高純度溶血磷脂醯膽鹼的製備方法
2023-07-30 20:57:36 1
高純度溶血磷脂醯膽鹼的製備方法
【專利摘要】本發明公開一種製備溶血磷脂醯膽鹼的方法，該方法包括在鈣離子溶液中，先加入磷脂醯膽鹼與膽酸鹽攪拌後，再加入磷脂酶A2保溫進行水解反應得到溶血磷脂醯膽鹼，丙酮沉澱將產品分離出。本發明加入膽酸鹽，使磷脂醯膽鹼乳滴變小、變細，反應溶液變稀，使反應物在5小時左右水解完全，能明顯縮短反應時間，其中在磷脂醯膽鹼濃度高達30-40%，其轉化成溶血磷脂醯膽鹼的效率仍能達到100%。此外，本法副產物如甘油磷醯膽鹼和未水解的磷脂醯膽鹼相比現有技術顯著減少。本發明生產的溶血磷脂醯膽鹼純度高，可以省去多次的純化步驟，進而可以縮短生產周期並能大幅降低生成本。
【專利說明】高純度溶血磷脂醯膽鹼的製備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種高純度溶血磷脂醯膽鹼的製備方法，尤其涉及一種以卵磷脂為原 料製備高純度溶血磷脂醯膽鹼的方法。
【背景技術】
[0002] 溶血磷脂醯膽鹼是卵磷脂的代謝產物，亦稱溶血卵磷脂，在食品工業及化妝品工 業中可以作為食品添加劑及乳化劑使用，高純度的溶血磷脂醯膽鹼在藥學上可以作為藥物 中間體用，是一類安全無毒的藥物載體。例如在專利CN100536851中作為丙戊酸的載體，其 結合物可以作為一類優良的抗癲癇藥物使用，其製備通常利用磷脂酶A2促進磷脂醯膽鹼 的水解來生產溶血磷脂醯膽鹼。
[0003] 早在二十世紀初人們就已經知道磷脂醯膽鹼可以藉助酶促水解轉化成溶血磷脂 醯膽鹼。1935年Hughes用實驗證明卵磷脂轉化成溶血卵磷脂(溶血磷脂醯膽鹼）的單分子 膜水解與諸如pH值、溫度和卵磷脂分子的表面濃度等因素有關。Hanahan證明在雞蛋卵磷 脂與磷脂酶A2之間的醚溶性絡合物導致釋放不飽和脂肪酸和溶血磷脂醯膽鹼。1963年， Dawson也發現了磷脂酶A2將磷脂醯膽鹼水解成溶血磷脂醯膽鹼和脂肪酸分子，並確定酶 的活性與鈣離子存在與否有關，並且添加丁醇將激發磷脂酶的活性。英國專利GB1215868 介紹了進一步改進方案，即在有脂肪(油)存在的條件下進行有磷脂酶A2參與的磷脂的水解 反應。中國專利CN1210560通過加入單酸甘油酯以期改進水解效果，但是由於反應溫度過 高、反應時間過長，致使反應物中副產物仍然很多，並且單酸甘油酯加入量非常大，是磷脂 醯膽鹼的5倍量)，成本很高。
[0004] 現有技術揭示的磷脂醯膽鹼水解方法依然存在一些缺點，如產品純度低，磷脂醯 膽鹼原始物質的轉化效率不超60-70%，甘油磷醯膽鹼和未水解的磷脂醯膽鹼等副產物高， 特別是高濃度(濃度為30-40%)的磷脂醯膽鹼水解時，由於濃度高，反應物粘稠，需要長達 96小時的反應時間，轉化為溶血磷脂醯膽鹼的效率更低，副產物的產生比例更高，為了得到 高純度的終產物需要多次純化去除副產物，從而限制了其工業化生產。
[0005] 由於現有技術上的缺陷，所以需要提出更有效的將磷脂醯膽鹼轉化成溶血磷脂醯 膽鹼的方法，以得到高純度的可藥用的溶血磷脂醯膽鹼。
【發明內容】
：
[0006] 本發明的目的是提供一種溶血磷脂醯膽鹼的製備方法。
[0007] 本發明的目的通過以下技術方案實現：
[0008] -種製備溶血磷脂醯膽鹼的方法，該方法包括在鈣離子溶液中，先加入磷脂醯膽 鹼與膽酸鹽攪拌後，再加入磷脂酶A2保溫進行水解反應得到溶血磷脂醯膽鹼。
[0009] 上述製備溶血磷脂醯膽鹼的方法中，所述水解反應得到的反應混合物通過丙酮沉 澱將溶血磷脂醯膽鹼分離出。
[0010] 上述製備溶血磷脂醯膽鹼的方法中，所述的膽酸鹽選自膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、牛黃 膽酸鈉、牛黃脫氧膽酸鈉中的一種或幾種。優選為膽酸鈉。所述的鈣離子溶液為CaCl2A 溶液。所述CaCl2水溶液的濃度為0. 1~0. 4mol/L，優選0. 1~0. 2 mol/L。所述的膽酸鹽與 磷脂醯膽鹼的摩爾比為〇. 〇5?1 :1，優選0. f 0. 3 :1。
[0011] 上述製備溶血磷脂醯膽鹼的方法中，所述磷脂酶A2加入前反應體系的起始pH值 7?9,優選疒8。再加入磷脂酶A2保持一定溫度進行水解反應，磷脂酶A2的使用量通常為 100g 憐脂醜膽喊（卵憐脂）加入 1 ?2ml 酶液（Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark)。加完磷脂酶A2後將反應混合物升溫至4(T80°C的溫度，優選大約5(T60°C，並將 混合物再攪拌一定時間進行水解反應，如:T6h，優選4~5h，然後使用丙酮沉澱分離溶血磷 脂醯膽鹼。
[0012] 上述製備溶血磷脂醯膽鹼的方法中，所述保溫的溫度為4(T80°C，溫度優選 5(T60°C。所述水解反應的時間為:T6h，優選4?5h。
[0013] 本發明所述的室溫為本領域技術人員所公知的25±5°C。本發明所涉及的原料除 特別說明外均可以通過市場購買獲得。
[0014] 本發明的有益效果：
[0015] 本發明加入膽酸鹽，使磷脂醯膽鹼乳滴變小、變細，反應溶液變稀，加快反應速度， 使反應物在5小時內水解完全，顯著縮短了反應時間，即使磷脂醯膽鹼在溶液中的濃度高 達3(Γ40% (重量比)，其轉化成溶血磷脂醯膽鹼的效率仍能達到100%。此外，本法副產物如 甘油磷醯膽鹼(二個脂肪酸完全水解下來的副產物）和未水解的磷脂醯膽鹼相比現有技術 顯著減少。本發明生產的溶血磷脂醯膽鹼純度高，可以省去多次的純化步驟，進而可以縮短 生產周期並能大幅降低生成本。本方法得到的產物，氫化後產品性質更加穩定，易於儲存， 更加適合藥用或應用於食品工業。
【具體實施方式】
[0016] 下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實 施例範圍之中。
[0017] 磷脂醯膽鹼購自上海太偉藥業，分子量785 ;磷脂酶Α2購自丹麥諾和諾德製藥公 司，膽酸鈉購自國藥集團化學試劑公司。
[0018] 實施例1
[0019] 配有氮氣保護裝置的1000ml反應瓶中加入116ml 0. lmol/L CaCljjC溶液，50g磷 脂醯膽鹼，6g膽酸鈉，劇烈攪拌30min，使其分散均勻，通過加入4mol/L NaOH溶液控制體系 初始 pH 值 7,加入 lml 憐脂酶 A2(Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark)， 升溫至50°C攪拌5h，冷卻至室溫，慢慢加入2L丙酮，析出固體，傾出上層清液，固體再以1L 丙酮分三次攪拌洗滌，分散成粉末狀，抽濾，40°C真空乾燥，得25g粉末狀溶血磷脂醯膽鹼， 純度99. 2%。
[0020] 實施例2
[0021] 配有氮氣保護裝置的1000ml反應瓶中加入75ml 0.2mol/L CaClyjC溶液，50g 磷脂醯膽鹼，8. 22g膽酸鈉，劇烈攪拌30min，使其分散均勻，通過加入4mol/LNaOH溶液控 制體系初始 pH 值 8,加入 lml 憐脂酶 A2 (Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark),升溫至5(TC攪拌5h,冷卻至室溫，慢慢加入2L丙酮，析出固體，傾出上層清液，固 體再以1L丙酮分三次攪拌洗滌，分散成粉末狀，抽濾，40°C真空乾燥，得26. 7g粉末狀溶血 磷脂醯膽鹼，純度98. 7%。
[0022] 實施例3
[0023] 配有氮氣保護裝置的1000ml反應瓶中加入70ml 0. 4mol/L CaCl2水溶液，50g 磷脂醯膽鹼，5. 48g膽酸鈉，劇烈攪拌30min，使其分散均勻，通過加入4mol/LNaOH溶液控 制體系初始 pH 值 7,加入 lml 憐脂酶 A2 (Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark),升溫至6(TC攪拌4h,冷卻至室溫，慢慢加入2L丙酮，析出固體，傾出上層清液，固 體再以1L丙酮分三次攪拌洗滌，分散成粉末狀，抽濾，40°C真空乾燥，得26g粉末狀溶血磷 脂醯膽鹼，純度99. 1%。
[0024] 實施例4
[0025] 配有氮氣保護裝置的1000ml反應瓶中加入75ml 0.3mol/L CaClyjC溶液，50g 磷脂醯膽鹼，1. 37g膽酸鈉，劇烈攪拌30min，使其分散均勻，通過加入4mol/LNaOH溶液控 制體系初始 pH 值 9,加入 lml 憐脂酶 A2 (Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark),升溫至8(TC攪拌3h,冷卻至室溫，慢慢加入2L丙酮，析出固體，傾出上層清液，固 體再以1L丙酮分三次攪拌洗滌，分散成粉末狀，抽濾，40°C真空乾燥，得25. 3g粉末狀溶血 磷脂醯膽鹼，純度99. 2%。
[0026] 實施例5
[0027] 配有氮氣保護裝置的1000ml反應瓶中加入116ml 0· lmol/L CaClyjC溶液，50g 磷脂醯膽鹼，2. 74g膽酸鈉，劇烈攪拌30min，使其分散均勻，通過加入4mol/LNaOH溶液控 制體系初始 pH 值 7,加入 lml 憐脂酶 A2 (Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark)，升溫至40?攪拌6h，冷卻至室溫，慢慢加入2L丙酮，析出固體，傾出上層清液，固 體再以1L丙酮分三次攪拌洗滌，分散成粉末狀，抽濾，40°C真空乾燥，得24. 8g粉末狀溶血 磷脂醯膽鹼，純度為99. 3%。
[0028] 實施例6
[0029] 配有氮氣保護裝置的1000ml反應瓶中加入90ml0. 2mol/L CaCl2水溶液，50g磷 脂醯膽鹼，2. 64g脫氧膽酸鈉，劇烈攪拌30min，使其分散均勻，通過加入4mol/LNaOH溶液 控制體系初始 pH 值 7,加入 lml 憐脂酶 A2 (Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark),升溫至5(TC攪拌5h,冷卻至室溫，慢慢加入2L丙酮，析出固體，傾出上層清液，固 體再以1L丙酮分三次攪拌洗滌，分散成粉末狀，抽濾，40°C真空乾燥，得26. 7g粉末狀溶血 磷脂醯膽鹼，純度為98. 9%。
[0030] 實施例7
[0031] 配有氮氣保護裝置的1000ml反應瓶中加入90ml 0· 2mol/L CaCl2水溶液，50g磷 脂醯膽鹼，10. 27g牛黃膽酸鈉，劇烈攪拌50min，使其分散均勻，通過加入4mol/LNaOH溶液 控制體系初始 pH 值 8,加入 lml 憐脂酶 A2 (Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark)，升溫至60?攪拌4h，冷卻至室溫，慢慢加入2L丙酮，析出固體，傾出上層清液，固 體再以1L丙酮分三次攪拌洗滌，分散成粉末狀，抽濾，40°C真空乾燥，得25. 4g粉末狀溶血 磷脂醯膽鹼，純度為98.6%。
[0032] 實施例8
[0033] 配有氮氣保護裝置的1000ml反應瓶中加入90ml 0· 2mol/L CaCl2水溶液，50g磷 脂醯膽鹼，6. 65g牛黃脫氧膽酸鈉，劇烈攪拌40min，使其分散均勻，通過加入4mol/LNaOH溶 液控制體系初始 pH 值 7,加入 lml 憐脂酶 A2(Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark)，升溫至60?攪拌4h，冷卻至室溫，慢慢加入2L丙酮，析出固體，傾出上層清液，固 體再以1L丙酮分三次攪拌洗滌，分散成粉末狀，抽濾，40°C真空乾燥，得26. 0g粉末狀溶血 磷脂醯膽鹼，純度為98. 8%。
[0034] 實施例9
[0035] 氫化釜中加入10g上述實施例製備的溶血磷脂醯膽鹼，160ml二氯甲烷/95%乙醇 溶液（V二氯甲烷：V95%乙醇=3:1)攪拌溶解，加入0. 5g 10%Pd/C，密封后，以氮氣，氫氣置 換氣體3次，充入氫氣，保持0. 5MPa，50°C反應5h。排空後，取出反應液，抽濾，濾液濃縮幹， 加入15ml無水乙醇溶解，室溫下滴加150ml丙酮，析出白色固體，冷卻至0°C攪拌2h，抽濾， 40°C真空乾燥，得9. 3g白色粉末，純度99. 5%。
[0036] 實施例10
[0037] 70ml 0.4mol/L CaCljK溶液，50g磷脂醯膽鹼，不同量的膽酸鈉，劇烈攪拌30min， 使其分散均勻，通過加入4mol/LNaOH溶液控制體系初始pH值7,加入lml磷脂酶A2 (Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark)，保持 50°C進行水解反應，轉化為 溶血磷脂醯膽鹼的百分比(見表1)。
[0038] 其通過HPLC法測定轉化率：利用高效液相色譜測定酶解反應前後反應體系中磷 脂醯膽鹼的含量來計算溶血磷脂醯膽鹼的轉化率。柱條件：nova-pak@silica柱長15cm，柱 徑3. 9_，柱壓280psi，流速0. 4ml/min。檢測波長204mm。流動相：乙腈：甲醇：水=65 : 2 : 14 (v:v:v)〇
[0039]
【權利要求】
1. 一種製備溶血磷脂醯膽鹼的方法，其特徵在於該方法包括在鈣離子溶液中，先加入 磷脂醯膽鹼與膽酸鹽攪拌後，再加入磷脂酶A2保溫進行水解反應得到溶血磷脂醯膽鹼。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述水解反應得到的反應混合物通過丙酮 沉澱將溶血磷脂醯膽鹼分離出。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的膽酸鹽選自膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、牛 黃膽酸鈉、牛黃脫氧膽酸鈉中的一種或幾種。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述的膽酸鹽是膽酸鈉。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的鈣離子溶液為CaCl2水溶液。
6. 根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述CaCl2水溶液的濃度為0. 1~0. 4mol/ L，優選 0· 1 ?0· 2 mol/L。
7. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的膽酸鹽與磷脂醯膽鹼的摩爾比為 0· 05?1 :1，優選 0· 1 ?0· 3 :1。
8. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述磷脂酶A2加入前反應體系的起始pH 值疒9,優選疒8。
9. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述保溫的溫度為4(T80°C，溫度優選 50?60。。。
10. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述水解反應的時間為:T6h，優選4~5h。
【文檔編號】C12P13/00GK104250658SQ201310261747
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年6月26日 優先權日:2013年6月26日
【發明者】馬彥琴, 王勇, 周英珍 申請人:江蘇恩華藥業股份有限公司