分泌高水平必需胺基酸的耐膽汁芽孢桿菌組合物的製作方法

2023-08-05 04:59:26 1

專利名稱：分泌高水平必需胺基酸的耐膽汁芽孢桿菌組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種芽孢桿菌組合物，其特徵在於在膽汁鹽(模擬的腸道環境)中快速出芽和生長以及分泌高水平的必需胺基酸。該芽孢桿菌組合物可用作動物飼料補充劑， 在飼料中其具有益生(健康促進)作用並增加動物飼料中營養的消化和可利用度。
背景技術：
益生菌諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢桿菌 (Bacilluslicheniformis)在動物飼料工業中用作膳食補充劑。其使用與芽孢桿菌代替或減少在動物飼料工業中用作生長促進劑的抗生素的使用的能力有關。Christian Hansen A/S (丹麥)將此益生的生長促進產品的一個實例以商品名 GalliPro (保藏號為DSM 17231)實現商業化。GalliPro 為枯草芽孢桿菌孢子細胞組合物。除了推薦的作用方式以外(例如，免疫調節、腸道菌群調節劑)，益生的芽孢桿菌能夠產生許多有益的成分，諸如酶類，當其用作動物飼料補充劑時酶類被分泌至胃腸道 (GIT)中。諸如植酸酶的酶類被分泌並改善動物飼料的消化和較好的攝取(更高的消化率)。膳食(飼料)主要為植物來源諸如穀物、玉米、大豆、豆油和胺基酸。所有這些作用都有利於生產低成本的動物產品。益生芽孢桿菌(probiotic bacillus)也能夠產生其他有益的成分諸如必需胺基酸。芽孢桿菌孢子可通過酸性胃屏障，並在動物的胃腸道(GIT)內出芽和生長。此特性具有很大的優點，因為當被攝入時，它們可分泌許多類型的有益成分，例如，細菌素，並且還分泌有用的必需胺基酸。而且，在飼料粒化過程中，芽孢桿菌孢子是耐熱的，因此其是使細菌素和例如必需胺基酸都進入GIT (胃腸道)的優異的遞送系統。在芽孢桿菌在胃腸道中的生存和增殖過程中，膽汁的作用很重要。膽汁在肝臟中產生並儲存在膽囊中。膽汁含有水、卵磷脂、膽紅素和膽綠素以及膽汁鹽。從文獻中知道，膽汁對芽孢桿菌孢子細胞在動物胃腸道中的生存以及出芽並生長為營養細胞具有一些負面影響。因此正在進行研究以找到益生的耐膽汁的芽孢桿菌菌株。文章(Antonie Van Leeuwenhoek. 2006Aug ；90 (2) :139-46. Epub 2006 年 7 月 4 日)說明了直接從雞腸中分離許多芽孢桿菌標本/細胞。檢測分離的芽孢桿菌細胞的益生活性。檢測具有最高益生活性的6種芽孢桿菌的耐膽汁鹽性，並且發現一株特定的高益生性的芽孢桿菌具有相對高水平的耐膽汁鹽性。在此文章中沒有特別地將重點集中在檢測耐膽汁性的任何時段。在實驗部分， 僅在膽汁鹽存在5天後檢測了芽孢桿菌孢子細胞的耐受性(見141頁的段落「Simulated small intestinal fluid tolerance test」( 「模擬的小腸液耐受試驗」))。US2003/0124104A說明了益生的常規芽孢桿菌內生孢子對低濃度的膽汁鹽敏感， 即，甚至低濃度的膽汁鹽的存在都會抑制孢子出芽和/或再水化。這與其他細菌諸如腸道病原體，諸如大腸桿菌或金黃色葡萄球菌相反(見段落W014]至W015])。就此而言，建議篩選/選擇對膽汁鹽的抑制性活性具有抗性並因此能出芽成為營養細胞，然後在結腸定植的芽孢桿菌孢子(見W019])。在該說明書中提供的都是工作實施例，沒有提供實際篩選的具體芽孢桿菌細胞的真實試驗數據。此外，膽汁鹽篩選條件的說明是相對概括的。具體地，沒有指出選擇耐膽汁性的任何時段。換句話說，基於此文獻的粗略或概括性的說明，可選擇僅可緩慢生長(出芽)的芽孢桿菌細胞，即，能夠在相應量的膽汁鹽的存在下在例如20小時後從孢子出芽成為營養細胞的芽孢桿菌細胞。在此文獻中，沒有對選擇快速生長(出芽)的芽孢桿菌細胞，即，能夠在相應量的膽汁鹽的存在下在特定時間間隔內達到規定生長點的從孢子出芽並生長為營養細胞的芽孢桿菌細胞有任何描述或建議。總之，關於耐膽汁芽孢桿菌細胞的選擇/篩選的現有技術參考文獻沒有集中在從孢子細胞快速生長/出芽成為芽孢桿菌營養細胞。申請號為PCT/EP2008/057296的國際PCT申請於11/06/2008提交。申請人為Chr. Hansen A/S且該申請在本申請的申請日時沒有公開。PCT/EP2008/057296描述了新的芽孢桿菌孢子，其特徵在於在膽汁鹽培養基的存在下其具有增加的/快速的從孢子出芽和生長為營養細胞的速度。本文所述的芽孢桿菌孢子具有如PCT/EP2008/057296中所述同樣的增加的/快速的從孢子出芽和生長為營養細胞的速度。PCT/EP2008/057296僅描述了與參照芽孢桿菌細胞DSM 19467相比產生增加量的植酸酶的芽孢桿菌營養細胞。沒有記載且沒有提示篩選與參照芽孢桿菌細胞DSM 19467相比產生較多量的必需胺基酸的芽孢桿菌營養細胞。當下面的描述提及現有技術時，其應當被理解為在本申請的申請日時公眾可以獲得的現有技術(例如，發表的文章/公布的專利)。

發明內容
本發明要解決的問題是提供一種芽孢桿菌組合物，其在動物的胃腸道(GIT)中分
泌大量的必需胺基酸。該技術方案基於本發明人已經開發了一種用於鑑定的新的改良芽孢桿菌組合物的新選擇方法。本文所述的新選擇方法的新的重要步驟是特異地篩選/選擇在膽汁鹽的存在下具有增加的/快速的從孢子出芽並生長為營養細胞的速度的芽孢桿菌孢子細胞。如上所述，現有技術已經說明了用於篩選能夠在膽汁鹽的存在下生長的芽孢桿菌的方法，但現有技術的篩選/選擇方法沒有將重點集中於在膽汁鹽的存在下出芽並生長的速度。因此，現有技術中篩選的耐膽汁細胞出芽並生長不足以快到符合本文所述出芽並生長的速度標準。例如，在腸道環境中從例如雞腸中直接分離的芽孢桿菌細胞(如，例如在上面討論的Antonie Van Leeuwenhoek的文章中所述)沒有被選擇(在常壓下)為在腸內快速地出芽並生長。
如在本文中的工作實施例中所示，對於市售的芽孢桿菌組合物GalliPro 也是如此，在生理水平的膽汁鹽的存在下，其出芽和生長太緩慢，並在第一個20小時內不能達到規定的生長點，不符合本文所述的出芽並生長的速度標準。GalliPro .是在商業上成功的一種枯草芽孢桿菌組合物。通過使用GalliPro 作為起始菌株以及如本文所述的選擇壓力法和隨後的分離在膽汁鹽的存在下快速地從孢子出芽並生長成為營養細胞的菌株而選擇了本文所述的新的DSM 19467。進一步的細節見表1 (在本文中GalliPro 也可稱為DSM 17231)。在本文的圖1中對此進行了示意性地圖示。總之，相信現有技術中沒有說明一種分離的芽孢桿菌組合物，其包括IO5-IO12CFU/ g芽孢桿菌細胞，其中所述芽孢桿菌組合物的細胞符合如本文所述的在膽汁鹽的存在下快速出芽並生長的標準。不限於理論，本發明人已經鑑定出快速出芽和生長是本發明的一個非常重要的方面，因為芽孢桿菌孢子對膽汁有耐受性，但不能足夠快速的出芽和生長，會在芽孢桿菌營養細胞大量產生任何顯著的積極特性諸如產生必需胺基酸之前被排洩掉。出芽太緩慢的芽孢桿菌孢子在細菌可產生任何大量的例如必需胺基酸之前僅僅通過胃腸道(GIT)。在進行了大量詳盡的試驗和分析後，本發明人因此選擇在最多達20小時的時間範圍進行工作，並且選擇在此時段內在很高的生理濃度的膽汁鹽的存在下最快出芽和生長的孢子。不限於理論並基於本文詳細公開的試驗工作，本發明人已經鑑定出在4和6mM膽汁鹽的存在下，分別在第一個18和19小時內快速出芽和生長是很重要的。本發明人然後鑑定出一旦選擇出在膽汁鹽培養基中快速出芽和生長的芽孢桿菌細胞，這些細胞非常有用的用作起始細胞用於突變以獲得具有提高的必需胺基酸產量的新細胞。如在圖1和實施例4中示意性圖示的那樣，快速生長的耐膽汁選擇株DSM 19467 用作起始菌株用於典型突變，並且選擇出高必需胺基酸產量的菌株。在實施例4中可以看出，一些選擇株產生的必需胺基酸亮氨酸是DSM 19467和GalliPro 的至少5倍多。由此本文公開的新的益生芽孢桿菌細胞是一種耐膽汁的，快速出芽和生長的，並且分泌大量必需胺基酸的芽孢桿菌細胞。獲得的菌株非常有用的用作添加至動物飼料中的益生芽孢桿菌組合物。其綜合了益生菌在動物的腸道(存在高膽汁鹽水平)中生存和增殖， 抑制病原菌(產生細菌素)，並另外地分泌大量有益的必需胺基酸的所有有益能力。因此，本發明的第一個方面涉及一種芽孢桿菌組合物，其包含105_1012CFU/g芽孢桿菌孢子細胞，其中芽孢桿菌組合物的特徵在於(i)芽孢桿菌孢子在包含4和6mM膽汁鹽的膽汁鹽培養基的存在下從孢子快速出芽和生長為營養細胞，其中快速出芽和生長定義為芽孢桿菌孢子分別在小於18小時和19 小時內達到0. 40D630的營養細胞生長點，其中營養細胞生長點是生長曲線中OD值開始以連續的方式增加(由營養細胞的生長所引起)並達到0D630為0. 4的點；(I)其中膽汁鹽培養基是本文實施例1的補充了膽汁鹽混合物的標準已知非選擇性小牛肉浸出液肉湯(VIB)培養基，所述膽汁鹽混合物包括結合型膽汁鹽牛磺脫氧膽酸鹽和甘氨脫氧膽酸鹽以及去結合型膽汁鹽脫氧膽酸鹽，其比例為60%的牛磺脫氧膽酸鹽、 30%的甘氨脫氧膽酸鹽和10%的脫氧膽酸鹽；以及
其中OD測定分析通過下列步驟進行(a)在微量滴定板的孔內裝入0. 150ml的每ml培養基IO8芽孢桿菌孢子的膽汁鹽培養基(S卩，此為零時刻)；以及(b)將滴定板在37°C下在大氣條件下孵育，使用分光光度計測定OD63tl值並在每次讀數之前攪動，從而獲得代表性的隨時間變化的生長曲線；以及(ii)芽孢桿菌營養細胞產生至少一種必需胺基酸的量高於參照芽孢桿菌細胞DSM 19467，其中產生的必需胺基酸的量在本文實施例2的標準已知低鹽生長培養基 (Minimal Salts Growth Medium)中在37°C下生長2天後通過本文實施例2的基於標準 GC-MS法的胺基酸測定法來測定。如上所述，通過使用GalliPro 作為起始菌株選擇在膽汁鹽的存在下的快速出芽和生長的參照芽孢桿菌細胞DSM 19467。未選擇出DSM 19467的必需胺基酸產量有提高。 不限於理論，相信DSM 19467的與本文相關的必需胺基酸產量與GalliPro ^B當。關於第(i)項，GalliPro 的營養細胞生長點為在4和6mM膽汁鹽中孵育後的至少 20小時，並且對於新的DSM 19467株，如本文所述，其營養細胞生長點在4和6mM膽汁鹽中分別在14和15小時後(見本文的圖2和工作實施例3)。在此要注意，本發明人還測試了市售產品CALSPORIN (Calpis Co.，Ltd.， 日本)以測定在第一方面的第(i)項的條件下的營養細胞生長點。如同GalliPro , 市售產品CALSPORIN 是用作益生飼料添加劑的一種枯草芽孢桿菌組合物。對於 CALSPORIN ,在第一方面的第(i)項的條件下的營養細胞生長點在4和6mM膽汁鹽中分別為20小時以上。這大大超過了在第⑴項中所需的18和19小時，並且此說明，迄今為止，沒有一種市售產品能被選擇用於快速出芽和生長。如上所述，「天然」芽孢桿菌細胞不能在任何選擇壓力下快速出芽和生長。不限於理論，因此相信「天然」芽孢桿菌細胞不符合第一方面的第(i)項的條件。[第⑴項]的耐膽汁性測定和[第(ii)項]的必需胺基酸測定都基於已知的市售的標準要素(諸如，例如，標準培養基、膽汁鹽；標準OD測定法和標準檢測)。參照芽孢桿菌細胞保藏為DSM 19467，因此是公眾可以得到的。枯草芽孢桿菌細胞GalliPro 保藏為DSM 17231 (命名為「GalliPro 」)，並且因此也是公眾可以獲得的。因此，基於本文詳細的測定說明(見，例如，本文實施例1的耐膽汁性測定和本文實施例2的必需胺基酸測定)，本領域技術人員能夠常規地重複這些測定以客觀地確定特定的目的芽孢桿菌細胞是否符合本發明的第一方面的[第(i)項]的耐膽汁性和[第(ii) 項]的必需胺基酸水平。如本文所述的新芽孢桿菌組合物可用作動物飼料的益生補充劑。劑量和施用可根據本領域，例如現有技術GalliPro 芽孢桿菌組合物所採用的方案來進行。因此，本發明的第二方面涉及一種飼養動物的方法，包括將第一方面和本文所述的相關實施方案的芽孢桿菌組合物連同其他動物飼料成分給予動物。本發明的第三方面涉及一種篩選和分離新芽孢桿菌細胞的方法，包括下列步驟(a):從單芽孢桿菌孢子細胞的集合體內篩選並分離出新芽孢桿菌孢子細胞，該新芽孢桿菌孢子細胞能夠快速地出芽和生長，使得其在第一方面的第(i)項的條件下在小於 18和19小時內達到營養細胞生長點；(b)從步驟(a)的分離孢子細胞製備芽孢桿菌營養細胞，並且將選擇和分離的新細胞突變以得到新芽孢桿菌單營養細胞的集合體；(c)從步驟(b)的新芽孢桿菌單營養細胞的集合體中選擇和分離能夠在第一方面的第(ii)項的條件下比參照芽孢桿菌細胞DSM 19467產生更高量的至少一種必需胺基酸的新芽孢桿菌營養細胞；以及(d)分析步驟(C)的高產的芽孢桿菌營養細胞以確認其保持了步驟(a)的快速的出芽和生長，並分離所述被選擇的細胞。對於本領域技術人員顯而易見的是，一旦本發明人在本文中公開了相關的檢測測定法(特別是實施例1的用於檢測快速出芽和生長的測定法)加上參照菌株DSM 19467，對於本領域技術人員來說，選擇符合本文第一方面的標準的其他新的芽孢桿菌細胞將是常規的工作。如本文所討論的，通過使用如本文所述的新的篩選/選擇方法，本發明人已經選擇和分離了許多新的改良芽孢桿菌細胞。下面僅通過實施例說明本發明的實施方案。定義本文相關術語的所有定義均與本文相關技術內容所屬領域的本領域技術人員所
理解的一致。本文中術語「芽孢桿菌細胞」是指芽孢桿菌孢子細胞和芽孢桿菌營養細胞。關於芽孢桿菌孢子細胞，本文中術語「芽孢桿菌孢子」所指的孢子根據本領域其特徵可以是由芽孢桿菌產生的休眠的、堅韌的、非生殖的結構。孢子的主要功能通常是在環境應激期間確保細菌的生存。因此它們對紫外線和Y射線照射、乾燥、溶菌酶、溫度、飢餓和化學消毒劑有耐受性。孢子通常見於土壤和水中，它們在此可以生存很長的時間。孢子殼對許多毒性分子不通透，並且還含有參與出芽的酶類。核心具有正常的細胞結構，諸如DNA和核糖體，但是代謝不活躍的。當細菌檢測到環境條件變得不利時，它可啟動孢子形成過程， 需要大約8小時。術語「芽孢桿菌營養細胞」是指功能性營養芽孢桿菌細胞，其可分裂產生更多的營養細胞。術語「出芽和生長」是指芽孢桿菌孢子出芽並生長為芽孢桿菌營養細胞。如本領域技術人員所公知的那樣，當條件有利時發生孢子的復活，並涉及出芽和生長。出芽是指休眠孢子開啟代謝活性並由此打斷休眠。其普遍的特徵在於孢子殼的破裂或吸收，孢子的腫脹，代謝活性的增加，以及對環境應激的耐受性喪失。生長在出芽之後發生，並涉及孢子核心製造新的化學成分並脫離老的孢子殼以發育成為功能性營養細菌細胞，該營養細胞分裂以產生更多的細胞。細菌細胞的生長曲線(0D隨時間變化)顯示不同的生長期。當孢子被轉移至富營養培養基中時，開始出芽，緊接著OD暫時下降(I期)，這是由於吡啶二羧酸的釋放以及因此孢子殼的水合作用而造成的。在第二期(II期=生長期)中，有一個時期OD的變化相對小，直至孢子發育成為功能性營養細菌細胞，該營養細胞可分裂以產生更多的細胞，從而使
8OD值連續增加。當OD值開始持續增加達到0. 4的OD時的點，在本文中被稱為「營養細胞生長點」。術語「光密度」被定義為使用分光光度計測定吸光度的指標。光密度(OD)是光學元件對給定波長λ每單位距離的吸光度。如果，例如，OD在波長630nm下測定，則其可稱為 OD630。


圖1 在此圖中，圖示了得到本文的新的改良株的步驟。本文的工作實施例從DSM 17231 (GalliPro )開始，其被典型地突變並篩選/選擇在膽汁鹽的存在下快速出芽並生長以得到新的選擇株DSM 19467。DSM 19467用作用於典型突變的起始菌株，並選擇高必需氨
基酸產量的菌株。圖加和2b 這些圖清楚地顯示與DSM 17231相比，在如本文所述的4和6mM膽汁鹽的存在下，本發明的DSM 19647芽孢桿菌孢子較快地出芽和生長。
具體實施例方式芽孢桿菌組合物術語「芽孢桿菌組合物」應該根據本領域進行理解。在本文中其被理解為包括許多具有目的特性的芽孢桿菌孢子細胞的芽孢桿菌組合物。芽孢桿菌組合物可包含不同類型的芽孢桿菌細胞(例如，枯草芽孢桿菌 (B. subtilis)和地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。本質上，該組合物應當簡單地包括一定量的本文第一方面中指定的芽孢桿菌孢子細胞，其中所述芽孢桿菌細胞符合第一方面中指定的標準。如本領域技術人員所公知的，本文中市售的相關芽孢桿菌孢子細胞組合物通常通過發酵來製備。獲得的孢子細胞通過被濃縮、乾燥、與載體混合併被包裝在合適的容器中。組合物的適當的，例如，105-1012CFU/g芽孢桿菌細胞可以本領域技術人員所公知的市售的適當形式存在。因此，在一個實施方案中，組合物的105_1012CFU/g芽孢桿菌孢子細胞作為乾燥的 (例如，噴霧乾燥的)細胞或作為冷凍的孢子細胞存在。在一個優選的實施方案中，芽孢桿菌組合物包括106_1012CFU/g芽孢桿菌孢子細胞，更優選107-1012CFU/g芽孢桿菌孢子細胞。術語「CFU/g」是指組合物中諸如包括存在的合適的相關添加劑的組合物的克重量。其不包括用來包裝芽孢桿菌組合物的合適容器的重量。一個實施方案涉及芽孢桿菌組合物被包裝在合適的容器中。如本領域技術人員所公知的，市售的相關細菌組合物通常還包括其他相關的添加劑諸如，例如，屬於乳清、乳清滲透物、碳酸鈣/石灰石和防結塊劑諸如矽酸鋁和硅藻土的一種載體/成分。除了本文的相關芽孢桿菌細胞以外，組合物還包含其他相關的目的微生物，諸如， 例如，目的乳酸菌。芽孢桿菌細胞
芽孢桿菌細胞可以是任何相關的目的芽孢桿菌細胞。在一個優選的實施方案中，芽孢桿菌細胞是選自下列芽孢桿菌種的至少一種芽孢桿菌細胞枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、單鞭毛枯草芽孢桿菌(Bacillus uniflagellatus)，側孢芽孢桿菌(Bacillus laterosporus)、側孢芽孢桿菌B0D、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus sterothermophilus)、凝固芽胞桿菌(Bacillus coagulans)、嗜熱芽孢桿菌(Bacillus thermophilus)、蕈狀芽孢桿菌(Bacillus mycoides)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)和環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)。在一個更優選的實施方案中，芽孢桿菌細胞是枯草芽孢桿菌細胞或地衣芽孢桿菌細胞。最優選的是其中芽孢桿菌細胞是枯草桿菌細胞。辦棚日龍丨屮擺·如上所述，第一方面的第(i)項的耐膽汁性測定基於已知的市售標準要素(諸如， 例如，標準培養基、膽汁鹽；標準OD測定法)。因此，基於本文詳細的測定說明(見，例如本文的實施例1)，本領域技術人員能夠常規地重複該測定以客觀地確定特定的目的芽孢桿菌孢子細胞是否符合如第(i)項中所述的從孢子快速出芽並生長為營養細胞的標準。在第(i)項中，解釋了營養細胞生長點是在生長曲線中從對應於0.2-0. 3左右的 OD的IO8孢子/ml開始直至OD值已經以連續方式增加(由於營養細胞的生長所引起)，並達到OD 0.4的點。如本文所解釋的，其與本領域技術人員如何理解此營養細胞生長點一致， 並基於生長曲線，本領域技術人員可常規地確定此生長點，在約士30分鐘的有限誤差範圍內。本文的工作實施例1提供了適於選擇在膽汁鹽的存在下快速出芽和生長的耐膽汁性測定的詳細描述。此實施例1的詳細條件是確定目的芽孢桿菌孢子細胞是否符合第一方面的第(i)項的標準的優選測定法。術語「膽汁鹽」是指膽汁酸的鹽。膽汁酸是主要在哺乳動物的膽汁中發現的類固醇酸。它們通過膽固醇的氧化在肝內產生，並儲存在膽囊中並以鹽的形式分泌至腸內。它們用作表面活性劑、乳化脂質並協助其吸收和消化。模擬豬膽汁鹽的生理濃度和組合物製備用於實施例1中的膽汁鹽。如本領域技術人員所公知的，與鳥類膽汁鹽組合物相比，豬膽汁鹽組合物在本文中可被認為是相對「苛刻」的條件。術語「膽汁鹽培養基」是指包含相關的芽孢桿菌生長成分諸如相關的養分和膽汁鹽的培養基。營養細胞生長點-在膽汁鹽測定中-第一方面的第(i)項如上所述，關於第一方面的第(i)項，如本文所述，芽孢桿菌孢子細胞從孢子出芽並生長成為營養細胞的速度很快使得它們在4和6mM膽汁鹽中分別在少於18和19小時內達到0. 40D的營養細胞生長點。如上所述，新的DSM 19467株在4和6mM膽汁鹽中分別在孵育14和15小時後達到營養細胞生長點。因此，在優選的實施方案中，在第一方面的第(i)項的條件下，芽孢桿菌孢子在4 和6mM膽汁鹽中分別在孵育17和18小時後達到營養細胞生長點，更優選在第一方面的第 ⑴項的條件下，芽孢桿菌孢子在4和6mM膽汁鹽中在孵育15和16小時後達到營養細胞生 "be 點 ο如上所解釋以及在圖1中示意性的顯示，本文所述的新的DSM 19467株是通過使用市售的GalliPro 作為起始菌株如本文所述在膽汁鹽的存在下進行突變並選擇快速的生長而被選擇。 GalliPro 是一種包含枯草芽孢桿菌細胞的組合物，並且該枯草芽孢桿菌被保藏為DSM 17231。因此，在本文中GalliPro 可被看作是參照菌株。如上所述，GalliPro 的營養細胞生長起始點為在第一方面的第(i)項的條件下在4和6mM膽汁鹽中孵育20小時後。因此，在一個實施方案中，在第一方面的第(i)項的條件下，芽孢桿菌孢子比保藏為DSM 17231 ( 「GalliPro 」)的參照枯草芽孢桿菌孢子細胞早至少3小時達到營養細胞生長點，更優選在第一方面的第(i)項的條件下，芽孢桿菌孢子比保藏為DSM 17231 (「GalliPro 」)的參照枯草芽孢桿菌孢子細胞早至少4小時達到營養細胞生長點，且最優選在第一方面的第(i)項的條件下，芽孢桿菌孢子比保藏為DSM 17231 (「GalliPro 」)的參照枯草芽孢桿菌孢子細胞早至少5小時達到營養細胞生長起始點ο必需胺基酸如本領域技術人員知曉的那樣，必需胺基酸可以是選自由下列組成的組的必需胺基酸苯丙氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、色氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、組氨酸和精氨酸。在優選的實施方案中，必需胺基酸是選自由下列組成的組的至少一種必需胺基酸苯丙氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、色氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和賴氨酸。在更優選的實施方案中，必需胺基酸是選自由下列組成的組的至少一種必需胺基酸纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸。一種與本文非常相關的必需胺基酸是亮氨酸。如本領域技術人員所理解的，芽孢桿菌營養細胞可以產生較高量的多於一種的必需胺基酸，諸如，例如，較高量的兩種或三種或更多種不同的必需胺基酸。胺基酸測定如上所述，第一方面的第(ii)項的胺基酸測定基於標準已知的市售要素(諸如， 例如，標準培養基，標準檢測)。因此，基於本文詳細的測定說明(見，例如，本文的實施例幻，本領域技術人員能夠常規地重複該測定以客觀地確定特定的目的芽孢桿菌營養細胞是否符合如第(ii)項中所述的必需胺基酸產生量。本文的工作實施例2提供了必需胺基酸測定的詳細描述。此實施例2的詳細條件在本文中是優選的必需胺基酸測定以確定目的芽孢桿菌營養細胞是否符合第一方面的第(ii)項的標準。- m-^mmm ( )工頁
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關於第一方面的第(ii)項，在第一方面的第(ii)項的條件下，芽孢桿菌營養細胞優選比參照芽孢桿菌細胞DSM 19467產生多至少2倍量的一種必需胺基酸。在關於第一方面的第(ii)項的更優選實施方案中，在第一方面的第(ii)項的條件下，芽孢桿菌營養細胞優選比參照芽孢桿菌細胞DSM 19467產生多至少4倍量的一種必
需胺基酸。鮮賄斬好· /會合狗力_誠如上所述，本發明的第二方面涉及一種飼養動物的方法，包括將第一方面和本文所述的相關實施方案的芽孢桿菌組合物連同其他動物飼料成分給予動物。動物可以是任意的目的動物。優選地，動物是選自家禽、反芻動物、牛、豬、兔、馬、 魚和寵物的動物。當給予根據本領域的GalliPro 時，正常以約l04-l08CFU/g飼料，通常以一餐 105-106CFU/g飼料的劑量或以與正常攝食量/kg動物活重相當的劑量完成。可選地，芽孢桿菌孢子可以下列方式之一給予動物(1)將其放入動物飲用水中；O):噴霧至動物體表；或(3)經糊劑、凝膠或大丸劑應用。篩詵和分離新的芽孢桿菌細胞的方法如上所述，第三方面涉及篩選和分離新的芽孢桿菌細胞的方法。在第三方面的方法中，選擇能夠滿足第一方面的第(i)項和第(ii)項的條件的芽孢桿菌細胞。如本領域技術人員所理解的，本文詳述的具體的耐膽汁性和必需胺基酸量測定 (見，例如，本文的用於耐膽汁性測定的實施例1和本文的用於必需胺基酸測定的實施例2) 參數可被改變成替代的篩選方法，該方法仍然能獲得如本文所述的主要目標，即，能夠滿足第一方面的第(i)項和第(ii)項的條件的芽孢桿菌細胞。在優選的實施方案中，實施例1的耐膽汁性測定用於第三方面的篩選方法的步驟 (a)中，且實施例2的必需胺基酸測定用於第三方面的篩選方法的步驟(c)中。在第三方面的步驟(d)中，分離營養芽孢桿菌細胞。此營養芽孢桿菌細胞可用來製備芽孢桿菌孢子形式。因此，在一個實施方案中，緊接著第三方面的篩選方法之後是額外步驟(e)，其中步驟(d)的分離的芽孢桿菌營養細胞被發酵以製成IO5-IO12芽孢桿菌營養細胞，且這些 IO5-IO12芽孢桿菌營養細胞用來製成IO5-IO12芽孢桿菌孢子細胞，其被分離以得到芽孢桿菌組合物，該組合物包含105-1012CFU/g芽孢桿菌孢子細胞。步驟(e)的最終結果是新的芽孢桿菌組合物，該組合物包含105_1012CFU/g芽孢桿菌孢子細胞，並且其中芽孢桿菌細胞能夠滿足第一方面的第(i)項和第(ii)項的條件。因此，本發明的一個獨立的方面涉及一種芽孢桿菌組合物，該組合物包括 105-l(^CFU/g芽孢桿菌孢子細胞，並且其中芽孢桿菌細胞能夠滿足第一方面的第(i)項和第(ii)項的條件，該細胞可通過第三方面的篩選方法緊接著上述的額外步驟(f)而獲得。在第三方面的篩選方法的步驟(b)中，對以前選擇的耐膽汁芽孢桿菌細胞進行突變以在步驟(C)中選擇高必需胺基酸產量的細胞。如本領域技術人員所理解的，例如，此步驟可通過基因特異性交換的典型突變(例如通過化學處理或UV)以製成所謂的基因修飾生物(GMO)。保藏的菌株一株新枯草芽孢桿菌菌株的樣品已經被保藏在DSMZ(DeutSChe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschroder Weg lb, D_38124Braunschweig), 保藏號為DSM 19467，保藏日為2007年6月27日。已經在國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約的條件下進行了保藏。實施例實施例1 耐膽汁性測定培養基培養基為標準非選擇性市售培養基小牛肉浸出液肉湯(VIB) (Difco, 234420)。在本申請的申請日時，來自供應商BD Diagnostic Systems (www. bd. com)的產品目錄(「DifCoTM/BBLTM手冊)關於小牛肉浸出液肉湯是如此敘述的「來自瘦小牛肉和蛋白腖的浸出液提供小牛肉浸出液中的氮、微生物、碳和胺基酸。氯化鈉維持製劑的滲透壓平衡」；以及根據生產廠商的說明書通過下列步驟製備培養基將25g小牛肉浸出液肉湯粉懸浮在IL純水中(2. 5%溶液)，加熱並頻繁攪動，煮沸1分鐘以完全地溶解粉末。2. 5%小牛肉浸出液肉湯溶液每升包含瘦小牛肉，浸出液IOg月示蛋白腖IOg氯化鈉5g培養基被分配至無菌瓶中並在121°C下高壓滅菌15min。膽汁鹽溶液/培養基模擬豬膽汁中膽汁鹽的生理組成和濃度製備膽汁鹽混合物，且膽汁鹽溶解在如上製備的小牛肉浸出液肉湯培養基中以得到膽汁鹽的終濃度為8mM。結合型膽汁鹽為牛磺脫氧膽酸鹽(Sigma T-0875，美國)和甘氨脫氧膽酸鹽 (Sigma G-9910，美國)以及去結合型膽汁鹽脫氧膽酸鹽(Sigma D-5670美國)，且最終的 8mM混合膽汁鹽溶液含有60%牛磺脫氧膽酸鹽，30%甘氨脫氧膽酸鹽和10%脫氧膽酸鹽。 使用氫氧化鈉將溶液調節至PH 7. 4，然後在121°C下高壓滅菌15分鐘。將此製備的SmM膽汁鹽培養基稀釋以得到0、1、2、4、6和SmM的膽汁鹽濃度。膽汁鹽以濃縮形式加至小牛肉浸出液肉湯培養基中。因此，瘦小牛肉浸出液、月示蛋白腖和氯化鈉的最終量與在加入膽汁鹽之前的2. 5%小牛肉浸出液肉湯培養基基本相同。孢子混懸液為了區分營養細胞和孢子，並確保純孢子產品用於接種，使用在80°C下+/_熱處理IOmin測定芽孢桿菌產品的孢子計數。在熱處理並隨後冷卻至室溫後，在蛋白腖鹽水溶液中進行連續10倍稀釋。從適當的十倍稀釋液中取0. Iml接種至雙份的胰蛋白血瓊脂板 (Difco 0232-01)中。這些板在37°C下孵育至第二天。基於先前產品的孢子計數測定，在無菌蒸餾水中製備孢子混懸液以達到最終計算的孢子濃度108CFU/ml。使用上述的方法測
13定最終接種物中營養細胞和孢子的計數。108CFU/ml的終濃度對應於起始OD63tlO. 2-0. 3。生長測定光密度測定使用無菌平底96孔微量滴定板(Greiner Bio-one GmbH，德國)。每個孔填充以 0. 150ml接種了孢子( 1 X IO8孢子/ml相當/相當於起始OD63tl 0. 2-0. 3)的VIB，滴定板在37°C下孵育20小時，每次讀數前用強度4(高)的周期振搖1分鐘。為了避免在滴定板蓋的內側上發生凝聚，蓋子與Triton X-100的稀釋溶液接觸。芽孢桿菌菌株的出芽和生長動力學使用分光光度計(Bio-tek Instruments, Inc. VE)在波長630nm(0D63CI)下測定。以10分鐘的間隔進行讀數，並使用KC4 軟體(Bio-tek Instruments, Inc.，USA)分析。20h後，數據輸出至Excel 電子表格程序以進一步分析，輸入至SAS 9. 0版並進行統計學分析。實施例2 胺基酸測定在本研究中使用的測定和定量由芽孢桿菌細胞產生的胺基酸的方法是用於含水樣品的標準GC-MS法，該方法使用氯甲酸甲酯作為衍生化試劑。芽孢桿菌細胞的生長芽孢桿菌細胞接種並生長在低鹽生長培養基(Minimal Salts Growth Medium) 37°C，150rpm下，並生長2天，然後如下所述在測量上清液中胺基酸的量。芽孢桿菌細胞在具有下列組成的根據Chapman(197》的低鹽培養基中繁殖(NH4)2S04 (Merck 1.01217.1000) lg/1
K2HPO4 (Merck 1.05101.1000) 7g/1
KH2PO4 (Merck 1.04873.1000) 3g/l
MgSO4-Vmo (Merck 1.05886.1000)0.1g/1在121°C下高壓滅菌15min，並加入高壓滅菌的葡萄糖至0.5%的終濃度。在含有IOml培養基的試管中在37°C和150rpm下完成2天的孵育。胺基酸測定對細胞上清液進行胺基酸測定，因為胺基酸分泌至培養基中。樣品經過濾滅菌並保持在-20°C直至進行分析。試劑試劑1 內標準溶液。正纈氨酸ImM :0. 0172g正纈氨酸+IOOmlMQW試劑2 甲醇 / 吡啶 32/8 (v/v)(催化劑(Catalysator))試劑3 分析用(p. a.)氯甲酸甲酯(MCF)(衍生化試劑)試劑4 :1%MCF/CHC13(v/v)(萃取)1ml分析用氯甲酸甲酯+氯仿補充至1000ml。樣品製劑·將150 μ 1(25 μ 1+125 μ MQff)樣品吸移至2ml注射瓶中。·加入 150 μ 1 IS。·加入200 μ 1 1-甲醇/吡啶32/8% (ν/ν)。充分混合。·加入25 μ 1 MCF (氯甲酸甲酯)。充分混合直至出現氣體產生。
加入500μ 1 1%MCF/CHC13(V/V)，蓋帽並劇烈混合。在幾分鐘內出現相分離。如果相分離太慢，則將該瓶離心(500rpm/10min)。如果使用正纈氨酸作為抗代謝物，則應當更換使用外標準或另一種合適的內標準，並且用MQW或樣品代替150 μ 1 IS。樣品在GC-MS上運行，使用標準胺基酸柱和試驗方案。實施例3 耐膽汁枯草芽孢桿菌細胞DSM 19467的選擇起始芽孢桿菌細胞為枯草芽孢桿菌細胞GalliPro 。GalliPro 被誘變以得到新的單個芽孢桿菌細胞的集合體。製備並選擇如上面實施例1中所述在包含4和6mM膽汁鹽的膽汁鹽培養基的存在下從孢子快速出芽和生長為營養細胞的孢子。選擇出枯草芽孢桿菌細胞DSM 19467。下面的表1顯示了出芽和生長數據。從對應於l(fCFU/ml的OD 0. 2-0. 3達到OD 0. 4的時間(小時)(3次重複的均數)。
權利要求
1.一種芽孢桿菌組合物，包含105-1012CFU/g芽孢桿菌孢子細胞，其中所述芽孢桿菌組合物的特徵在於(i)所述芽孢桿菌孢子在包含4mM和6mM膽汁鹽的膽汁鹽培養基的存在下從孢子快速地出芽和生長為營養細胞，所述快速出芽和生長定義為所述芽孢桿菌孢子分別在小於18 小時和19小時內達到0. 40D630的營養細胞生長點，其中所述營養細胞生長點是生長曲線中 OD值開始以連續的方式增加(由所述營養細胞的生長所引起)並達到0D630為0. 4的點；(I)其中所述膽汁鹽培養基是補充了膽汁鹽混合物的本文實施例1的標準已知非選擇性小牛肉浸出液肉湯(VIB)培養基，所述膽汁鹽混合物包含結合型膽汁鹽牛磺脫氧膽酸鹽和甘氨脫氧膽酸鹽以及去結合型膽汁鹽脫氧膽酸鹽，其比例為60%的牛磺脫氧膽酸鹽、 30%的甘氨脫氧膽酸鹽和10%的脫氧膽酸鹽；以及其中OD測定分析通過下列步驟進行(a)在微量滴定板的孔內填充0.150ml的每ml培養基含有IO8個芽孢桿菌孢子的膽汁鹽培養基(即，此為零時刻)；以及(b)將所述滴定板在37°C下在大氣條件下孵育，並使用分光光度計並在每次讀數之前攪動測定OD63tl值，從而獲得代表性的隨時間推移的生長曲線；以及( )所述芽孢桿菌營養細胞比參照芽孢桿菌細胞DSM 19467產生更高量的至少一種必需胺基酸，其中產生的必需胺基酸的量在本文實施例2的標準已知低鹽生長培養基中在 37°C下生長2天後通過本文實施例2的基於標準GC-MS法的胺基酸測定法來測定。
2.如權利要求1所述的芽孢桿菌組合物，其中所述組合物的芽孢桿菌孢子細胞作為乾燥的(例如，噴霧乾燥的)孢子細胞存在。
3.如權利要求1或2所述的芽孢桿菌組合物，其中所述芽孢桿菌細胞是枯草芽孢桿菌 (B. subtilis)細胞。
4.如權利要求1-3中任一項所述的芽孢桿菌組合物，其中在權利要求1所述的第(i) 項的條件下，所述芽孢桿菌孢子比以DSM 17231保藏的參照枯草芽孢桿菌(「GalliPro 」) 孢子細胞提前至少3小時達到所述營養細胞生長點。
5.如權利要求1-4中任一項所述的芽孢桿菌組合物，其中所述必需胺基酸是選自由下列組成的組的必需胺基酸苯丙氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、色氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、 賴氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、組氨酸和精氨酸。
6.如權利要求5所述的芽孢桿菌組合物，其中所述必需胺基酸是選自由下列組成的組的至少一種必需胺基酸纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸。
7.如權利要求6所述的芽孢桿菌組合物，其中所述必需胺基酸是亮氨酸。
8.如權利要求1-7中任一項所述的芽孢桿菌組合物，其中在權利要求1所述的第(ii) 項的條件下，所述芽孢桿菌營養細胞比參照芽孢桿菌細胞DSM 19467產生至少多4倍量的至少一種必需胺基酸。
9.一種飼養動物的方法，包括將權利要求1-8中任一項所述的芽孢桿菌組合物連同其他動物飼料成分施用於動物。
10.如權利要求9所述的飼養動物的方法，其中所述的動物是選自家禽、反芻動物、牛、 豬、兔、馬、魚和寵物的動物。
11.一種篩選和分離新芽孢桿菌細胞的方法，包括下列步驟(a)從單個芽孢桿菌孢子細胞的集合體內篩選並分離出新芽孢桿菌孢子細胞，該新芽孢桿菌孢子細胞能夠在權利要求1所述的第(i)項的條件下快速地出芽和生長，使得其在小於18和19小時內達到營養細胞生長點；(b)從步驟(a)分離的孢子細胞製備芽孢桿菌營養細胞，並且將所述選擇和分離的新細胞突變以得到新芽孢桿菌單個營養細胞的集合體；(c)從步驟(b)的新芽孢桿菌單營養細胞的集合體中選擇和分離能夠在權利要求1所述的第(ii)項的條件下比參照芽孢桿菌細胞DSM 19467產生更高量的至少一種必需胺基酸的新芽孢桿菌營養細胞；以及(d)分析步驟(c)的高產芽孢桿菌營養細胞以確認其保持了步驟(a)的快速的出芽和生長，並分離所述被選擇的芽孢桿菌細胞。
12.如權利要求11所述的篩選和分離新芽孢桿菌細胞的方法，其中所述芽孢桿菌細胞是枯草芽孢桿菌細胞。
全文摘要
一種芽孢桿菌組合物，其特徵在於在膽汁鹽(模擬的腸道環境)中快速出芽和生長以及高水平地分泌必需胺基酸。該芽孢桿菌組合物可用作動物飼料補充劑，在飼料中其具有益生(健康促進)作用並增加動物飼料中營養的消化和可利用度。
文檔編號A23L1/30GK102300981SQ200980151423
公開日2011年12月28日 申請日期2009年12月16日 優先權日2008年12月19日
發明者派屈克·德克斯, 託馬斯·達爾曼·萊澤, 本特·隆德, 梅泰·戴尼斯·康託, 艾恩·納萊伯格, 英吉·奈普 申請人:科. 漢森有限公司