一種高效誘導棉花體胚發生與植株再生的方法及其培養基的製作方法

2023-07-31 03:49:36

專利名稱：一種高效誘導棉花體胚發生與植株再生的方法及其培養基的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種高效誘導棉花體胚發生與植株再生的方法及其培養基。
背景技術：
棉花是重要的經濟作物，其細胞和組織培養研究已取得了很大的進展，並初步建立和完善了棉花組織培養的技術體系。棉花組織培養、離體再生作為棉花細胞工程和基因工程的基礎技術，在棉花遺傳改良中有著極為重要的作用。然而，棉花是較難通過體細胞胚胎發生途徑獲得再生植株的作物，表現為在組織培養中基因型依賴性強且周期長，重複性差。另外，在棉花體細胞胚胎發生過程中，體胚發生效率低且畸形胚胎頻率高。

發明內容
本發明的目的是提供一種高效誘導棉花體胚發生與植株再生的方法及其培養基。本發明所提供的培養基為用於獲得棉花體細胞再生植株的成套培養基，分為只由活性成分組成的便於存放的貯存型培養基和由所述貯存型培養基和水配成的即用型培養基。所述用於獲得棉花體細胞再生植株的成套培養基，其中的貯存型培養基，由獨立包裝的培養基A、培養基B和培養基C組成；所述培養基A為由改良MS基本培養基、激素、葡萄糖和凝固劑組成的培養基；所述培養基B為由所述改良MS基本培養基、激素、葡萄糖和胺基酸添加物組成的
培養基；所述培養基C為由所述改良MS基本培養基、激素、葡萄糖、胺基酸添加物和凝固劑組成的培養基；所述改良MS基本培養基由下述質量份的營養成分組成NH4NO3 825 份、KNO3 3800 份、Iffl2PO4 170 份、CaCl2 · 2H20 440 份和 MgSO4 · 7H20370 份；KI 0. 83 份、Na2MoO4 · 2H20 0. 25 份、H3BO3 6. 2 份、CuSO4 · 5H20 0. 025 份、MnSO4 · 4H20 22. 3 份、CoCl2 · 6H20 0. 025 份和 ZnSO4 · 4H20 8. 6 份；Na2EDTA 37. 3 份和 FeSO4 · 7H20 27. 8 份；煙酸0. 5份、肌醇100份、鹽酸硫胺素0. 1份、鹽酸吡哆素0. 5份和甘氨酸2. 0份；所述激素為吲哚丁酸和激動素，所述吲哚丁酸和所述改良MS基本培養基在所述培養基A、培養基B和培養基C中的配比滿足0. 3份-1. 0份所述吲哚丁酸/825份NH4NO3,具體可為0. 3份所述吲哚丁酸/825份NH4NO3或0. 6份所述吲哚丁酸/825份NH4NO3或1. 0份所述吲哚丁酸/825份NH4NO3 ；所述激動素和所述改良MS基本培養基在所述培養基A、培養基B和培養基C中的配比滿足0. 05份-0. 3份所述激動素/825份NH4NO3,具體可為0. 05份所述激動素/825份NH4NO3或0. 15份所述激動素/825份NH4NO3或0. 3份所述激動素/825 份NH4NO3 ；所述吲哚丁酸與所述激動素在所述培養基A、培養基B和培養基C中的質量份之比均為(7. 00-3. 00) 1，具體可為6 1或4 1或3. 33 1;所述葡萄糖和所述改良MS基本培養基在所述培養基A、培養基B和培養基C中的配比滿足25000份-35000份所述葡萄糖/825份NH4NO3,具體可為25000份所述葡萄糖/825 份NH4NO3或30000份所述葡萄糖/825份NH4NO3或35000份所述葡萄糖/825份NH4NO3 ；所述胺基酸添加物為穀氨醯胺和天冬氨酸，所述穀氨醯胺和所述改良MS基本培養基在所述培養基B和培養基C中的配比滿足300份-700份所述穀氨醯胺/825份NH4NO3, 具體可為300份所述穀氨醯胺/825份NH4NO3或500份所述穀氨醯胺/825份NH4NO3或700 份所述穀氨醯胺/825份NH4NO3 ；所述天冬氨酸和所述改良MS基本培養基在所述培養基B和培養基C中的配比滿足300份-700份所述天冬氨酸/825份NH4NO3,具體可為300份所述天冬氨酸/825份NH4NO3或500份所述天冬氨酸/825份NH4NO3或700份所述天冬氨酸/825 份 NH4NO3 ；所述凝固劑具體可為植物凝膠或瓊脂。所述用於獲得棉花體細胞再生植株的成套培養基，其中的即用型培養基，由獨立包裝的培養基Al、培養基Bl和培養基Cl組成；所述培養基Al為向液體培養基D中加入凝固劑得到的固體培養基；所述液體培養基D由溶質和溶劑組成，所述溶劑為水，所述溶質的濃度如下NH4NO3 0. 825g/L、KN03 3. 8g/L,KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 ·2Η200· 44g/L,MgSO4 ·7Η20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、 MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/ L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇 0. 5mg/L、甘氨酸 2. Omg/L、吲哚丁酸 0. 3mg/L_l. Omg/L 或 0. 3mg/L 或 0. 6mg/L 或 1. Omg/L、 激動素 0. 05mg/L-0. 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. :3mg/L、葡萄糖為 25g/L_35g/L 或 25g/L 或 30g/L 或 35g/L ；所述培養基Bl為液體培養基，由溶質和溶劑組成，所述溶劑為水，所述溶質的濃度如下=NH4NO3 0. 825g/L、KN03 3. 8g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、 MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/ L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇 0. 5mg/L、甘氨酸 2. Omg/L、吲哚丁酸 0. 3mg/L_l. Omg/L 或 0. 3mg/L 或 0. 6mg/L 或 1. Omg/L、 激動素 0. 05mg/L-0. 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. :3mg/L、葡萄糖為 25g/L_35g/L 或 25g/L 或 30g/L 或 35g/L、穀氨醯胺 0. 3g/L_0. 7g/L 或 0. 3g/L 或 0. 5g/L 或 0. 7g/L 和天冬氨酸 0. 3g/L-0. 7g/L 或 0. 3g/L 或 0. 5g/L 或 0. 7g/L ；所述培養基Cl為向液體培養基E中加入凝固劑得到的固體培養基；所述液體培養基E由溶質和溶劑組成，所述溶劑為水，所述溶質的濃度如下=NH4NO3 0. 825g/L、 KNO3 3. 8g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KIO. 83mg/L、 Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、 CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、 煙酸0. 5mg/L、肌醇100mg/L、鹽酸硫胺素0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、吲哚丁酸 0. 3mg/L-l. Omg/L 或 0. 3mg/L 或 0. 6mg/L 或 1. Omg/L、激動素 0. 05mg/L_0· 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. :3mg/L、葡萄糖為 25g/L_35g/L 或 25g/L 或 30g/L 或 35g/L、穀氨醯胺 0. 3g/L-0. 7g/L 或 0. 3g/L 或 0. 5g/L 或 0. 7g/L 和天冬氨酸 0. 3g/L_0. 7g/L 或 0. 3g/L 或 0. 5g/L 或 0. 7g/L ；
所述吲哚丁酸與所述激動素在所述培養基D、所述培養基Bi、所述培養基E、所述培養基Al和所述培養基Cl中的質量比為(7.00-3.00) 1，具體可為6 1或4 1或 3·33 · Io所述培養基D、所述培養基Bi、所述培養基E、所述培養基Al和所述培養基Cl的 pH 值均為 5. 6-6. 2 或 5. 6 或 5. 8 或 6. 2 ；所述凝固劑為植物凝膠，所述植物凝膠在所述培養基Al和所述培養基Cl中的濃度均為 2. 4g/L-3. Og/L 或 2. 4g/L 或 2. 6g/L 或 3. Og/L。利用所述的成套培養基按照包括如下步驟的方法將棉花愈傷組織培養成再生植株1)將棉花愈傷組織在所述培養基Al中培養，獲得胚性愈傷組織；2)將所述步驟1)中獲得的所述胚性愈傷組織培養於所述培養基Bl中，獲得原胚；3)將所述步驟幻中獲得的所述原胚在所述培養基Cl中培養，獲得棉花再生植株。所述步驟2~)包括如下步驟將所述步驟1)中獲得的所述胚性愈傷組織在所述培養基Bl中進行第一次懸浮培養，使所述胚性愈傷組織增殖，再轉接入所述培養基Bl中進行第二次懸浮培養，得到所述原胚。所述步驟2、中，所述第一次懸浮培養和所述第二次懸浮培養的溫度、振蕩頻率和培養時間如下23-30°C、70-130轉/分鐘振蕩(旋轉半徑為12mm)培養10-14天，具體可為10天或12天或14天。所述第一次懸浮培養和所述第二次懸浮培養的光照條件為每天M小時中光照 14-18小時，光照強度為16001UX，其餘時間黑暗。所述轉接是將第一次懸浮培養得到的粒徑小於50目，如60目或70目的愈傷組織接入所述培養基Bi。所述步驟1)的培養在如下條件進行23-30°C、光照條件為每天對小時中光照 14-18小時，光照強度為16001UX，其餘時間黑暗；所述步驟3)的培養在如下條件進行23-30°C、光照條件為每天M小時中光照 14-18小時，光照強度為16001UX，其餘時間黑暗。所述棉花愈傷組織是通過如下誘導培養基培養棉花子葉苗的下胚軸得到的向液體培養基F中加入凝固劑得到的固體培養基；所述液體培養基F由溶質和溶劑組成，所述溶劑為水，所述溶質的濃度如下=NH4NO3 1. 65g/L、KNO3 1. 9g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、 CuSO4 ·5Η20 0. 025mg/L、MnS04 ·4Η20 22. 3mg/L、CoCl2 ·6Η200· 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/ L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇 0. 5mg/L、甘氨酸 2. 0mg/L、2，4_D 0. 05mg/L_0· 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. 3mg/L、吲哚乙酸 0. 05mg/L_0. 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. 3mg/L、 激動素 0. 05mg/L-0. 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. :3mg/L、葡萄糖為 25g/L_35g/L 或 25g/L 或 30g/L 或 35g/L ；所述誘導培養基中的所述2，4_D、所述吲哚乙酸和所述激動素的質量之比為 1:1:1;
所述誘導培養基的pH值為5. 6-6. 2或5. 6或5. 8或6. 2。本發明所提供的方法及其培養基尤其適用於陸地棉品種。本發明所提供的棉花體細胞再生方法及其培養基不受棉花基因型的限制；培養周期短，70天即可獲得再生棉花苗；胚性愈傷誘導率高，可達72. 14% ；體細胞胚胎發生率高， 可達47. 71%;成苗率高，可達18.本發明所提供的棉花體細胞再生方法及其培養基使棉花具高效獲得大量體細胞胚胎與植株再生的能力，從而為棉花的細胞工程、基因工程以及棉花遺傳改良等相關研究提供重要平臺。


圖1為珂字棉201固-液交替培養誘導體胚發生與植株再生過程。其中，A為愈傷誘導和增殖階段愈傷狀態；B為胚性愈傷誘導和增殖階段愈傷狀態；C為胚性愈傷組織懸浮細胞系預增殖的愈傷形態；D為胚性愈傷組織懸浮細胞增殖和體細胞胚胎發生階段愈傷及體胚形態，其中，a為增殖中胚性愈傷組織懸浮細胞形態，b為體胚發生過程中原胚的形態； E為體細胞胚胎發育階段體胚形態；F為從體細胞胚胎中獲得的再生植株。圖2為冀無2031固-液交替培養誘導體胚發生與植株再生過程。其中，A為愈傷誘導和增殖階段愈傷狀態；B為胚性愈傷誘導和增殖階段愈傷狀態；C為胚性愈傷組織懸浮細胞系預增殖的愈傷形態；D為胚性愈傷組織懸浮細胞增殖和體細胞胚胎發生階段愈傷及體胚形態，其中，a為增殖中胚性愈傷組織懸浮細胞形態，b為體胚發生過程中原胚的形態； E為體細胞胚胎發育階段形態；F為從體細胞胚胎中獲得的再生植株。圖3為農大58固-液交替培養誘導體胚發生與植株再生過程。其中，A為愈傷誘導和增殖階段愈傷狀態；B為胚性愈傷誘導和增殖階段愈傷狀態；C為胚性愈傷組織懸浮細胞系預增殖的愈傷形態；D為胚性愈傷組織懸浮細胞增殖和體細胞胚胎發生階段愈傷及體胚形態，其中，a為增殖中胚性愈傷組織懸浮細胞形態，b為體胚發生過程中原胚的形態；E 為體細胞胚胎發育階段形態；F為從體細胞胚胎中獲得的再生植株。
具體實施例方式下面以三個基因型的棉花品種為例，闡明本發明的技術方案。在本發明的第一個實施例中，棉花珂字棉201使用的成套培養基為培養基Al、 培養基 Bl 和培養基 Cl。其中，培養基 Al =NH4NO3 0. 825g/L、KNO3 3. 8g/L、KH2PO4 0. 17g/ L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H200. 25mg/L、 H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、 ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H2027. 8mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 IOOmg/ L、鹽酸硫胺素0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、吲哚丁酸0. :3mg/L、激動素 0. 05mg/L、葡萄糖 25g/L，植物凝膠 2. 4g/L 和水，ρΗ5· 6 ；培養基Bl =NH4NO3 0. 825g/L、KN03 3. 8g/L,KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 ·2Η20 0. 44g/L、 MgSO4 · 7Η20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、吲哚丁酸0. :3mg/L、激動素0. 05mg/L、葡萄糖25g/L、穀氨醯胺0. 3g/L、天冬氨酸0. 3g/L和水，ρΗ5· 6 ；培養基Cl =NH4NO3 0. 825g/L、KN03 3. 8g/L,KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 ·2Η20 0. 44g/L、 MgSO4 · 7Η20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、吲哚丁酸0. :3mg/L、激動素0. 05mg/L、葡萄糖25g/L、穀氨醯胺0. 3g/L、天冬氨酸0. 3g/L、植物凝膠2. 4g/L和水，pH5. 6 ；誘導培養基=NH4NO31. 65g/L、KNO3 1. 9g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/ L、MgS04.7H20 0.37g/L、KI 0. 83mg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuS04 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇 0. 5mg/L、甘氨酸 2. 0mg/L、2，4-D0. 05mg/L、吲哚乙酸 0. 05mg/L、激動素 0. 05mg/L、葡萄糖為25g/L、植物凝膠2. 4g/L和水，pH值為5. 6。利用上述成套培養基和誘導培養基按照包括如下步驟的方法將棉花愈傷組織培養成再生植株1)將在誘導培養基中形成的棉花愈傷組織在所述培養基Al中培養，獲得胚性愈傷組織；2)將所述步驟1)中獲得的所述胚性愈傷組織培養於所述培養基Bl中，獲得原胚；3)將所述步驟幻中獲得的所述原胚在所述培養基Cl中培養，獲得棉花再生植株。其中，在第一次懸浮培養和第二次懸浮培養的溫度、振蕩頻率、培養時間、光照條件如下23°C、70轉/分鐘振蕩(旋轉半徑為12mm)培養10天、每天M小時中光照14小時，光照強度為16001UX，其餘時間黑暗。轉接是將第一次懸浮培養得到的粒徑小於60目的愈傷組織接入所述培養基Bi。所述步驟1)和所述步驟幻的培養在如下條件進行23°C、每天M小時中光照14 小時，光照強度為16001UX，其餘時間黑暗。在本發明的第二個實施例中，棉花品種是冀無2031使用的成套培養基為培養基 Al、培養基 Bl 和培養基 Cl。其中，培養基 Al =NH4NO3 0. 825g/L、KNO3 3. 8g/L、KH2PO4O. 17g/ L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H200. 25mg/L、 H3BO 36. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、 ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H2027. 8mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 IOOmg/ L、鹽酸硫胺素0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、吲哚丁酸0. 6mg/L、激動素 0. 15mg/L、葡萄糖 30g/L，植物凝膠 2. 6g/L 和水，ρΗ5· 8 ；培養基Bl =NH4NO3 0. 825g/L、KN03 3. 8g/L,KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 ·2Η20 0. 44g/L、 MgSO4 · 7Η20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、吲哚丁酸0. 6mg/L、激動素0. 15mg/L、葡萄糖30g/L、穀氨醯胺0. 5g/L、天冬氨酸0. 5g/L和水，ρΗ5· 8 ；
培養基Cl =NH4NO3 0. 825g/L、KN03 3. 8g/L,KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 ·2Η20 0. 44g/L、 MgSO4 · 7Η20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、吲哚丁酸0. 6mg/L、激動素0. 15mg/L、葡萄糖30g/L、穀氨醯胺0. 5g/L、天冬氨酸0. 5g/L、植物凝膠2. 6g/L和水，pH5. 8 ；誘導培養基=NH4NO31. 65g/L、KNO3 1. 9g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/ L、MgS04.7H20 0.37g/L、KI 0. 83mg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuS04 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇 0. 5mg/L、甘氨酸 2. 0mg/L、2，4-D0. 15mg/L、吲哚乙酸 0. 15mg/L、激動素 0. 15mg/L、葡萄糖為30g/L、植物凝膠2. 6g/L和水，pH值為5. 8。利用上述成套培養基和誘導培養基按照包括如下步驟的方法將棉花愈傷組織培養成再生植株1)將在誘導培養基中形成的棉花愈傷組織在所述培養基Al中培養，獲得胚性愈傷組織；2)將所述步驟1)中獲得的所述胚性愈傷組織培養於所述培養基Bl中，獲得原胚；3)將所述步驟幻中獲得的所述原胚在所述培養基Cl中培養，獲得棉花再生植株。其中，第一次懸浮培養和第二次懸浮培養的溫度、振蕩頻率、培養時間、光照條件如下J6°C、100轉/分鐘振蕩(旋轉半徑為12mm)培養12天、每天M小時中光照16小時， 光照強度為16001UX，其餘時間黑暗。轉接是將第一次懸浮培養得到的粒徑小於60目的愈傷組織接入所述培養基Bi。所述步驟1)和所述步驟幻的培養在如下條件進行J6°C、光照條件為每天M小時中光照16小時，光照強度為16001UX，其餘時間黑暗。在本發明的第三個實施例中，棉花農大58使用的培養基為培養基Al、培養基Bl 和培養基 Cl。其中，培養基 Al :ΝΗ4Ν030 · 825g/L、KN03 3. 8g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、 CuSO4 ·5Η20 0. 025mg/L、MnS04 ·4Η20 22. 3mg/L、CoCl2 ·6Η200· 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/ L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、吲哚丁酸1. 0mg/L、激動素0. :3mg/L、葡萄糖 35g/L，植物凝膠 3. 0g/L 和水，ρΗ6· 2 ；培養基Bl =NH4NO3 0. 825g/L、KN03 3. 8g/L,KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 ·2Η20 0. 44g/L、 MgSO4 · 7Η20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、吲哚丁酸1. 0mg/L、激動素0. :3mg/L、葡萄糖35g/L、穀氨醯胺0. 7g/L、天冬氨酸0. 7g/L和水，ρΗ6· 2 ；培養基Cl =NH4NO3 0. 825g/L、KN03 3. 8g/L,KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 ·2Η20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、吲哚丁酸1. Omg/L、激動素0. :3mg/L、葡萄糖35g/L、穀氨醯胺0. 7g/L、天冬氨酸0. 7g/L、植物凝膠3. Og/L和水，ρΗ6· 2 ；誘導培養基NH4NO31. 65g/L、KNO3 1. 9g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/ L、MgS04.7H20 0.37g/L、KI 0. 83mg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuS04 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、2，4-D0. 3mg/L、吲哚乙酸0. 3mg/L、激動素0. 3mg/L、葡萄糖為35g/L、植物凝膠3. Og/L和水，pH值為6. 2。利用上述成套培養基和誘導培養基按照包括如下步驟的方法將棉花愈傷組織培養成再生植株1)將在誘導培養基中形成的棉花愈傷組織在所述培養基Al中培養，獲得胚性愈傷組織；2)將所述步驟1)中獲得的所述胚性愈傷組織培養於所述培養基Bl中，獲得原胚；3)將所述步驟幻中獲得的所述原胚在所述培養基Cl中培養，獲得棉花再生植株。其中，第一次懸浮培養和第二次懸浮培養的溫度、振蕩頻率、培養時間、光照條件如下30°C、130轉/分鐘振蕩(旋轉半徑為12mm)培養14天、每天M小時中光照18小時， 光照強度為16001UX，其餘時間黑暗。轉接是將第一次懸浮培養得到的粒徑小於60目的愈傷組織接入所述培養基Bi。所述步驟1)和所述步驟幻的培養在如下條件進行30°C、光照條件為每天M小時中光照18小時，光照強度為16001uX，其餘時間黑暗。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、高效獲得體細胞胚胎與再生植株(一)無菌子葉苗的獲得1、棉花種子的脫絨取50g棉花品種珂字棉201種子加15ml左右濃硫酸，快速攪動2_;3min，然後石灰水中和，不斷搓洗，流水衝洗10-iaiiin，獲得乾淨的脫絨種子。2、棉花種子的萌發將脫絨種子經0. 1% (w/v)HgCl2溶液消毒10分鐘，然後用滅菌水清洗種子5-6遍， 最後加入150ml滅菌水，28°C暗處萌發M小時，獲得萌發種子。3、棉花種子的發芽將萌發種子在無菌環境下剝去種殼，並將去種殼的棉花種胚種植於發芽培養基上，28°C暗培養6天，獲得無菌黃化子葉苗。發芽培養基為NH4NO30. 825g/L、KNO3 3. 8g/L、KH2PO4 0. 17g/L、 CaCl2 · 2Η200· 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、蔗糖 20g/L，瓊脂粉 7. 5g/L 和水，pH5. 8。
( 二)愈傷組織的誘導和增殖將珂字棉201無菌黃化子葉苗的下胚軸切成0. 5cm長度，接種於誘導培養基(培養皿直徑9cm，每皿含誘導培養基25ml，每皿接種8_10個下胚軸)23°C每天光照14小時，光照強度為1600LUX，培養30天(圖1-A)。按每10皿為一個重複統計，每個重複接種的下胚軸數目記為A，共設重複3個。誘導培養基的基礎培養基是MS基本培養基(表1)。向MS基本培養基中添加2， 4-D、吲哚乙酸(IAA)、激動素(KT)、葡萄糖和植物凝膠(phytagel)得到的固體培養基即為該誘導培養基。在該誘導培養基中，2，4-D、IAA和KT的濃度均為0. 05mg/L，葡萄糖的濃度為25g/L，植物凝膠的濃度為2. 4g/L。滅菌前調pH值為5. 6，115°C高壓滅菌20min。表1. MS基本培養基
權利要求
1.用於獲得棉花體細胞再生植株的成套培養基，由獨立包裝的培養基A、培養基B和培養基C組成；所述培養基A為由改良MS基本培養基、激素、葡萄糖和凝固劑組成的培養基；所述培養基B為由所述改良MS基本培養基、激素、葡萄糖和胺基酸添加物組成的培養基；所述培養基C為由所述改良MS基本培養基、激素、葡萄糖、胺基酸添加物和凝固劑組成的培養基；所述改良MS基本培養基由下述質量份的營養成分組成NH4NO3 825 份、KNO3 3800 份、KH2PO4 170 份、CaCl2 · 2H20 440 份和 MgSO4 · 7H20370 份； KI 0. 83 份、Na2MoO4 · 2H20 0. 25 份、H3BO3 6. 2 份、CuSO4 · 5H20 0. 025 份、MnSO4 · 4H20 22. 3 份、CoCl2 · 6H20 0. 025 份和 ZnSO4 · 4H20 8. 6 份；Na2EDTA 37. 3 份和 FeSO4 · 7H20 27. 8 份； 煙酸0. 5份、肌醇100份、鹽酸硫胺素0. 1份、鹽酸吡哆素0. 5份和甘氨酸2. 0份；所述激素為吲哚丁酸和激動素，所述吲哚丁酸和所述改良MS基本培養基在所述培養基A、培養基B和培養基C中的配比滿足0. 3份-1. 0份所述吲哚丁酸/825份NH4NO3 ；所述激動素和所述改良MS基本培養基在所述培養基A、培養基B和培養基C中的配比滿足0. 05 份-0. 3份所述激動素/825份NH4NO3 ；所述吲哚丁酸與所述激動素在所述培養基A、培養基 B和培養基C中的質量份之比均為(7.00-3.00) 1 ；所述葡萄糖和所述改良MS基本培養基在所述培養基A、培養基B和培養基C中的配比滿足25000份-35000份所述葡萄糖/825份NH4NO3 ；所述胺基酸添加物為穀氨醯胺和天冬氨酸，所述穀氨醯胺和所述改良MS基本培養基在所述培養基B和培養基C中的配比滿足300份-700份所述穀氨醯胺/825份NH4NO3 ；所述天冬氨酸和所述改良MS基本培養基在所述培養基B和培養基C中的配比滿足300份-700 份所述天冬氨酸/825份NH4NO315
2.用於獲得棉花體細胞再生植株的成套培養基，由獨立包裝的培養基Al、培養基Bl和培養基Cl組成；所述培養基Al為向液體培養基D中加入凝固劑得到的固體培養基；所述液體培養基D由溶質和溶劑組成，所述溶劑為水，所述溶質的濃度如下=NH4NO3 0. 825g/L、 KNO3 3. 8g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H200. 37g/L、KI 0. 83mg/L、 Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H200. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、 CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、 煙酸0. 5mg/L、肌醇100mg/L、鹽酸硫胺素0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、吲哚丁酸 0. 3mg/L-l. Omg/L 或 0. 3mg/L 或 0. 6mg/L 或 1. Omg/L、激動素 0. 05mg/L_0· 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. 3mg/L、葡萄糖為 25g/L_35g/L 或 25g/L 或 30g/L 或 35g/L ；所述培養基Bl為液體培養基，由溶質和溶劑組成，所述溶劑為水，所述溶質的濃度如下NH4N03 0 . 8 2 5g/L、KNO3 3. 8g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、 MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/ L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇 0. 5mg/L、甘氨酸 2. Omg/L、吲哚丁酸 0. 3mg/L_l. Omg/L 或 0. 3mg/L 或 0. 6mg/L 或 1. Omg/L、 激動素 0. 05mg/L-0. 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. :3mg/L、葡萄糖為 25g/L_35g/L 或25g/L 或 30g/L 或 35g/L、穀氨醯胺 0. 3g/L_0. 7g/L 或 0. 3g/L 或 0. 5g/L 或 0. 7g/L 和天冬氨酸 0. 3g/L-0. 7g/L 或 0. 3g/L 或 0. 5g/L 或 0. 7g/L ；所述培養基Cl為向液體培養基E中加入凝固劑得到的固體培養基；所述液體培養基 E由溶質和溶劑組成，所述溶劑為水，所述溶質的濃度如下=NH4NO3 0. 825g/L、KN03 3. 8g/L、 KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KIO. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、煙酸 0. 5mg/L、 肌醇100mg/L、鹽酸硫胺素0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、吲哚丁酸0. 3mg/ L-l. Omg/L 或 0. 3mg/L 或 0. 6mg/L 或 1. Omg/L、激動素 0. 05mg/L_0· 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. 3mg/L、葡萄糖為 25g/L_35g/L 或 25g/L 或 30g/L 或 35g/L、穀氨醯胺 0. 3g/ L-0. 7g/L 或 0. 3g/L 或 0. 5g/L 或 0. 7g/L 和天冬氨酸 0. 3g/L_0. 7g/L 或 0. 3g/L 或 0. 5g/L 或 0. 7g/L ；所述吲哚丁酸與所述激動素在所述培養基D、所述培養基Bi、所述培養基E、所述培養基Al和所述培養基Cl中的質量比為(7.00-3.00) 1。
3.根據權利要求2所述的成套培養基，其特徵在於所述培養基D、所述培養基Bi、所述培養基E、所述培養基Al和所述培養基Cl的pH值均為5. 6-6. 2或5. 6或5. 8或6. 2 ；所述凝固劑為植物凝膠，所述植物凝膠在所述培養基Al和所述培養基Cl中的濃度均為 2. 4g/L-3. 0g/L 或 2. 4g/L 或 2. 6g/L 或 3. 0g/L。
4.利用權利要求2或3所述的成套培養基按照包括如下步驟的方法將棉花愈傷組織培養成再生植株1)將棉花愈傷組織在所述培養基Al中培養，獲得胚性愈傷組織；2)將所述步驟1)中獲得的所述胚性愈傷組織培養於所述培養基Bl中，獲得原胚；3)將所述步驟幻中獲得的所述原胚在所述培養基Cl中培養，獲得棉花再生植株。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述步驟2、包括如下步驟將所述步驟 1)中獲得的所述胚性愈傷組織在所述培養基Bl中進行第一次懸浮培養，使所述胚性愈傷組織增殖，再轉接入所述培養基Bl中進行第二次懸浮培養，得到所述原胚。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述步驟幻中，所述第一次懸浮培養和所述第二次懸浮培養的溫度、振蕩頻率和培養時間如下23-30°C、70-130轉/分鐘、振蕩培養10-14天。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特徵在於所述第一次懸浮培養和所述第二次懸浮培養的光照條件為每天M小時中光照14-18小時，其餘時間黑暗。
8.根據權利要求5-7中任一所述的方法，其特徵在於所述轉接是將第一次懸浮培養得到的粒徑小於50目的愈傷組織接入所述培養基Bi。
9.根據權利要求5-8中任一所述的方法，其特徵在於所述步驟1)的培養在如下條件進行23-30°C、光照條件為每天M小時中光照14-18 小時，其餘時間黑暗；所述步驟幻的培養在如下條件進行23-30°C、光照條件為每天M小時中光照14-18 小時，其餘時間黑暗。
10.根據權利要求4-9中任一所述方法，其特徵在於所述棉花愈傷組織是通過如下誘導培養基培養棉花子葉苗的下胚軸得到的向液體培養基F中加入凝固劑得到的固體培養基；所述液體培養基F由溶質和溶劑組成，所述溶劑為水，所述溶質的濃度如下=NH4NO3 1. 65g/L、KNO3 1. 9g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、 CuSO4 ·5Η20 0. 025mg/L、MnS04 ·4Η20 22. 3mg/L、CoCl2 ·6Η200· 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/ L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇 0. 5mg/L、甘氨酸 2. 0mg/L、2，4_D 0. 05mg/L_0· 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. 3mg/L、吲哚乙酸 0. 05mg/L_0. 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. 3mg/L、 激動素 0. 05mg/L-0. 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. :3mg/L、葡萄糖為 25g/L_35g/L 或 25g/L 或 30g/L 或 35g/L ；所述誘導培養基中的所述2，4-D、所述吲哚乙酸和所述激動素的質量之比為 1:1:1;所述誘導培養基的PH值為5. 6-6. 2或5. 6或5. 8或6. 2。
全文摘要
本發明公開了一種高效誘導棉花體胚發生與植株再生的方法及其培養基。本發明的培養基為用於棉花體細胞再生植株的成套培養基，由培養基A、培養基B和培養基C組成，所述培養基A由改良MS基本培養基、激素、葡萄糖和凝固劑組成；所述培養基B由改良MS基本培養基、激素、葡萄糖和胺基酸添加物組成；所述培養基C由改良MS基本培養基、激素、葡萄糖、胺基酸添加物和凝固劑組成；本發明的方法是使用所述成套培養基，將棉花愈傷組織培養成再生植株的方法。本發明不受棉花基因型的限制，且培養周期短、重複性高，使棉花具高效獲得大量體細胞胚胎與植株再生的能力，從而為棉花的細胞工程、基因工程以及棉花遺傳改良等相關研究提供重要平臺。
文檔編號A01H4/00GK102405835SQ20111024320
公開日2012年4月11日 申請日期2011年8月23日 優先權日2011年8月23日
發明者劉正杰, 華金平, 張園, 王彥霞, 王玉美 申請人:中國農業大學