一種提高乳膠凝集試驗狂犬病中和抗體檢測靈敏度的方法

2023-07-31 00:47:51

專利名稱：一種提高乳膠凝集試驗狂犬病中和抗體檢測靈敏度的方法
技術領域：
本發明為一種提高乳膠凝集試驗狂犬病中和抗體檢測靈敏度的方法，即利用抗犬和人IgG Fe片段單克隆抗體致敏聚苯乙烯微球,分別與等體積犬或人血清感作,再與等體積狂犬病病毒糖蛋白結合，用於檢測人和犬血清狂犬病中和抗體滴度；屬於生物工程技術領域。
背景技術：
犬是我國狂犬病流行的貯存和傳播宿主，人是狂犬病的最主要受害者。因此，提高犬暴露前免疫和人暴露後治療效果，是阻斷狂犬病流行的根本措施。狂犬病中和抗體滴度是衡量機體免疫保護水平的最重要指標。人和動物血清狂犬病中和抗體水平達到0.5 IU/ml以上時，即可獲得完全保護。 目前，用於狂犬病中和抗體定量檢測的標準方法有小鼠腦內中和試驗、蝕斑抑制試驗、快速螢光灶抑制試驗(RFFIT)和螢光抗體病毒中和試驗(FAVN)等，其中RFFIT法和FAVN法分別是WHO和OIE推薦的標準方法。但是，這些檢測方法所需時間較長(一般在48h以上)，操作複雜(需要使用活病毒和動物、細胞)，而且檢測成本高。為了改進這些方法，不同的實驗室和研究人員分別建立了酶聯免疫吸附試驗和乳膠凝集試驗等方法。其中，ELISA方法操作簡便、靈敏度高，但需要相關儀器進行結果判定，適用於實驗室檢測；乳膠凝集試驗則不同，不依賴特殊儀器，操作更加簡捷，既適用於實驗室操作，也可用於臨床樣品的現場檢測，但是存在檢測靈敏度低的缺點，一般只能檢測2IU/ml 以上的抗體水平(Madhusudana SN等，2003)。

發明內容
本發明涉及一種提高乳膠凝集試驗狂犬病中和抗體檢測靈敏度的方法，解決了傳統乳膠凝集試驗測定抗原靈敏度低的問題。本發明公開的一種提高乳膠凝集試驗狂犬病中和抗體檢測靈敏度的方法，採用以下技術解決方案
利用等量抗犬和人IgG Fe片段單克隆抗體同時致敏聚苯乙烯微球，再與等體積的犬或人狂犬病血清感作，然後與狂犬病病毒糖蛋白結合，用於檢測犬和人血清中狂犬病病毒中和抗體滴度。當抗體滴度>0.1 IU/ml時，會出現明顯的凝集現象，否則不凝集。
本發明提供的提高乳膠凝集試驗狂犬病中和抗體檢測靈敏度的方法，包括以下步驟
I)抗犬和人IgG Fe片段單克隆抗體的製備
利用木瓜蛋白酶消化犬和人lgG，獲得其Fe片段；分別取0. 2mg Fe片段腹腔免疫BALB/c小鼠；取免疫小鼠的脾細胞，通過聚乙二醇與SP2/0細胞融合，篩選單克隆抗體分泌陽性的雜交瘤細胞；取IO6雜交瘤細胞，注射到小鼠腹腔，製備腹水；經親和層析純化後，分別獲得抗Fe片段單克隆抗體；2)單克隆抗體致敏聚苯乙烯微球
分別取Img抗犬和人IgG Fe單克隆抗體,混勻，與5mg聚苯乙烯微球,均勻分散於Iml碳酸鹽緩衝液(pH9. 5)，4°C靜置12h後，5000rpm離心lOmin，棄上清，用0. 5ml PBS(pH7. 4)
重懸沉澱；
3)與血清抗體結合
取25M1犬和人血清分別等體積與致敏微球混勻，37°C感作15min, 5000rpm離心IOmin,棄上清，用50W PBS (pH7. 4)重懸沉澱；
4)抗體檢測
取25沿(1呢)狂犬病病毒糖蛋白，分別與25W感作後的微球混勻，加到載玻片上，37°C 感作15min。當抗體滴度> 0. I IU/ml時,會出現明顯的凝集現象,否則不凝集。本發明具有以下特點
1、IgGFe片段的蛋白序列高度保守，抗犬和人IgG Fe片段單克隆抗體可以特異性識別犬和人的IgG抗體，因此敏感性和特異性較高；
2、乳膠凝集反應實質上發生了兩次凝集，即先發生抗體與抗-抗體結合，在此基礎上再發生與抗原的凝集，從而使少量抗體也能形成明顯的凝集。發明的積極效果在於通過抗犬和人IgG Fe片段的單克隆抗體放大了乳膠凝集試驗的檢測信號，在有效提高了乳膠凝集試驗檢測狂犬病中和抗體靈敏度的同時，利用狂犬病病毒中和性保護抗原(糖蛋白)保證了中和抗體檢測的準確性。


圖I檢測0. I IU/ml犬樣品凝集效果 圖2檢測0. I IU/ml人樣品凝集效果。具體實施方案
下面結合實施例，對本發明做進一步描述。其作用被理解為是對本發明的闡釋而非對本發明的任何形式的限制。實施例I
針對犬和人IgG Fe片段單抗的製備
(I)犬和人IgG的提取
取犬和人血清各100毫升，分別用等量100毫升生理鹽水稀釋，加入等量(200毫升)飽和硫酸銨溶液，室溫沉澱30分鐘，3000r/min離心30分鐘，棄上清，沉澱以少量生理鹽水溶解；加入等量的33%飽和的硫酸銨，同上步驟沉澱一次。沉澱以5ml生理鹽水溶解後，裝入透析袋，用蒸餾水透析12小時，中間換水兩次，再用pH7. 2,0. OlM PBS透析12小時。(2)犬和人IgG Fe片段的製備
pH7. 2、0. OlM PBS將透析後的IgG稀釋為100mg/ml，分別加入1000U木瓜蛋白酶，37°C消化2小時。將消化的溶液通過SPA-resin層析柱，洗脫Fe片段。(3)犬和人IgG Fe片段單抗雜交瘤的建立製備
分別將Fe片段(2mg/ml)和福氏完全佐劑等體積混勻，按0. 2mg/只腹腔注射BALB/c小鼠，隨後將Fe片段與福氏不完全佐劑等體積混合，同劑量再免疫2次，每次間隔10天。最後一次免疫後3天，取I X IO7個脾細胞與I X IO6個SP2/0細胞混懸於600W聚乙二醇4000中融合lmin,加入20ml無血清RPMI-1640培養基，IOOOrpm離心Imin,去上清,用IOOml含10%血清和HAT的RPMI1640培養基重懸細胞，加入96孔細胞板，200W/孔，37°C 5%C02培養。10天後待出現單個細胞集落時，取適量細胞培養上清進行ELISA檢測，陽性者即為單抗分泌陽性雜交瘤細胞。ELISA檢測步驟用pH9. 6碳酸鹽緩衝液(NaHCO3 2. 93g，Na2CO3 I. 95g，加蒸餾水至1000ml)稀釋純化的IgG Fe片段至5Pg/ml，按100W/孔4°C致敏96孔酶標板10小時，用含5%脫脂奶粉的碳酸鹽緩衝液37°C封閉 2小時，用含0. 05%吐溫-20的PBS洗板3次，按100W/孔加入待檢細胞上清，37°C感作I小時，用含0. 05%吐溫-20的PBS洗板3次，按100W/孔加入工作濃度小鼠IgG酶標二抗，37°C感作I小時，用含0. 05%吐溫-20的PBS洗板3次，按100耵/孔加入TMB顯色液，37°C感作15min,按100W/孔加入加入2M H2SO4終止反應，利用酶聯檢測儀測定OD45tol值。取高於最低OD值孔兩倍以上的細胞孔作為陽性。(4)犬和人IgG Fe片段單抗的製備和純化
收集擴大培養細胞的上清，通過親和層析柱進行純化，洗脫後，備用。親和層析步驟取Amersham公司的Sepharose 4FF IgG親和層析柱(裝量Iml),以5ml 的 0. IM Tris (pH8. 0)平衡 3 次；加 IM Tris (pH8. 0)0. Iml 到 0. 9ml 待純化液體內調節PH值，排空層析柱，柱內加入上述待純化液體1ml，混勻後2V 8°C放置30min，期間混勻3次；排空層析柱，以5ml的0. IM Tris (pH8. 0)洗滌5次，排空柱內液體；以5ml的0. OlMTris (pH8. 0)洗滌5次，排空柱內液體；以0. IM甘氨酸溶液(pH3. 0)1. 8ml洗脫層析柱，回收物滴入盛有0. 2ml IM Tris (pH8. 0)的瓶內，此即為純化的IgG抗體；將純化的IgG抗體裝入透析袋中，以0. IM PBS (pH7. 2)透析過夜，-20°C保存備用。實施例2 聚苯乙烯微球的致敏
用PH9. 6碳酸鹽緩衝液分別稀釋犬和人IgG Fe片段單克隆抗體至lmg/ml，等體積混勻後,加入2. 5mg聚苯乙烯微球(直徑0. 8Mm)混合,4°C感作過夜。次日，5000rpm離心IOmin,取上清，經紫外分光光度計280nm檢測蛋白濃度彡0. 5mg/ml時，致敏合格。將沉澱重懸於含5%脫脂奶粉的碳酸鹽緩衝液，37°C封閉2小時。5000rpm離心lOmin，棄上清，0. 5ml 0. IMPBS (pH7.2)重懸，4°C保存。實施例3
乳膠凝集試驗檢測犬狂犬病中和抗體的靈敏度
取狂犬病標準血清(法國食品衛生安全署提供)，用PBS (pH7. 2)連續稀釋為2、1、0. 5、0. 2,0. 1,0. 05 IU/ml，取無狂犬病免疫史的犬血清作為陰性血清。用pH9. 6碳酸鹽緩衝液稀釋狂犬病病毒糖蛋白至lmg/ml，加入2. 5mg聚苯乙烯微球(直徑0. 8Mm)混合，4°C感作過夜。次日，5000rpm離心lOmin，取上清，經紫外分光光度計280nm檢測蛋白濃度彡0. 5mg/ml時，致敏合格。將沉澱重懸於含5%脫脂奶粉的碳酸鹽緩衝液，37°C封閉2小時。5000rpm離心lOmin，棄上清，0. 5ml 0. IM PBS (pH7. 2)重懸，用於常規乳膠凝集試驗檢測。檢測步驟取25沿致敏微球，分別與不同血清樣品等體積混合，滴加在載玻片上，置37°C溼盒內感作15min，肉眼觀察凝集效果(圖I)。改良乳膠凝集試驗檢測步驟取25W致敏微球，與25W血清混合，置離心管內37°C溼盒內感作15min後，取出25W再分別1呢狂犬病病毒糖蛋白等體積混合，滴加在載玻片上，置37°C溼盒內感作15min，肉眼觀察凝集效果(圖I)。檢測結果如表I所示，常規乳膠凝集試驗最低能檢測到2 IU/ml的狂犬病中和抗體，改良乳膠凝集試驗最低能檢測到0. I IU/ml的狂犬病中和抗體。表I犬血清乳膠凝集試驗檢測靈敏度
權利要求
1.一種提高乳膠凝集試驗狂犬病中和抗體檢測靈敏度的方法，其特徵為利用抗犬和人的IgG Fe片段單克隆抗體等量共同致敏聚苯乙烯微球，分別與等體積的犬或人血清感作，再與狂犬病病毒糖蛋白結合後發生凝集反應，用於提高乳膠凝集試驗法檢測人和犬血清狂犬病中和抗體滴度的靈敏性。
2.如權利要求I所述提高乳膠凝集試驗狂犬病中和抗體檢測靈敏度的方法，包括以下步驟 1)抗犬和人IgGFe片段單克隆抗體的製備 利用木瓜蛋白酶消化犬和人lgG，獲得其Fe片段；分別取0. 2mg Fe片段腹腔免疫BALB/c小鼠；取免疫小鼠的脾細胞，通過聚乙二醇與SP2/0細胞融合，篩選單克隆抗體分泌陽性的雜交瘤細胞；取106雜交瘤細胞，注射到小鼠腹腔，製備腹水；經親和層析純化後，分別獲得抗犬和人IgG Fe片段單克隆抗體； 2)單克隆抗體致敏聚苯乙烯微球 分別取Img抗犬和人IgG Fe單克隆抗體,混勻，與5mg聚苯乙烯微球均勻分散於Iml碳酸鹽緩衝液(pH9. 5)，4°C靜置12h後，5000rpm離心lOmin，棄上清，用0. 5ml PBS(pH7. 4)重懸沉澱； 3)與血清抗體結合 取25M1犬和人血清分別等體積與致敏微球混勻，37°C感作15min, 5000rpm離心IOmin,棄上清，用50W PBS (pH7. 4)重懸沉澱； 4)抗體檢測 取25沿(1呢)狂犬病病毒糖蛋白，分別與25W感作後的微球混勻，加到載玻片上，37°C感作15min ;當抗體滴度> 0. I IU/ml時,會出現明顯的凝集現象,否則不凝集。
全文摘要
本發明涉及一種提高乳膠凝集試驗檢測狂犬病中和抗體靈敏度性的方法。利用等量抗犬和人IgGFc片段單克隆抗體同時致敏聚苯乙烯微球，再與等體積的犬或人血清感作，然後與狂犬病病毒糖蛋白結合，用於檢測犬和人血清中狂犬病病毒中和抗體滴度。當抗體滴度≥0.1IU/ml時，會出現明顯的凝集現象，否則不凝集。
文檔編號G01N33/577GK102749445SQ20121022049
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月29日 優先權日2012年6月29日
發明者劉曄, 張守峰, 張菲, 扈榮良, 連海 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所