用於檢測禽流感h5n1和新城疫病毒的引物及其檢測方法和試劑盒的製作方法

2023-07-31 11:03:16 3

專利名稱：：用於檢測禽流感h5n1和新城疫病毒的引物及其檢測方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
：本發明涉及病毒檢測
技術領域：
，特別涉及用於檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的引物及其檢測方法和試劑盒。
背景技術：
：新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus，NDV)是可S1起禽類的一種以呼吸道、消化道黏膜出血為典型症狀的急性傳染病。新城疫病毒屬於副粘病毒科、副粘病毒亞科、腮腺炎病毒屬。禽副粘病毒共有9個血清型，即PMV-1至PMV-9，其中新城疫病毒(NDV)是禽副粘病毒1型(APMV-1)的主要成員。試驗表明，有250多種鳥類可被NDV感染，其危害和引發的後果極其嚴重。1999年農業部發布的動物疫病目錄中將其列為I類疫病，世界動物衛生組織(OIE)將其列為A類疫病。高致病性禽流感甲型流感病毒H5N1亞型(HighlypathogenicavianinfluenzavirusoftypeAofsubtypeH5N1)是由正粘病毒矛牛流感病毒屬病毒引起的急性接觸性傳染病，被國際獸疫局(OIE)定為一類傳染病，可表現出臨診症狀、呼吸道疾病、消化道症狀、產蛋率下降、致死率高的急性出血性疾病.在禽類中傳染性極強，發病突然，病症嚴重，死亡快速，死亡率可達100%。在臨床症狀上，兩種疾病有4艮高的相似性。它們往往突然爆發，死亡率極高。病程稍長可見精神萎頓，不食，衰弱，羽毛送亂，結膜肺脹發炎，鼻腔內有粘性分泌物，呼吸困難等。因此，需要發明一種新的可以對兩種病毒的進行快速且準確的診斷方法以5解決上述問題。
發明內容本發明的主要目的之一在於基於現有技術的不足而提供一種靈敏度高、特異性強的檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的引物。本發明提供的一組用於檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的引物包括所述禽流感H5N1的HA基因中的序列或其互補序列以及所述新城疫病毒的F基因中的序列或其互補序列。作為本發明優選實施方式，本發明用於4企測禽流感H5N1和新城疫病毒的引物為SEQIDNO:1~8所示的寡核苷酸5'-CATTCCACAACATACACC-3';5'-TGACTCCATCTATTGCCT-3';AGGAGCACAATCCAACTCAC-3';TGGATGTCGCCTGAGAGG-3';GTACCACCTGCCGTGTTGCGAATTCAGTCTCTTGCAGTCCGC-3';CAGGAATACCGGGCTTACTGCAGAATTCGGCTGATGTCTTGGTGTTG-3';或者SEQIDNO:18所示的寡核苷酸的互補鏈。本發明的另一個目的是提供一種靈敏度高、特異性強、反應時間短、操作簡單的檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的方法，通過多重環介導的等溫擴增方法對所述禽流感H5N1和新城疫病毒的核苷酸序列進行擴增，其中引物為所述禽流感H5N1的HA基因中的序列或其互補序列以及所述新城疫病毒的F基因中的序列或其互補序列。優選的，所述引物為SEQIDNO:1~8所示的寡核苦酸5'-CATTCCACAACATACACC-3';5'-TGACTCCATCTATTGCCT-3';5'-AGGAGCACAATCCAACTCAC隱3';5'-TGGATGTCGCCTGAGAGG-3';5'-GTACCACCTGCCGTGTTGCGAATTCAGTCTCTTGCAGTCCGC-3';5'-CAGGAATACCGGGCTTACTGCAGAATTCGGCTGATGTCTTGGTGTTG-3';或者SEQIDNO:18所示的寡核芬酸的互補^t。作為本發明優選實施方式，本發明的檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的方法，包括如下步驟提取樣本的總RNA;對RNA進行逆轉錄反應，得到cDNA;對cDNA進行多重環介導的等溫核酸擴增反應，反應溫度為63~66°C,反應時間為60分鐘或90分鐘；再終止反應，最後4全測擴增產物。作為本發明優選實施方式，本發明的4企測禽流感H5N1和新城疫病毒的方法，包括如下步驟提取樣本的總RNA;將RNA的逆轉錄反應和多重環介導的等溫核酸擴增反應在同一條件下同時進行，反應溫度為63~66°C，反應時間為90分鐘；再終止反應，最後4企測擴增產物。所述的糹全測擴增產物為通過限制性內切酶五coRI和Xpwl對所述產物酶切後再觀察電泳結果。本發明的第三個目的在於基於現有技術的不足而提供一種靈敏度高、特異性強、反應時間短、操作筒單的檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的試劑盒，所述試劑盒包含檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的引物，所述引物為所述禽流感H5N1的HA基因中的序列或其互補序列以及所述新城疫病毒的F基因中的序列或其互補序列。優選的，所述引物為SEQIDNO:1~8所示的寡核苷酸-CATTCCACAACATACACC-3';-TGACTCCATCTATTGCCT-3';-AGGAGCACAATCCAACTCAC-3';TGGATGTCGCCTGAGAGG-3';GTACCACCTGCCGTGTTGCGAATTCAGTCTCTTGCAGTCCGC-3'或者SEQIDNO:1~8所示的寡核苷酸的互補《連。優選的，所述試劑盒還包括dNTPs混合物、甜菜鹼、MgS04、BstDNA聚合酶大片段、BstDNA聚合酶緩衝液和AMV逆轉錄酶。與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果本發明的一套檢測NDV和H5N1的特異性引物是針對NDV的F基因和H5N1的HA基因的保守序列而設計的，適用於m-LAMP檢測方法，能特異、靈敏、快速檢測組織樣品中的病毒並通過酶切反應加以區分。本發明的檢測NDV和H5N1的m-LAMP方法及其試劑盒用於基因擴增和病毒檢測分析，新型有效，可檢測多個病毒的混合樣品，通過雙酶切反應可以區分不同病毒；由於擴增反應從63。C-66。C都可以進行，不需變溫擴增儀器，因此該方法可以在條件簡陋的實驗室以及發展中國家得到進一步推廣。圖1是本發明的4企測禽流感H5N1和新城疫病毒的多重環介導等溫擴增反應在不同反應溫度下擴增的一個優選實施例的產物電泳圖2是本發明的檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的多重環介導等溫擴增反應在不同60分鐘和90分鐘的兩種反應時間下擴增的一個優選實施例的產物電泳圖；其中，圖a是反應60分鐘的所得產物的電泳圖，圖b是反應90分鐘的所得產物的電泳圖，圖a和圖b中M泳道是2000bp的DNAMarker,泳道1-6分別是混合樣品、NDV、H5N1、IBDV、IBV、H3N2;圖3是多重環介導等溫擴增方法檢測禽流感H5N1和新i成疫病毒的產物酶切後的電泳圖4是用RT-PCR和多重環介導等溫擴增方法;險測禽流感H5N1和新城疫病毒的敏感性比照的一個優選實施例的結果，其中，M泳道是2000bpDNAMarker;標註1~l(T3的泳道為才莫板按10倍稀釋後的擴增結果;圖a是分別用RT-PCR和m-LAMP檢測H5N1的產物的電泳比較圖；圖b是用RT-PCR和m-LAMP檢測NDV的產物的電泳比較圖；圖c是混合樣品的m-LAMP反應產物電泳結果圖。具體實施例方式為使本發明更加容易理解，下面將進一步闡述本發明的具體實施例。本發明實施例中所用到的新城疫病毒(NDV)來自廣東溫氏集團，滅活的禽流感病毒(A/goose/Guangdong/1996/01)H5N1雞胚尿嚢液由華南農業大學家禽研究室提供。傳染性支氣管炎病毒(IBV)疫苗毒株H52為梅裡亞動物保健公司產品，傳染性法氏嚢病病毒(IBDV)毒林來自來自梅裡亞動物保健公司，流感病毒(A/Swine/Guangdong/2002/101)H3N2由華南農業大學動物科學學院家禽研究室提供。實施例一通過多重環介導的等溫擴增法(Multiple-LAMP,m-LAMP)檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的方法總RNA抽提(1)在1.5ml離心管中加入200ul病毒液，再加入800|xlTRIZOL,振搖直至變粘稠。室溫放置5分鐘，使核酸和蛋白充分解離。(2)加入200^1氯仿，劇烈振蕩15s，混合均勻。室溫放置15分鐘。(3)4°C,13,000r/min,離心15min,取上層水相於另一新1.5ml離心管中，並加入等體積異戊醇，混勻後室溫放置10~15分鐘。(4)4°C，13,000rpm離心1015min,沉澱RNA。小心棄盡上清，用4。C的75%乙醇lml洗滌沉澱，最後，13,000r/min離心10min。(5)小心棄淨上清，超淨工作檯內風乾RNA沉澱。(6)以20plRNase-free水溶解沉澱，2^1用於RT-LAMP(反應體系為25pl)4^1用於RT-PCR(反應體系為50pl)。引物設計和合成下載GeneBank上的NDV(新城疫病毒)的F基因和AIV(低致病性禽流感病毒)H5N1毒林的HA基因的序列，通過DNAStar、ClustalX等軟體比對序列找到保守的區域，用來設計LAMP引物，一共包括4條引物，互補於模板的8個片段。引物序列見表1,表1是m-LAMP引物列表。RT-PCR引物採用F3/B3引物。表1tableseeoriginaldocumentpage11引物序列送至上海生工有限公司合成，合成後稀釋成10拜，分裝後置於-20。C保存。多重環介導的等溫擴增法反應反應體系由內引物各4Opmo1、外引物各5pmo1、dNTPsmix各(TaKaRa公司)1.4mM、甜菜鹼betaine(Sigma公司)0.8M、MgS046mM、BstDNA聚合酶(largefragment;NewEnglandBiolabs公司)l(xl、lx提供的BstDNA聚合酶緩衝液、AMV逆轉錄酶(TaKaRa)0.125U，RNA模板各l^d組成，反應體系共25ji1。另外，為防止氣溶膠粒子汙染，在體系上添加20pl的礦物油(Sigma),起到液封的作用。為了確定最佳的反應溫度和時間，分別設計了反應的溫度梯度和時間梯度。m-LAMP反應在65°C反應60min和90min(時間梯度)，在63°C,64°C,65。C和66°C反應90min(溫度梯度)。反應最後80°C持續5min以滅活BstDNA聚合酶來終止反應。反應完後，取5^11的產物在2%濃度、用EB染色的凝膠上電泳。在建立m-LAMP檢測方法時，都使用DEPC處理的無菌水做陰性模板。實施例二m-LAMP的敏感性和特異性實驗在敏感性試驗中，分別取NDV和H5N1的DNA作為模板，按10倍的倍比來稀釋，每個DNA濃度梯度都取2pl用於m-LAMP,藉以判斷檢測的稀釋極限。特異性實驗是用m-LAMP來檢測NDV和AIV分離抹以及混合樣品的RNA，以IBDV(傳染性嚢病病毒)、IBV(傳染性支氣管炎病毒)和IVH3N2亞型的RNA,DEPC處理的無菌水做陰性對照。實施例三通過多重環介導的等溫擴增法檢測檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的最佳反應溫度和時間反應溫度是m-LAMP擴增的一個最重要的參數，4條引物要#4居先後退火的順序來起始和延續整個反應。圖1是本發明的檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的多重環介導等溫擴增反應在不同反應溫度下擴增的一個優選實施例的產物電泳圖；其中，M泳道是2000bp的DNAMarker，N泳道是陰性對照，標註63~66的泳道表示不同的反應溫度(單位。C)。圖l顯示，在6366。C範圍內擴增都能進行，選擇65。C作為最佳反應溫度。反應的時間，如圖2所示，圖2是本發明的檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的多重環介導等溫擴增反應在60分鐘和90分鐘的兩種反應時間下擴增的一個優選實施例的產物電泳圖；其中，圖a是反應60分鐘的所得產物的電泳圖，圖b是反應90分鐘的所得產物的電泳圖，圖a和圖b中M泳道是2000bp的DNAMarker，泳道1-6分別是混合樣品、NDV、H5N1、IBDV、IBV、H3N2。圖2結果顯示，60min並不能看到明顯特徵性的梯狀條帶，在90min產生明亮的條帶。實施例四PCR和多重環介導等溫擴增方法4企測禽流感H5N1和新城疫病毒的敏感性對比實驗為了比較m-LAMP和PCR擴增的敏感性，進行了兩種方法的對比實驗，引物序列分別採用LAMP引物的F3/B3。反應按試劑盒說明書來操作，反應體系包含0.4pM的UP和DN引物、r-TaqDNA聚合酶和2pl的DNA模板。UP5'_ATTGTTCCGTTCATACGGAGC-3'DN5'-GCTCCGTATGAACGGAACAAT-3'PCR反應的程序為94°C,2min94°C，30s58°C，30sL30個循環72°C，30s72°C，lOmin根據PCR儀(Biometra公司)的顯示，PCR反應大概需要60min。反應完後，取5|11的產物在2%濃度的用EB染色的凝膠上電泳，預期的擴增片段為210bp。m-LAMP反應後的產物雙酶切反應糹全測結果擴增產物經過限制性內切酶五coRI和^"I(TaKaRa厶司)來進行雙酶切反應以區分病毒類型。酶切反應的體系為10x內切酶反應緩衝液2^1五coRI酶/一I酶0.5pim-LAMP的擴增產物3^1ddH20補至20)li1酶切反應結果如圖3所示，圖3是多重環介導等溫擴增方法檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的產物酶切後的電泳圖；M泳道是2000bp的DNAMarker;泳道1是NDV酶切產物；泳道2是H5N1酶切產物。理論上，NDV引物組的酶切片段大小為252bp和142bp，H5N1引物組的酶切片段為173bp,330bp和358bp三個片段。在近期LAMP方法研究中，限制性酶切位點主要被用來確定所擴增片段是否為目的基因片段。在本發明中，為了區別混合樣品中不同種類的病毒，設計了不同的酶切位點，用雙酶切後不同大小的片段來區別病毒種類，使之成為理想的適用於簡易實驗室的病原診斷方法。在NDV的兩條內引物FIP/BIP的TTTT區域插入EcoRI限制性酶切位點(GAATTC)並結合在H5N1的HA基因中存在的Kpnl酶切位點，使用雙酶切LAMP產物後產生不同大小的片段來區分NDV和H5N1病毒。酶切結果表明所建立的m-LAMP方法不僅具有特異性，而且可以簡單區分NDV和H5N1兩種病毒。通過將目標RNA按10倍倍比稀釋後，取同等濃度的RNA作為m-LAMP和RT-PCR反應的模板。圖4是用RT-PCR和多重環介導等溫擴增方法檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的敏感性比照的一個優選實施例的結果，其中，M泳道是2000bpDNAMarker;標註1~10—3的泳道為模板按10倍稀釋後的擴增結果;圖a是分別用RT-PCR和m-LAMP檢測H5N1的產物的電泳比較圖；圖b是用RT-PCR和m-LAMP檢測NDV的產物的電泳比較圖；圖c是混合樣品的m-LAMP反應產物電泳結果圖。圖4顯示，在單獨檢測中，NDV的RT-PCR的檢測極限為RNA稀釋10倍，而m-LAMP的檢測極限是稀釋102倍。H5N1的RT-PCR和m-LAMP的檢測極限均為10"倍。在混合樣品的m-LAMP檢測中，m-LAMP的檢測極限是稀釋10-2倍。總的說來，m-LAMP比PCR更為敏感。實施例五RT-LAMP4企測禽流感H5N1和新;成疫病毒的特異性如圖2所示，所使用的新城疫病毒和禽流感H5N1病毒以及他們的混合樣品都表現出陽性(+)，而其他三個陰性對照禽類病毒的毒抹表現出陰性(-)。沒有出現與其他病毒的交叉反應說明所建立的m-LAMP技術具有很強的特異性。實施例六檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的引物一組用於4企測禽流感H5N1和新城疫病毒的引物，該引物為所述禽流感H5N1的HA基因中的序列或其互補序列以及所述新城疫病毒的F基因中的序列或其互4卜序列。優選的，所述引物為SEQIDNO:18所示的寡核苷酸-CATTCCACAACATACACC-3';-TGACTCCATCTATTGCCT-3';-AGGAGCACAATCCAACTCAC-3';-TGGATGTCGCCTGAGAGG-3';-GTACCACCTGCCGTGTTGCGAATTCAGTCTCTTGCAGTCCGC-3'或者SEQIDNO:18所示的寡核苦酸的互補^€。這裡所用的"寡核苷酸，，是指任何長度的含嘌呤和嘧啶的聚合物，可以是多核糖核苷酸，可以是多脫氧核糖核苷酸，或是混合的多核糖-多脫氧核糖核苷酸。它包括單鏈和雙鏈分子，例如DNA-DNA,DNA-RNA和RNA-RNA雜合體，以及通過與胺基酸主鏈共軛鹼基形成的"蛋白質核酸"(PNA)。它還包括含有》務飾鹼基的核酸。這裡所用的"引物"是長度約為5個至50個核苷酸的寡核苷酸，優選長度為大約6個至25個核苷酸，特別優選長度為大約6個至18個核苷酸，它與相關的單鏈核酸序列形成一個雙鏈體，並且可以用例如逆轉錄酶或DNA聚合酶使互補鏈發生聚合反應。這裡所用的核酸序列的"互補鏈"是指參與與原始序列沃森-克裡克鹼基配對的反義序列。實施例七4全測禽流感H5N1和新城疫病毒的試劑盒本發明的檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的試劑盒，包含4企測禽流感H5N1和新城疫病毒的引物，引物為所述禽流感H5N1的HA基因中的序列或其互補序列以及所述新城疫病毒的F基因中的序列或其互補序列。具體來說，引物序列如SEQIDNO:18所示的寡核苷酸5'-CATTCCACAACATACACC-3';5'-TGACTCCATCTATTGCCT-3';5'隱AGGAGCACAATCCAACTCAC-3';5'-TGGATGTCGCCTGAGAGG-3';5'-GTACCACCTGCCGTGTTGCGAATTCAGTCTCTTGCAGTCCGC-3';5'-CAGGAATACCGGGCTTACTGCAGAATTCGGCTGATGTCTTGGTGTTG-3';或者SEQIDNO:18所示的寡核苷酸的互補鏈。該試劑盒還包括dNTPs混合物、甜菜鹼、MgS04、BstDNA聚合酶大片段、BstDNA聚合酶緩沖液和AMV逆轉錄酶。最後所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護範圍的限制，儘管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和範圍。序列表中山大學用於檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的引物及其檢測方法和試劑盒10Patentlnversion3.3<210〉118DNA<213〉人工序歹寸H5N1—F31cattccacaacatecacc18<210〉219DNA<213〉人工序歹'JH5N1—B32tgactccatctattgcct18<210〉347DNA人工序列H5N1-FIP3ctgagtccagtcgcaaggactaatctgtttttctcaccatcggggaa47448DNA人工序歹寸H5N1—BIP4ggatggcagggaatggtagatggttttgtatccactcccctgctcatc485<211〉20DNA<213〉人工序列NDV-F35aggagcaca3tccaactcac20618DNA人工序列NDV-B36tggatgtcgcctgagagg181742DNA人工序列NDV-FIP<400〉7gtaccacctgccgtgttgcgaattc昭tctcttgcagtccgc42847DNA人工序列NDV-BIP8caggaataccgggcttactgcagaattcggctgatgtcttggtgttg47<210〉921DNA<213〉人工序列UP<400〉9attgttccgttcatacggagc211021<212〉DNA人工序列DN10gctccgtatgaacggaacaat2權利要求1.用於檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的引物，其特徵在於，所述的引物包括所述禽流感H5N1的HA基因中的序列或其互補序列以及所述新城疫病毒的F基因中的序列或其互補序列。2.根據權利要求1所述的引物，其特徵在於，所述引物為SEQIDNO:1~8所示的寡核苷酸-CATTCCACAACATACACC-3';TGACTCCATCTATTGCCT-3';5'-CTGAGTCCAGTCGCAAGGACTAATCTGTTTTTCTCACCATCGGGGAA-3';-GGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTTTGTATCCACTCCCCTGCTCATC-3';-AGGAGCACAATCCAACTCAC-3';-TGGATGTCGCCTGAGAGG-3';-GTACCACCTGCCGTGTTGCGAATTCAGTCTCTTGCAGTCCGC-3';5'-CAGGAATACCGGGCTTACTGCAGAATTCGGCTGATGTCTTGGTGTTG-3';或者SEQIDNO:18所示的寡核香酸的互補鏈。3.—種檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的方法，其特徵在於，通過多重環介導的等溫擴增方法對所述禽流感H5N1和新城疫病毒的核苷酸序列進4亍擴增，其中引物包括所迷禽流感H5N1的HA基因中的序列或其互補序列以及所述新城疫病毒的F基因中的序列或其互補序列。4.根據權利要求3所述的檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的方法，其特徵在於，所述引物為SEQIDNO:1~8所示的寡核苷酸5'-CATTCCACAACATACACC-3';`5'-TGACTCCATCTATTGCCT-3';-AGGAGCACAATCCAACTCAC-3';5'-TGGATGTCGCCTGAGAGG-3';`5'-GTACCACCTGCCGTGTTGCGAATTCAGTCTCTTGCAGTCCGC-3';`5'-CAGGAATACCGGGCTTACTGCAGAATTCGGCTGATGTCTTGGTGTTG-3';或者SEQIDNO:18所示的寡核苷酸的互補鏈。5.根據權利要求3所述的檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的方法，其特徵在於，包括如下步驟4是取樣本的總RNA;對RNA進行逆轉錄反應，得到cDNA;對cDNA進行多重環介導的等溫核酸擴增反應，反應溫度為63~66°C，反應時間90分鐘；再終止反應，最後檢測擴增產物。6.根據權利要求3所述的^r測禽流感H5N1和新城疫病毒的方法，其特徵在於，包括如下步驟提取樣本的總RNA;將RNA的逆轉錄反應和多重環介導的等溫核酸擴增反應在同一條件下同時進行，反應溫度為63~66°C，反應時間為90分鐘；再終止反應，最後檢測擴增產物。7.根據權利要求5或6所述的檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的方法，其特徵在於，所述的^r測擴增產物為通過限制性內切酶五coRI和對所述產物酶切後再觀察電泳結果。8.—種檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包含^r測禽流感H5N1和新城疫病毒的引物，所述引物包括所述禽流感H5N1的HA基因中的序列或其互補序列以及所述新城疫病毒的F基因中的序列或其互4卜序列。9.根據權利要求8所述的檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的試劑盒，其特徵在於，所述引物為SEQIDNO:18所示的寡核苦酸5'-CATTCCACAACATACACC-3';5'-TGACTCCATCTATTGCCT-3';5'-GGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTTTGTATCCACTCCCCTGCTCATC-3';5'-AGGAGCACAATCCAACTCAC-3';5'-TGGATGTCGCCTGAGAGG-3';5'-GTACCACCTGCCGTGTTGCGAATTCAGTCTCTTGCAGTCCGC-3';5'-CAGGAATACCGGGCTTACTGCAGAATTCGGCTGATGTCTTGGTGTTG-3';或者SEQIDNO:1~8所示的寡核苷酸的互補鏈。10.根據權利要求8所述的檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括dNTPs混合物、甜菜鹼、MgS04、BstDNA聚合酶大片段、BstDNA聚合酶緩衝液和AMV逆轉錄酶。全文摘要本發明提供了用於檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的引物，該引物包括所述禽流感H5N1的HA基因中的序列或其互補序列以及所述新城疫病毒的F基因中的序列或其互補序列，如SEQIDNO1～8所示的寡核苷酸或其互補鏈。本發明還提供了檢測禽流感H5N1和新城疫病毒的方法和試劑盒，利用上述引物，通過多重環介導的等溫擴增方法對禽流感H5N1和新城疫病毒的核苷酸序列進行擴增。本發明的引物特異性強、靈敏度高；本發明的檢測NDV和H5N1的m-LAMP方法及其試劑盒新型有效，可檢測多個病毒的混合樣品，不需變溫擴增儀器，適合在條件簡陋的實驗室以及發展中國家得到進一步推廣。文檔編號C12N15/11GK101671747SQ20091019319公開日2010年3月17日申請日期2009年10月21日優先權日2009年10月21日發明者芸張,曹永長,薛春宜申請人:中山大學