鹿茸組織細胞培養方法
2023-07-30 21:56:01
專利名稱:鹿茸組織細胞培養方法
本發明屬於鹿茸組織細胞培養方法。
直到提出本發明為止，與本發明相近的研究是Morrism Bubenik G.A.對激素與生茸關係的研究[CA10045542C(1984)]。該研究只是在鹿體上探明了雄激素對茸骨成熟和骨化作用，並未涉及鹿茸組織細胞在離體條件下的培養方法。
本發明的目的是將鹿茸組織細胞移植於培養瓶中，在離體條件下，賦予人工生長環境，建立完善的鹿茸組織細胞培養技術，使鹿茸組織細胞繁延於培養瓶中，獲得試管型鹿茸細胞。
本發明的特徵是採取鹿茸增生帶組織細胞，經過細胞分散處理，接入G-1或者G-2培養液中，在36-38℃條件下，培養成試管型鹿茸細胞。
鹿茸增生帶組織細胞由未分化的間充質、前成軟骨細胞和成軟骨細胞三層組成。本發明選擇未分化的間充質或者前成軟骨細胞做為基礎材料。
經細胞培養得到的液體，含有大量鹿茸細胞，該種鹿茸細胞具有良好的分裂增殖能力，稱為人工離體培養鹿茸的試管型前成軟骨細胞。這種試管型前成軟骨細胞，經若干次分裂後，可圓縮分化為其性質相當於鹿茸「臘片」部位組織的試管型前成軟骨細胞。因此，其藥用價值超過一般鹿茸。此外，本發明無論對採自鹿體的二槓茸、初角茸、去勢茸和畸形茸，均能培養出試管型鹿茸細胞，而且用該技術培養的試管型鹿茸細胞存在著異常強烈的生命力和繁延能力，超過其它哺乳動物的任何組織細胞。
下面按操作過程詳細敘述本發明的培養方法1、材料選取選擇1-5歲的健康鹿鋸茸，在實驗室內進行清洗、消毒，用無菌器開口，剝下茸皮，採取增生帶組織未分化的間充質或者前成軟骨細胞。
2、細胞分散處理細胞分散處理有兩種方法。一種是細胞細碎粒的製備，將採取的鹿茸增生帶組織細胞用兩把尖刃刀，在滴有血清的玻片上，對刃分割鹿茸組織，直到不能分割的細碎粒為止。另一種是細胞懸液的製備，將採取的鹿茸增生帶組織細胞切成小塊，放入搗碎機內，加入1%MEM液，其鹿茸組織塊與1%MEM液比例為1∶3(g/ml)，開機3-5分鐘，停幾分鐘後，再開機，經數次搗細成細胞懸液。
3、培養液的製備本發明所用的培養液有G-1和G-2兩種，可任選一種。G-1培養液由1%MEM液、雙抗、小牛血清組成，其比例範圍為1%MEM液69-96%，雙抗1%，小牛血清3-30%，PH值為6.8-7.3;但G-1培養液的最優配方比為1%MEM液74%、雙抗1%、小牛血清25%，PH值為7.0-7.2。G-2培養液由1%MEM液、雙抗、鹿血清組成，其比例範圍為1%MEM液69-96%、雙抗1%、鹿血清3-30%，PH值為6.8-7.3;但G-2培養液的最優配方比為1%MEM液74%、雙抗1%、鹿血清25%，PH值為7.0-7.2。
4、試管型鹿茸細胞的培養。將經過分散處理的增生帶組織細胞接入G-1或者G-2培養液中，其比例為細胞細碎粒與G-1或G-2培養液1∶50(g/ml);鹿茸細胞懸液與G-1或者G-2培養液1∶25(ml/ml);裝於培養瓶中，蓋好瓶塞，輕輕搖動，放在37℃條件下，培養成試管型鹿茸細胞。
5、細胞傳代試管型鹿茸細胞在G-1或者G-2培養液中生長14-21天後，進行細胞傳代培養，細胞傳代時，先傾出原培養液，用無鈣、鎂去離子液(FCE)洗數次，加ATV消化，再加G-1或者G-2培養液進行分瓶培養。
權利要求
1.一種鹿茸組織細胞的培養方法，其特徵在於取鹿茸增生帶組織細胞，經過細胞分散處理，接入G-1或者G-2培養液中，在36-38℃條件下，培養成試管型鹿茸細胞。
2.根據權利要求
1所述的培養方法，其特徵在於鹿茸增生帶組織細胞，選擇未分化的間充質或者前成軟骨細胞。
3.根據權利要求
1所述的培養方法，其特徵在於細胞分散處理是將採取的增生帶組織細胞，用兩把尖刃刀，在滴有血清的玻片上，對刃分割鹿茸組織，直到不能分割的細碎粒為止，或者將鹿茸組織塊放入搗碎機內，加1%MEM液，其鹿茸組織塊與1%MEM液比例為1∶3，開機3-5分鐘，經數次搗細成細胞懸液。
4.根據權利要求
3所述的培養方法，其特徵在於鹿茸增生帶組織細胞接入G-1或者G-2培養液中，細碎粒與G-1或者G-2培養液比例為1∶50(g/ml)，鹿茸細胞懸液與G-1或者G-2培養液比例為1∶25(ml/ml)，在37℃條件下，置於培養瓶中培養。
5.根據權利要求
1所述的培養方法，其特徵在於G-1培養液由1%MEM液、雙抗、小牛血清組成，其比例為1%MEM液69-96%、雙抗1%、小牛血清3～30%，PH值為6.8-7.3。
6.根據權利要求
5所述的培養方法，其特徵在於G-1培養液由1%MEM液、雙抗、小牛血清組成，其比例為1%MEM液74%、雙抗1%、小牛血清25%，PH值為7.0-7.2。
7.根據權利要求
1所述的培養方法，其特徵在於G-2培養液由1%MEM液、雙抗、鹿血清組成，其比例為1%MEM液69-96%、雙抗1%、鹿血清3-30%，PH值為6.8-7.3。
8.根據權利要求
7所述的培養方法，其特徵在於G-2培養液由1%MEM液、雙抗、鹿血清組成，其比例為1%MEM液74%、雙抗1%、鹿血清25%，PH值為7.0-7.2。
9.根據權利要求
1所述的培養方法，其特徵在於培養而成的試管型鹿茸細胞，在G-1或者G-2培養液中生長14-21天，進行細胞傳代培養。
10.根據權利要求
9所述的培養方法，其特徵在於細胞傳代培養，先傾出原培養液，用無鈣、鎂去離子液(FCE)洗數次，加ATV消化，再加G-1或者G-2培養液，進行分瓶培養。
專利摘要
一種鹿茸組織細胞的培養方法，採取鹿茸增生帶組織細胞，經過細胞分散處理，接入G-1或者G-2培養液中，在36-38℃條件下，培養成試管型鹿茸細胞。該鹿茸細胞具有良好的分裂增殖能力、強烈的生命力和繁延能力，其試管型鹿茸細胞相當於鹿茸「臘片」組織細胞，其藥用價值超過一般鹿茸。該培養方法的試驗成功，為人工大批生產鹿茸組織細胞提供了現實可能。
文檔編號C12N5/02GK86107913SQ86107913
公開日1988年6月8日 申請日期1986年11月20日
發明者高雲, 吳玉林, 王斌, 李春義, 程利平, 趙世珍 申請人:中國農業科學院特產研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan