藥物外排，使細胞中藥物蓄積減少；在細胞漿水平，包括GST、PKC、P450還原酶、輔酶II等多種胞漿內酶活性增強，使細胞解毒功能加大，加速化療藥物的代謝和降解；在細胞核水平，TOPOII發生數量、活性、結構和分布的改變以及DNA修復能力增強，使DNA受損減少；多藥耐藥腫瘤細胞凋亡相關基因甚至還有癌基因的表達水平發生了變化，如Bcl-2、Bcl-xl表達升高等，使化療藥物誘導的腫瘤細胞凋亡減少，產生耐藥性，對化療藥物產生抗性，引起化療失敗，降低臨床化療效果。
發明內容針對上述現有技術，本發明提供了一種用於逆轉腫瘤患者多藥耐藥、提高化療療效的中藥製劑。本發明是通過以下技術方案實現的—種逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的中藥製劑，是由以下重量份的原料藥製成的黃芩苷12份，梔子苷12份。—種逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的中藥製劑的製備方法，步驟如下(1)取黃芩，加水煎煮2次，每次13小時，離心或其他方法濾過(離心或其它常規方法)，合併濾液，濃縮濾液，用鹽酸調pH值至1.82.0，6(TC保溫30分鐘，冷卻至室溫，放置12小時，濾過，殘渣用乙醇洗至pH值4.0，然後向殘渣中加10倍量(按體積)水攪拌均勻，用氫氧化鈉溶液調pH值至7.0，溶解後加等量乙醇(按體積)攪勻，放置12小時，濾過，濾液用鹽酸調pH值至1.82.0，8(TC保溫30分鐘，冷卻至室溫，濾過，殘渣用乙醇洗至pH值4.0，真空乾燥，粉碎成細粉，即得96.09%以上純度的黃芩苷；(2)取梔子，加5倍量(5倍量是指梔子重量)80%的乙醇回流提取兩次，每次23小時，濾過，合併提取液；回收乙醇得濃縮液；濃縮液依次用石油醚和正丁醇萃取；正丁醇部位濃縮得浸膏；將正丁醇部位拌樣、上矽膠柱，用氯仿_甲醇進行梯度洗脫，在氯仿-甲醇(100:7)時，出現大量粉末，氯仿-甲醇重結晶，即得白色針狀結晶，即為梔子苷，純度99%以上;(3)取上述製備的黃芩苷、梔子苷，混合，加水溶解，製成合劑；或取上述製備的黃芩苷、梔子苷，混合，加水溶解，然後加入澱粉或糊精，加熱濃縮或噴霧乾燥後加入澱粉制粒，製成顆粒劑或膠囊劑。所述步驟(1)中，濃縮濾液至生藥量體積的1/10。所述步驟(1)中，鹽酸的濃度為2mol/L;氫氧化鈉溶液的濃度為20%(質量/體積)。服用時，每日兩次，每次服用量為顆粒劑1.5g，膠囊劑12粒(每粒0.35克)。腫瘤細胞可通過多種途徑產生多藥耐藥出現化療抗性，這些途徑可以簡要概括為以下幾個方面在細胞膜水平，膜蛋白如P170、MRP、LRP、BCRP等表達升高，加速藥物外排，使細胞中藥物蓄積減少；在細胞漿水平，包括GST、PKC、P450還原酶、輔酶II等多種胞漿內酶活性增強，使細胞解毒功能加大，加速化療藥物的代謝和降解；在細胞核水平，TOPOII發生數量、活性、結構和分布的改變以及DNA修復能力增強，使DNA受損減少；多藥耐藥腫瘤細胞凋亡相關基因甚至還有癌基因的表達水平發生了變化，如Bcl-2、Bcl-xl表達升高等，使化療藥物誘導的腫瘤細胞凋亡減少，產生耐藥性。國內學者從90年代開始開展中藥逆轉腫瘤耐藥的研究，體外實驗已證實青蒿素、補骨脂素、薑黃素、貝母鹼、苦參鹼、川芎嗪、大黃酸、三氧化二砷(As203)、桂皮醛、大豆甙元、金雀黃素、薯蕷皂苷、粉防己鹼等中藥組分和中藥複方對HL60/HT、K562/ADM、SGC7901/ADR、KBv200、K562/A02等人耐藥腫瘤細胞的多藥抗性具有逆轉作用；體內實驗證實粉防己鹼、苦參鹼明顯降低化療誘導的小鼠耐藥腫瘤細胞P170的表達率；蟾酥素靈、雄黃等藥物均可抑制HL-60/ADR細胞生長，逆轉耐藥性，促進細胞凋亡，其機制可能與下調P170和TopoII過度表達有關。本申請的發明人做了大量的實驗研究，研究結果表明本發明的黃芩苷l-2份，梔子苷l-2份中藥製劑具有明顯降低化療誘導的小鼠耐藥S，腫瘤細胞P170的表達率，其機制可能與下調P170和TopoII過度表達有關；抑制K562/A匿耐藥腫瘤細胞細胞生長，逆轉耐藥性，促進細胞凋亡。具體實施例方式下面結合實施例數據對本發明作進一步的說明實施例1:逆轉腫瘤患者多藥耐藥、提高化療療效的中藥製劑所需原料如下黃芩500g、梔子500g。製備工藝為1)分別將黃芩、梔子粉碎；2)取黃芩500g，加水煎煮2次，每次1.5小時，濾過，合併濾液，濾液濃縮至適量(與生藥量之比IO:1)，用2mol/L鹽酸溶液調pH值至1.82.0，6(TC保溫30分鐘，冷卻至室溫，放置12小時，濾過，殘渣用乙醇洗至pH值4.O，加IO倍量水攪拌均勻，用20%氫氧化鈉溶液調pH值至7.O，溶解後加等量乙醇攪勻，放置12小時，濾過，濾液用2mol/L鹽酸溶液調pH值至1.82.0，8(TC保溫30分鐘，冷卻至室溫，濾過，殘渣用乙醇洗至pH值4.0，真空乾燥，粉碎成細粉，即得96.09%以上純度的黃芩苷(96.09-98.15);3)將梔子500g用5倍量80X的乙醇回流提取兩次，每次2小時，濾過，合併提取液。回收乙醇得濃縮液。濃縮液依次用石油醚和正丁醇萃取。正丁醇部位濃縮得浸膏。將正丁醇部位拌樣、上矽膠柱，用氯仿-甲醇進行梯度洗脫，在氯仿-甲醇(100:7)時，出現大量粉末，氯仿-甲醇重結晶，即得白色針狀結晶的99%梔子苷(99.70-99.73)(所分離的白色結晶與京尼平苷對照品進行薄層檢測和共熔點測定，薄層顯示同一位置的斑點，熔點未發生變化，熔點為16716『C，確定該化合物結構為梔子苷)；4)黃芩苷1-2份，梔子苷1-2份加入適量澱粉或糊精製粒，製成顆粒劑或膠囊劑。試驗數據小鼠S180細胞腫瘤耐藥模型的建立及小鼠分組腹水型S18。小鼠經模擬化療PFC方案，順鉑3mg/kgip，每周一次；環磷醯胺和5-FU各3mg/kg'ig，每日一次，連續四周，(兩周時一對一傳代一次)。獲得耐藥小鼠S湖模型，無菌抽取化療誘導4周的耐藥小鼠S18。腹水，無菌NS稀釋至含細胞數1X107ml，每鼠0.2mlip接種。小鼠接種耐藥S18。細胞後24h，隨機分為對照組、本方顆粒100mg/kg、50mg/kg組，每組14隻，對照組為水0.2ml/10gig，本方顆粒100mg/kg和50mg/kg組分別給予0.5%、0.25%的顆粒混懸液0.2ml/10g'ig，連續10天，於末次給藥24h後，無菌抽出腹水，肝素抗凝，4PBS液洗滌，1500rpm離心5min，共3次，後70%乙醇固定，4。C保存，2.2MDR1表達產物P170、TOPOII、LRP表達的檢測方法取70%乙醇固定的小鼠S18。細胞，由4PBS液稀釋後，1500rpm離心5min，再次洗脫一次，並調整細胞濃度為1X106/ml，搖勻，取細胞懸液500iil，加入各自相對應的異硫氫酸螢光素標記的鼠抗人的單克隆抗體IgGl工作液20iU，另各取一支陰性對照抗IgGl-FITC，37t:避光反應20min後，由流式細胞儀螢光檢測。儀器的檢測變異係數<2%，測定1萬個細胞的上述5種相關生物分子的表達，激發光波長均為488nm。1.試驗結果3.1對化療誘導的多藥耐藥腹水型小鼠S18。肉瘤細胞MDR1表達產物P17。(P_糖蛋白、P-gp)過度表達的逆轉作用取70X乙醇固定的各鼠多藥耐藥S，腫瘤細胞，由ra7.4PBS液，以1500rpm離心5min再次洗滌，並配成細胞濃度為1X106/ml懸液，由螢光P17。單克隆抗體IgGl標記避光30min，由流式細胞儀測定各鼠S18。細胞螢光強度，統計分析各組小鼠S18。腫瘤細胞P17。表達率，如表1。表1對化療誘導的多藥耐藥小鼠S180細胞P17。過度表達的逆轉作用文士Stableseeoriginaldocumentpage5注抑制率(％)=(對照組_給藥組)+對照組X100%。試驗結果提示誘導4周的和再傳代10天後對照組小鼠S18。腫瘤細胞腫瘤多藥耐藥相關基因P17。表達無顯著性差異，說明誘導後的耐藥小鼠S18。細胞的基因表達較為穩定。黃連解毒湯總鹼明顯逆轉對耐藥小鼠S18。細胞耐藥基因P17。過度表達。說明黃連解毒湯總鹼逆轉化療誘導的多藥耐藥細胞耐藥基因P17。表達是其逆轉腫瘤多藥耐藥的重要途徑之3.2逆轉多藥耐藥小鼠S，細胞肺耐藥蛋白LRP過度表達各組小鼠耐藥S18。細胞測試前處理如3.1，細胞經避光反應30min，與螢光單克隆IgGl結合，流式細胞儀檢測結果如表2。表2黃連解毒湯醇提物對小鼠耐藥S18。細胞LRP過度表達的影響文士S組別劑量(mg/kg)nLRP表達率抑制率(％)對照組1167.65±25.42本方顆粒100106.86±3.39***89.86本方顆粒501010.76±6.28***84.09注與誘導後傳代對照組比較"***P<0.001;"&"與化療誘導四周後比較；抑瘤率(％)=(對照組_給藥組)+對照組X100%。試驗結果提示經化療誘導4周後傳代IO天的小鼠耐藥S，腫瘤細胞LRP表達率與誘導4周比較無明顯變化，而給予黃連解毒湯總鹼明顯逆轉了耐藥S18。腫瘤細胞LRP的過度表達，說明生物鹼具有逆轉耐藥腫瘤細胞LRP過度表達的作用，這可能是生物鹼逆轉多藥耐藥的機制之一。3.3逆轉小鼠S180耐藥細胞DNA拓撲異構酶TOPOII表達各組小鼠S18。耐藥細胞前處理如3.l，測試前室溫避光反應30min，螢光單克隆抗體IgGl結合20min，測定結果如表3。表3對小鼠S180耐藥細胞TOPOII表達的影響又士S組別劑量(mg/kg)NTOPOII表達率抑制率(％)對照組1124,45±14,35本方顆粒100106.18±3.78***74。72本方顆粒50108.58±4.10***64,91注與誘導傳代後對照組比較"***"P<0.001;"&"與化療誘導四周比較；抑瘤率(％)=(對照組_給藥組)+對照組X100%。3.4對小鼠化療誘導耐藥S18。細胞凋亡的影響取70%乙醇固定的各鼠多藥耐藥S18。腫瘤細胞，由4PBS液，以1500rpm離心5min再次洗滌，並配成細胞濃度為1X106/ml懸液，取含細胞1X107ml的細胞懸液500iil，加於PI工作液500iU(濃度為10yg/ml)，避光室溫放置30min後，由流式細胞儀螢光測定激發光為351nm，各組細胞凋亡率如表1。表l對化療誘導小鼠耐藥S，細胞凋亡的影響文士SDtableseeoriginaldocumentpage7權利要求一種逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的中藥製劑，其特徵在於，是由以下重量份的原料藥製成的黃芩苷1～2份，梔子苷1～2份。2.權利要求1所述的一種逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的中藥製劑的製備方法，其特徵在於步驟如下(1)取黃芩，加水煎煮2次，每次13小時，濾過，合併濾液，濃縮濾液，用鹽酸調pH值至1.82.0，6(TC保溫30分鐘，冷卻至室溫，放置12小時，濾過，殘渣用乙醇洗至pH值4.O，然後向殘渣中加10倍量水攪拌均勻，用氫氧化鈉溶液調pH值至7.O，溶解後加等量乙醇攪勻，放置12小時，濾過，濾液用鹽酸調pH值至1.82.0，8(TC保溫30分鐘，冷卻至室溫，濾過，殘渣用乙醇洗至pH值4.0，真空乾燥，粉碎成細粉，即得黃芩苷；(2)取梔子，加5倍量80%的乙醇回流提取兩次，每次23小時，濾過，合併提取液；回收乙醇得濃縮液；濃縮液依次用石油醚和正丁醇萃取；正丁醇部位濃縮得浸膏；將正丁醇部位拌樣、上矽膠柱，用氯仿-甲醇進行梯度洗脫，在氯仿-甲醇(100:7)時，出現大量粉末，氯仿_甲醇重結晶，即得白色針狀結晶，即為梔子苷；(3)取上述製備的黃芩苷、梔子苷，混合，加水溶解，製成合劑；或取上述製備的黃芩苷、梔子苷，混合，加水溶解，然後加入澱粉或糊精，加熱濃縮或噴霧乾燥後加入澱粉制粒，製成顆粒劑或膠囊劑。3.根據權利要求1所述的一種逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的中藥製劑的製備方法，其特徵在於所述步驟(1)中，濃縮濾液至生藥量體積的1/10。4.根據權利要求1所述的一種逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的中藥製劑的製備方法，其特徵在於所述步驟(1)中，鹽酸的濃度為2mol/L;氫氧化鈉溶液的濃度為20%。全文摘要本發明公開了一種逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的中藥製劑，是由以下重量份的原料藥製成的黃芩苷1～2份，梔子苷1～2份。製備方法為先製備黃芩苷和梔子苷嗎，然後取黃芩苷、梔子苷，混合，加水溶解，製成合劑；或取黃芩苷、梔子苷，混合，加水溶解，然後加入澱粉或糊精，加熱濃縮或噴霧乾燥後加入澱粉制粒，製成顆粒劑或膠囊劑。本申請的發明人做了大量的實驗研究，研究結果表明本發明的黃芩苷1-2份，梔子苷1-2份中藥製劑具有明顯降低化療誘導的小鼠耐藥S180腫瘤細胞P170的表達率，其機制可能與下調P170和TopoII過度表達有關；抑制K562/ADM耐藥腫瘤細胞細胞生長，逆轉耐藥性，促進細胞凋亡。文檔編號A61K31/7048GK101744832SQ201010011448公開日2010年6月23日申請日期2010年1月14日優先權日2010年1月14日發明者喬高娟,孫付軍,李貴海,董學,陸永輝申請人:山東省中醫藥研究院