用於治療呼吸道病毒感染的組合物及其用途的製作方法

2023-07-31 09:28:51 2

專利名稱：：用於治療呼吸道病毒感染的組合物及其用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及幹擾呼吸道病毒感染，特別是呼吸道合胞體病毒和甲型禽流感病毒(包括H5N1林)中的病毒複製的siRNA組合物。本發明進一步涉及siRNA組合物的用途，所述的組合物用於抑制病毒基因在呼吸道病毒感染的細胞中的表達，並用於治療患者的呼吸道病毒感染。
背景技術：
：幾個世紀以來，呼吸道病毒感染已經成為人類健康和生命的重大威脅。眾所周知的事件包括由流感病毒林、呼吸道合胞體病毒引起的感染以及嚴重急性呼吸器官綜合症(SARS)。這些包括1981年的全球性流感大流行，其導致全世界範圍內約20-40百萬人口死亡。在最近的十年裡也存在其它的流感大流行。2002年SARS的爆發奪去了大約soo條生命(2)。呼吸道合胞體病毒呼吸道合胞體病毒(RSV)感染是嚴重的兒童呼吸道疾病的主要原因。大約三分之二的嬰兒在生命的第一年裡感染RSV並且幾乎100%的嬰兒在兩歲時已經感染了RSV。目前不存在特異性和有效的治療劑來用於治療RSV感染。呼吸道合胞體病毒(RSV)是有包膜的，不分節的單鏈負鏈RNA病毒(NNR),其屬於單鏈負鏈病毒目中的副粘病毒科(14，29)。副粘病毒共同具有下列性質。1)它們具有病毒核衣殼蛋白(N)緊緊包被的單鏈RNA基因組29,30。2)亞基因組mRNA通過RdRP從負基因組轉錄。3)病毒複製在宿主細胞的細胞質中進行。RSV從感染到子代病毒顆粒釋放的生命周期的細節得以充分地研究(15)。RSV基因組是15.5kb長的負鏈，包含基因3'-NSl、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2、L-5'(見圖1)。這些基因中有7個基因產物是和其它的副粘病毒3共有的，即N、P、M、SH、G、F和L。一些病毒或宿主因子涉及調節RNA轉錄和複製(20)。另外，存在病毒順式作用信號，這些信號在mRNA轉錄和RNA複製中起調節作用(3)。RSV感染的潛伏期大約為4-5天；它首先感染鼻咽，然後在幾天內，它到達支氣管和細支氣管，感染局限於呼吸上皮的淺層。甲型流感從1997年開始，出現了新的甲型禽流感林，即H5N1。雖然主要局限於禽類(野生群體和家禽兩者)，但是該病毒顯然僅感染與受感染的禽類直接接觸的人。在人中，該感染引起嚴重疾病，導致人的嚴重呼吸器官疾病和死亡(3-12)。許多案例和爆發已經在東南亞的許多國家發生。鑑於禽病毒感染人的能力，存在增加的突變成傳染性人變種的風險，具有出現新的流感大流行的風險，該流感大流行具有有效且持續的人與人之間的傳播和高的死亡率。由於禽流感H5N1是一種新出現的與肺炎相關的傳染性病原體並且它的病理學和機制不是很清楚，因而在人的疾病案例中仍沒有用於H5N1禽流感的特異性和有效的治療。目前，流感感染用抗病毒劑，例如這兩種藥物(屬於神經氨酸酶抑制劑類)奧塞米韋(商業上稱為Tamiflu)和扎那米韋(商業上稱為Relenza)或老的M2抑制劑金剛烷胺和金剛乙胺治療。H5N1是甲型流感病毒的一個亞型。因而它是有包膜的，有分節的負單鏈RNA病毒，屬於正粘病毒科。在甲型流感病毒(包括H5N1)的生命周期中，病毒基因組RNA(vRNA)用作互補RNA(cRNA)產生的模板，所述的病毒基因組RNA還用作信使RNA(mRNA)產生的模板。在病毒複製過程中產生的這三種類型的RNA分子的每種都能用有義或反義siRNA來耙向，用於siRNA介導的降解。曱型流感基因組，其由包含至少IO個開放閱讀框(0RF)的8個單獨的RNA片段構成，可用作病毒基因組複製和亞基因組或基因引導的mRNA合成的模板。圖2顯示了描述甲型流感病毒顆粒結構的圖示。聚合酶PB2、PB1(聚合酶鹼性蛋白1和2)和PA(聚合酶酸性蛋白)分別由RNA1、RNA2和RNA3編碼。四種病毒結構蛋白H(血凝素)、N(神經氨酸酶)、Ml和M2(基質蛋白l和2)分別由RNA片段4、6和7編碼，而RNA5編碼NP(核殼體蛋白)以及RNA8編碼NS1和NS2(非結構蛋白1和2)。RNA幹擾RNA幹擾(RNAi)是序列特異性RNA降解過程，所述的過程提供了相對容易和直接的方式來分解或沉默理論上的任何基因(17、18、19)。在自然發生的RNA幹擾中，雙鏈RM通過RNA酶III/螺旋酶蛋白Dicer切割成小幹擾RNA(siRNA)分子中，即在3'末端具有2-nt突出端的19-23個核苷酸(nt)的dsRNA。這些siRNA整合進稱為RNA-誘導-沉默複合體(RISC)的多組分-核糖核酸酶中。siRNA的一條鏈保持與RISC結合，並引導該複合體接近與RISC中的該ss-siRNA引導序列互補的同源RNA。這種siRNA引導的核酸內切酶消化該RNA，從而使其失活。目前的研究已經表明，化學合成的21-25ntsiRNA的使用在哺乳動物細胞中顯示出RMi效果(20),並且siRNA雜交(在末端或中間)的熱力學穩定性在決定該分子的作用中起重要作用(21，22)。RISC、siRNA分子和RMi的這些及其它特性已經得以描述(23-28)。在實驗室或潛在地在治療應用中，RMi在哺乳動物細胞中的應用使用了化學合成的siRNA或內源性表達的分子(2，21)。內源性siRNA首先通過表達載體(質粒或病毒載體)表達成小型髮夾結構RNA(shRM)，並然後通過Dicer加工成siRNA。據認為siRM很有希望成為用於人類疾病，特別是由病毒感染引起的疾病的治療劑(19、20、27-30)。重要的是，目前不可能以任何可信度去預測可能靶向病毒基因組序列的多種可能的候選siRNA(例如約16-30個鹼基對的寡核苷酸)中哪個將實際上會顯示出有效的siRNA活性。因而，必須產生並檢驗單獨的特定候選siRNA多核苷酸或寡核苷酸序列以確定是否已經發生了對靶基因的期望幹擾。因此，本領域可以設計確信能夠特異性改變給定mRNA的表達的siRNA多核苷酸。仍然相當需要抑制病毒病原體基因和它們的同源蛋白質產物的表達的組合物和方法。特別是迫切需要組合物和方法來抑制致病性呼吸道病毒基因在病毒感染的細胞中表達，並用於在受試者中治療呼吸道病毒感染。此外，需要治療RSV和甲型禽流感，特別是H5N1林感染的組合物和方法。另外還需要用於治療的組合物和方法，所述的治療是非常有效的，並且不依賴於使用或修飾已知的抗病毒劑。本發明解決了這些問題並滿足了相關的需要。
發明內容本發明提供了涉及使用RNA幹擾來抑制病毒感染和複製的組合物和方法，所述的抑制是通過分裂病毒病原體，例如那些引起呼吸道病毒感染的病毒病原體(包括甲型流感H5N1和RSV)的病毒RNA分子來獲得的。這些病毒是在人和其它哺乳動物中引起嚴重呼吸道疾病的病原體。抑制病毒複製將對抗感染了病毒的培養細胞和受試者中的病毒感染，包括減輕它的症狀。在第一個方面，本發明提供了分離的多核苷酸，所述多核苷酸的長度可以是15-200之間任何數目的核苷酸。多核苷酸包括靶向呼吸道合胞體病毒或甲型流感病毒的基因組的第一核苷酸序列。在該多核苷酸中，任意T(胸腺嘧啶)或任意U(尿嘧啶)可以任選地由其它鹼基取代。另外，在多核苷酸中第一核苷酸序列由以下構成a)長度為15-3G之間任何數目的核苷酸的序列，或b)在a)中給出的序列的互補序列。這種多核苷酸在此可以稱為線性多核苷酸。在本發明一個相關方面，上面描述的多核苷酸進一步包括通過環序列與第一核苷酸序列分開的第二核苷酸序列，從而第二核苷酸序列a)具有與第一核苷酸序列基本相同的長度，並且b)是與第一核苷酸序列基本互補的。在該後面的結構中，稱為髮夾結構多核苷酸，第一核苷酸序列與笫二核苷酸序列雜交而形成髮夾結構，所述髮夾結構的互補序列通過環(loop)序列連接。在線性多核苷酸和髮夾結構多核苷酸的許多實施方案中，第一核苷酸序列是a)選自SEQIDNO:1-263的序列；b)比a)項中給出的序列長的靶向序列，其中該耙向序列(targetingsequence)靶向呼吸道病毒的基因組並包括選自SEQIDNO:1-263的序列;c)選自SEQIDNO:1-263的序列的片段，其中所述片段由長度為至少15個核苷酸且至多比所選擇的序列短一個鹼基的連續鹼基序列構成；d)其中最多有5個核苷酸不同於選自SEQIDNO:1-263的序列的序列；或e)在a)-d)中給出的任何序列的互補序列。在線性多核苷酸或髮夾結構多核苷酸的多種實施方案中，第一核苷酸序列的長度是21-25之間任何數目的核苷酸。在許多實施方案中，線性多核苷酸或髮夾結構多核苷酸由選自SEQIDNO:1-263的序列構成，並任選包含結合至所選擇的序列3'的二核苷酸突出端。然而，在線性多核苷酸或髮夾結構多核苷酸的另外的實施方案中，位於第一核苷酸序列的3'末端的二核苷酸序列是TT、TU、UT或UU並且包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或兩者。在多個其它的實施方案中，線性或髮夾結構多核苷酸可以是DM，或者它可以是RNA，或者它可以由脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸兩者構成。在本發明的另外方面提供了雙鏈多核苷酸，所述的雙鏈多核苷酸包括在權利要求1中描述的第一條多核苷酸鏈和與第一條鏈的至少第一核苷酸序列互補並與其雜交而形成雙鏈組合物的第二條多核苷酸鏈。這些多核苷酸結構也可以稱為線性多核苷酸。仍然在一另外方面中，本發明提供了包含兩種或多種在權利要求1、權利要求2或兩者中描述的靶向多核苷酸的組合物，這樣該組合物的每個多核苷酸靶向靶標病毒的基因組中的不同序列。由於與呼吸道病毒病原體把標的高度相似性或同一性，並且在理論上不希望被結合的，相信一旦引入至病毒感染的細胞中，該多核苷酸會引起RNA幹擾，導致病原體基因組RNA、互補RNA和信使RNA的消化。特別地，在本發明這些方面的重要實施方案中，相信在這些多核苷酸中的第一核苷酸序列或其互補序列形成RNA誘導沉默複合物(RISC)，所述的RNA誘導沉默複合物將多核苷酸siRNA序列引導至病原體基因組的RNA序列，從而促進病原體基因組的RNA的切割。在另外的方面，本發明提供了包含由本發明的線性多核苷酸或髮夾結構多核苷酸提供的序列的栽體。在多個實施方案中，這些載體的任何一種可以是質粒、重組病毒、轉座子或微小染色體。仍然在另外的方面，提供了通過本發明的一個或多個線性多核苷酸，或通過本發明的一個或多個髮夾結構多核苷酸轉染的細胞。依然在另外的方面，本發明提供了藥物組合物和可藥用載體，所述的藥物組合物包含一個或多個線性多核苷酸或髮夾結構多核苷酸，或它們的混合物，其中每個多核苷酸靶向乾標病毒基因組中的不同序列。然而在另外的方面，本發明提供了藥物組合物和可藥用載體，所述的藥物組合物包含含有線性多核苷酸的一個或多個載體，或含有髮夾結構多核苷酸的載體，或它們的混合物，其中每個載體含有靶向靶標病毒基因組中的不同序列的多核苷酸。在藥物組合物的多個實施方案中，載體包括合成的陽離子聚合物、脂質體、葡萄糖、表面活性劑或它們的任何兩種或多種的組合。依然在另一方面，本發明提供了合成線性多核苷酸或髮夾結構多核苷酸的方法，所述的這兩種多核苷酸具有耙向呼吸道合胞體病毒或甲型流感病毒的基因組的序列。該方法包括以下步驟a)提供包含活性反應末端並對應所述序列第一個末端的核苷酸的核苷酸反應物；b)加入包含活性反應末端並對應該序列相繼位置的另一核苷酸反應物，用來與來自前面步驟的活性末端反應並使該生長的多核苷酸序列增加一個核普酸長度，並且除去不希望的產物和過剩的反應物，和c)重複步驟b)直到加入了對應於該序列第二個末端的核苷酸的核苷酸反應物；從而提供了完整的多核苷酸。依然在另外的方面，本發明提供了用於用RNA抑制劑轉染細胞的方法，其中該方法包括使細胞與包含一個或多個線性多核苷酸，或一個或多個髮夾結構多核苷酸的組合物接觸。在許多實施方案中，如此轉染的細胞包含通過一個或多個多核苷酸靶向的呼吸道病毒。然而在另一方面，本發明提供了抑制呼吸道病毒在經病毒感染的細胞中複製的方法，所述的方法包括使細胞與包含一個或多個線性多核苷酸，或一個或多個髮夾結構多核苷酸的組合物接觸，其中所述的一個或多個多核苷酸靶向病毒。依然在另一方面，本發明提供了靶向呼吸道病毒的線性多核苷酸，或它們的兩種或多種的混合物的用途，或者靶向呼吸道病毒的髮夾結構多核普酸，或它們的兩種或多種的混合物的用途，所述的用途用於生產在受試者中有效治療由呼吸道病毒引起的感染的藥物組合物。在所述用途的多個實施方案中，受試者是人。然而在另一方面，本發明提供了在受試者中治療由呼吸道病毒引起的感染的方法。該方法包括施用有效劑量的靶向呼吸道病毒的線性多核苷酸，或它們的兩種或多種的混合物給受試者，或者施用有效劑量的靶向呼吸道病毒的髮夾結構多核苷酸，或它們的一種或多種的混合物給受試者。在這種方法的多個實施方案中，受試者是人。在另外的實施方案中，將線性多核苷酸和髮夾結構多核苷酸兩者都施用給受試者。圖l.人呼吸道合胞體病毒(hRSV、RSV)(-)ssRNA基因組的示意圖。基於GenBank登記號NC_001781。圖2.甲型流感病毒結構的示意圖。該圖顯示了整合於病毒顆粒中的病毒基因組的8個片段。圖3.本發明多核苷酸的多種實施方案的示意圖。圖A,線性多核苷酸的實施方案。長度為200或低於200個核苷酸，並且為15個或大於15個核苷酸。在b)中，特異性靶向序列包含於更長的耙向序列中。在d)中較黑的直條圖解表示取代的核苷酸。圖B，全長為200個核苷酸或少於200個核普酸的髮夾結構多核苷酸的實施方案。圖4.顯示H5N1基因組中siRNA序列的位置的示意圖圖5.在MDCK細胞培養基中H5N1病毒生長的抑制圖6.在不同時間點測定的siRNA的抑制效果具體實施例方式在這裡確定的所有專利、專利申請公開內容和專利申請通過全文引用作為參考，就如同在這裡是逐字顯現的。在此確定的所有技術公開內容也通過引用作為參考。在當前描述中，冠詞"a"、"an"和"the"等價地指單數或複數含義。這些冠詞的特殊意思在使用它們的上下文中是明顯的。如於此使用的，術語"靶標，，序列以及類似的術語和短語涉及本發明多核苷酸所針對的存在於病原體基因組中的核苷酸序列。多核苦酸a)通過包括與病原體基因組內包含的特定子序列(稱為靼標序列)同源或者相同的序列，或者b)通過包括其互補序列與所述靶標序列同源或相同的序列來靶向病原體序列。根據RNA幹擾現象，相信靶向病原體序列的任何多核苷酸具有與靶標序列雜交的能力，因而起始了RM幹擾。如此處使用的，術語"互補序列"、"互補性序列，，及相似的術語和短語指其鹼基形成互補鹼基對(鹼基對鹼基)的兩個序列，如領域如生物化學、分子生物學、基因組學及與本發明領域相關的類似領域中的技術人員常規理解的。如此處使用的，當在序列或子序列的每個位點上笫一個序列或子序列具有與第二個序列或子序列相同的鹼基時，第一個序列或子序列是與第二個序列或子序列"相同的"，或具有"100%的同一性"，或通過表達ioo%同一性概念的術語或短語來描述。在測定同一性時，包含t(胸腺嗜啶)或任何它的衍生物，或u(尿嘧咬)或任何它的衍生物的任何特定鹼基位置是彼此相同的，因而認為是同一的。如於此描述的，靶向多核苷酸的序列或其互補序列可以與乾序列完全相同，或者其在序列的特定位置可以包含錯配的鹼基。在這裡充分描述了錯配的整合。儘管不願受理論束縛，據信整合入錯配在生理學條件下提供了期望水平的雜交穩定性來優化對討論的特定靶序列的RNA幹擾現象。同一性程度決定了在兩個序列中其鹼基彼此相同的位置的百分比。"序列同一性百分比"是通過這樣計算的在比較區來比較經最佳比對的兩個序列，測定兩個序列中都出現相同核酸鹼基(在核酸的情形中，例如A、T或U，C、G或I，)處的位置數以獲得匹配位置數，用匹配位置數除以比較區內(即窗口大小)的位置總數，並將結果乘以100而得到序列同一性的百分比。彼此低於100%相同的序列是"相似的"或"同源的"；同源性程度或百分比相似性是指如在下面段落中確定的兩個序列或子序列之間的同一性的百分比的同義術語。例如，彼此顯示出至少60%的同一性，或優選至少65%的同一性，或優選至少70%的同一性，或優選至少75°/。的同一性，或優選至少80%的同一性，或更優選至少85%的同一性，或更優選至少90%的同一性，或更優選至少95%的同一性的兩個序列是彼此"相似的，，或"同源的"。備選地，關於siRM分子的寡核苷酸序列，有5個或少於5個的鹼基，或有4個或少於4個的鹼基，或有3個或少於3個的鹼基，或有2個或少於2個的鹼基，或有一個鹼基不同的兩個序列稱為彼此"相似的，，或"同源的，，。如本領域已知的，"同一性"是兩個或多個多肽序列或者兩個或多個多核苷酸序列之間的關係，如通過比較序列來確定。在本領域中，"同一性"也指多肽或多核苷酸序列之間的序列親緣關係水平，根據具體情況而定，如通過在這些序列的字符之間匹配來測定。"同一性"和"相似性"可以容易地通過已知方法計算，所述的方法包括但不限於在(ComputationalMolecularBiology,Lesk.A.M.，ed.,OxfordUniversityPress,NewYork,1988;Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.，ed.，AcademicPress,NewYork,1993;ComputerAnalysisofSequenceData,PartI.Griffin,A.M.，和Griffin,H.G.,eds.HumanaPress,NewJersey,1994;SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje，G.，AcademicPress,1987;和SequenceAnalysisPrimer,Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.，MStocktonPress.NewYork,1991;以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAMJ,AppliedMath.(1988)48:1073中描述的那些方法。用於測定同一性的優選方法是設計來在檢驗的序列之間產生最大匹配。用於測定同一性和相似性的方法編碼於公共可獲得的電腦程式中。用於測定兩個序列之間的同一性和相似性的優選電腦程式方法包括，但不限於GCG程序包(Devercux，J等(1984)，NucleicAcidsResearch12(1):387)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul，S.F.等(1990)J.Molec.Biol.215:403—410。BLASTX程序是從NCBI和其它來源(BLASTManual,Altschul，S.，等，NCBINLMNIHBethesda，Md.20894;Altschul,S.等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)可公共可獲得的。眾所周知的SmithWaterman算法也可以用於測定同一性。序列比較的參數包括下面的算法Needleman和Wunsch,J.MolBiol.48:443-453(1970)。比較矩陣來自HentikoffandHentikoff,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:10915-10919的BL0SSUM62。如在此使用的，術語"分離的"，和類似的詞，在用於描述核酸、多核苷酸或寡核苷酸時，指從它的天然或初始狀態移開。因而，如果它是天然存在的，則它已經從其初始環境中移開。如果它已經通過合成製備，則它已經從該合成產生的初始產物的混合物中分離。例如，天然存在於生物體(以其自然狀態)中的天然出現的多核苷酸是未經"分離，，的，但是從與其共存的物質中分離的相同的多核苷酸是"分離的"，如在此採用的術語。通常，除去至少一種顯著共存的物質構成了"分離的，，核酸、多核苷酸、寡核苷酸。在多數情況下，可以去除數種、許多或大多數共存的物質來分離核酸、多核苷酸、寡核苷酸、蛋白質、多肽或寡肽。作為非限制性的實例，對於多核苷酸，術語"分離的"可以表示它從其天然存在的染色體和細胞中分離。進一步的實例是，"分離的，，蛋白質或多肽可以表示使其從細胞溶解產物或細胞均漿中的另一種成分分離。作為體外合成方法或化學合成方法的產物的核酸、多核苷酸或寡核苷酸基本上通過合成方法分離。在重要的實施方案中，處理這種合成產品以去除使用的試劑和產物母體，以及通過該方法產生的副產品。同樣，多核苷酸和多肽可以存在於例如不是天然存在的組合物的組合物中，例如製劑、用於將多核苷酸引入至細胞中的組合物、用於化學或酶促反應的組合物或溶液，並且，其中保留有如在此採用的術語的意義範圍內的分離的多核苷酸或多肽。如在此和在權利要求中使用的，"核酸"或"多核苷酸"，以及基於這些的類似術語指由天然存在的核苷酸構成的聚合物以及由合成的或經修飾的核苦酸構成的聚合物。從而，如在此使用的，是RNA的多核苷酸，或者是DNA的多核苷酸可以包含天然存在的部分例如天然存在的鹼基和核糖或脫氧核糖環，或者它們可以如下面描述的由合成的或經修飾的部分構成。核苷酸之間的鍵通常是3'-5'磷酸鍵，其可以是天然的磷酸二酯鍵、磷酸硫酯鍵和其它合成的鍵。經修飾的主鏈的實例包括，石克代磷酸酯(phosphorothioates)、手性石克代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其它的烷基磷酸酯包括3'-亞烷基砩酸酯、5'-亞烷基磷酸酯和手性磷酸酯、亞磷酸酯、氨基磷酸酯包括V-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯、硫代氨基砩酸酯、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒基磷酸酯和硼烷基磷酸酯。另外的鍵包括磷酸三酯、矽氧烷、碳酸酯、羧甲基酯、氨基乙酸酯，氨基甲酸酯、硫醚、橋聯的氨基磷酸酯、橋聯的亞甲基磷酸酯、橋聯的硫代磷酸酯和磺基核苷酸間鍵合。其它聚合物鍵包括這些的2'-5'鏈連類似物。參見美國專利6，503，754和6，506，735和於此引用的參考文獻，在這裡通過引用作為參考。核酸和多核苷酸長度可以是20個或更多的核苷酸，或者是30個或更多的核苷酸，或者是50個或更多的核苷酸，或者是100個或更多的，或者是1000個或更多的，或者是數萬個或更多的，或者是數十萬個或更多的核苷酸。siRM可以是如在此定義的多核苷酸。如在此使用的，"寡核苷酸"和基於"寡核苷酸"的類似術語涉及由天然存在的核苷酸構成的短聚合物，也涉及由合成的或經修飾的核苷酸(如在前面的段落中剛描述的)構成的聚合物。寡核苷酸長度可以是10個或更多的核苷酸，或15個、或16個、或17個、或18個、或19個、或20個或更多的核苷酸，或者21個、或者22個、或者23個、或者24個或更多的核苷酸，或者25個、或者26個、或者27個、或者28個或29個、或者30個或更多的核苷酸，或者35個或更多的、40個或更多的、45個或更多的、達到約50個核苷酸。作為siRNA的寡核苷酸可以具有15-30個核苷酸之間的任何數量的核苷酸。在許多實施方案中，siRNA可能具有21-25個核苷酸之間的任何數量的核苦酸。從剛提供的定義中可以理解，由於尺寸範圍的重疊，術語"多核苷酸"和"寡核苷酸"在此可以等同使用來指本發明的siRNA。如在此和在權利要求中使用的，"核苷酸序列"、"寡核苷酸序列"或"多核苷酸序列"，以及類似的術語可互換地指寡核苷酸或多核苷酸具有的鹼基序列，也涉及具有該序列的寡核苷酸或多核苷酸結構。此外，核苷酸序列或多核苷酸序列涉及任何天然的或合成的多核苷酸或寡核苷酸，其中鹼基序列是通過表示鹼基的字母的特定序列的描述或列舉所定義，所述的表示鹼基的字母是如本領域中常規採用的。在寡核苷酸和多核苷酸中的鹼基可以是"未修飾的"或"天然的"鹼基，所述的鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)和鳥噤呤(G),以及嘧啶鹼基胸腺嗜啶(T)、胞嗜啶(C)和尿嘧啶(U)。另外，它們可以是具有修飾或取代基的鹼基。如在此使用的，經修飾的鹼基的非限制性實例包括其它合成的和天然的鹼基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺噪呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鳥噤呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫脲嘧咬、2-巰基胸腺嘧咬和2-巰基胞嗜啶、5-卣代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧咬和胞嘧啶以及嘧啶鹼基的其它炔基4汙生物、6-氮雜尿嘧咬、胞嘧吱和胸腺嘧澱、5-尿嘧咬(假尿嘧，定)、4-硫脲嘧啶、8-卣代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-卣代特別是5-溴、5-三氟曱基以及其它5_取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-氟-腺噪呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。其它經修飾的鹼基包括三環嘧啶例如吩噁溱胞苷(1H-嘧啶並[5，4-b][1，4]苯丙噁溱-2(3H)-酮)、吩噻溱胞苷(1-嘧啶並[5,4-b][1，4]苯並噻嚷-2(3H)-酮)、G-clamps例如經取代的吩噁溱胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶並[5，4-b][1，4]苯並噁溱-2(310-酮)、寸唑胞苷(2H-嘧啶並[4，5-b]p引咮-2-酮)、吡啶並吲哚胞苷(H-吡啶並[3'、2。4,5]吡咯並[2，3-d]嘧咬-2-酮)。經修飾的鹼基還包括其中噤呤或嘧咬鹼基經其它雜環取代的那些鹼基，例如7_脫氮-腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤核苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其它鹼基包括在美國專利No.3，687，808中公開的那些鹼基、在TheConciseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineering,pages858-859，Kroschwitz，J.L，ed.JohnWiley&Sons,1990中公開的那些鹼基、由Englisch等，AngewandteChemie，InternationalEdition(1991)30，6137>開的那些鹼基，以及由Sanghvi，Y.S.,Chapter15，AntisenseResearchandApplications,pages289-302，Crooke，S.T.和Lebleu，B.，ed.，CRCPress,1993公開的那些鹼基。這些鹼基的某些特別是可用於增加本發明寡聚化合物(oligomericcompounds)的親合性。這些包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧咬以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已經顯示能增加核酸雙鏈體的穩定性0.6-1.2個7jc平(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.，eds.，AntisenseResearchandApplications,CRCPress,BocaRaton,1993，pp.276-278)並且是目前優選的鹼基取代，在與2'-0-甲氧乙基糖修飾組合時甚至更優選。參見美國專利6,503,754和6，506，735和在其中引用的參考文獻，在這裡將它們引入作為參考。任何經修飾的鹼基的使用等同於具有相同鹼基配對特性的天然存在的鹼基的使用，如本領域技術人員所理解的。如在此和在權利要求中使用的，術語"互補"和基於"互補，，的類似詞語，指在核酸、多核苷酸或寡核苷酸的一條鏈中的第一核酸鹼基只與在核酸、多核苷酸或寡核苷酸的另一條鏈中的特定的第二核酸鹼基特異性相互作用的能力。作為非限制性的實例，如果考慮天然存在的鹼基，A和T或U可彼此相互作用，以及G和C可彼此相互作用。如在本發明中和權利要求中使用的，"互補"用旨在表示"完全互補，，，即，當兩條多核苷酸鏈互相比對時，將會至少存在一部分鏈，在該鏈中，一條鏈中的連續鹼基序列中的每個鹼基與在相對鏈上相同長度的連續鹼基序列中的相互作用的鹼基互補。如在此使用的，"雜交"、"雜交化"以及類似的詞語涉及通過使具有互補序列的鏈彼此相互作用來形成核酸、多核苷酸或寡核苷酸雙鏈體的過程。由於每條鏈上的互補鹼基特異性相互作用而形成鹼基對而使相互作用發生。鏈相互雜交的能力取決於多種條件，如在下面列出的。核酸鏈在每條鏈中有足夠數量的相對應位置由可以相互作用的核苷酸佔據時相互雜交。本發明領域中的熟練技術人員包括分子生物學家和細胞生物學家(作為非限制性的實例)可理解，形成雙鏈體的鏈的序列不需要彼此100%的互補而能特異性雜交。如此處使用的，"片段"以及基於"片段"的類似詞語指短於全長參照序列的核酸、多核苷酸或寡核苷酸的部分。片段中的鹼基序列未經改變地來自產生該片段的分子的對應部分的序列；與其產生它的分子的相應部分比較在該片段中不存在插入或缺失。如在此考慮的，核酸或多核苷酸(例如寡核苷酸)的片段長度是15個或更多鹼基、或者16個或更多、17個或更多、18個或更多、19個或更多、20個或更多、21個或更多、22個或更多、23個或更多、24個或更多、25個或更多、26個或更多、27個或更多、28個或更多、29個或更多、30個或更多、50個或更多、75個或更多、IOO個或更多，多達比全長序列短一個鹼基的長度。寡核苷酸可以是化學合成的並且可以用作siRNA、PCR引物或探針。檢測和標記。耙向多核苷酸，例如包含siRM序列的多核苷酸，以及病毒多核苷酸耙標可以以多種方式檢測。檢測可以包括導致能夠觀測靼向多核苷酸的存在和或數量的任何一種或多種方法。在一個實施方案中，含有靶向多核苷酸或病毒靶標的樣品核酸可以在擴增之前檢測。在一個備選的實施方案中，可以擴增樣品中的靶向多核苷酸來提供增加的靼向多核苷酸，或者是擴增的病毒靶標，並檢測或定量該擴增的多核苷酸。物理、化學或生物學方法可用於檢測和定量靶向多核苷酸。物理方法包括，作為非限制性實例，表面等離子共振(SPR)檢測法，例如使探針結合至表面並使用SPR來檢測耙向多核苷酸結合至固定的探針上，或在層析介質中放入探針並檢測層析介質中靶向多核苷酸的結合。物理方法進一步包括凝膠電泳或毛細管電泳形式，其中將靶向多核苷酸從其它的多核苷酸分解，並且檢測該分解的靶向多核苷酸。化學方法通常包括聚合酶鏈式反應(PCR)方法，以及其中粑向多核苷酸與探針雜交的雜交方法。生物學方法包括使靶向多核苷酸或靶標多核苷酸對細胞產生生物效應，並檢測該效應。本發明公開了可以用作生物學檢測法的生物效應的實例。這些包括通過顆粒計數、噬菌斑測定、對感染細胞的細胞病變效應評估等來計算病毒顆粒。在許多實施方案中，可按下面描述地標記多核苷酸以助於檢測和定量。例如，在不包括擴增的實施方案中，樣品核酸可以通過化學或酶促添加標記部分(例如標記核苷酸或標記寡核苷酸連接序列)來標記。擴增的多核苷酸可以直接檢測和/或定量。例如，可以在凝膠中對擴增的多核苷酸進行電泳以便按大小解析，並用染料染色顯示它的存在和數量。備選地，擴增的靶向多核苷酸可以在雜交條件下暴露於探針核酸(見下文)並檢測和/或定量通過雜交的結合而得以檢測。檢測可以以允許測定靶向多核苷酸已經結合至探針的任何方式完成。這可通過檢測由雜交片段引起的探針物理性質的變化來完成。這種物理檢測方法的非限制性實例是SPR。完成檢測的備選方法是使用標記形式的擴增多核苷酸，並且檢測結合的標記。標記可以是方丈射性同位素標記，例如1251、35S、32P、14C或3H，例如這些標記可通過它們的放射性檢測。備選地，可以選擇標記，這樣使得其可以用光謙法，例如通過螢光、磷光或化學發光檢測。因而可以採用發螢光的，或發出磷光的，或引起化學發光反應的標記。此外標記還可以是在特異性配體-受體對中的配體，該配體的存在則可通過第二次結合特異性受體來檢測，所述的受體通常是自身經標記用於檢測的。幹擾RNA根據本發明，呼吸道病毒靶標的基因表達通過RNA幹擾來削弱。病毒基因的表達產物通過特異性雙鏈siRNA核苷酸序列耙向，所述的核苷酸序列至少與含有15-30之間任何數量的核苷酸，或在多數情況下，含有21和25個核苷酸之間任何數量的核苷酸的病毒靶標的片段互補。靶標序列可以出現在5'非翻譯(UT)區中、編碼序列中或3'UT區中。參見，例如，PCT申請WO00/44895、W099/32619、W001/75164、W001/92513、WO01/29058、W001/89304、W002/16620和WO02/29858，每個在此通過全文引用作為參考。根據本發明的方法，呼吸道病毒基因的表達，並由此呼吸道病毒的複製可用siRNA來抑制。根據本發明的靶向多核苷酸包括siRNA寡核苷酸。這種siRNA也可以通過化學合成與病毒序列相同或相似的核脊酸序歹寸來製備。參見，例3口，Tuschl，Zamore，Lehmann，BartelandSharp(1999)，Genes&Dev.13:3191-3197,在此通過全文引用作為參考。備選地，靶向siRNA可以使用靶向多核苷酸序列，例如通過在無細胞系統(例如但不限制於果蠅提取物)中消化呼吸道病毒的核糖多核苷酸，或者通過轉錄重組雙鏈病毒cRNA來荻得。使用由16-30nt的有義鏈和相同長度的16-30nt的反義鏈構成的siRNA雙鏈體通常可觀察到有效的沉默。在許多實施方案中，siRNA配對雙鏈體的每條鏈在3'末端另外具有2-nt的突出端。2-nt3'突出端的序列對siRNA靶標識別的特異性提供了額外的較小的貢獻。在一個實施方案中，位於3'突出端的核苷酸是核糖核苷酸。在一個備選的實施方案中，位於3'突出端的核苷酸是脫氧核糖核苷酸，3'脫氧核苷酸的使用提供了增強的細胞內穩定性。本發明的重組表達載體，當介導入細胞內時，經加工而提供包含靶向呼吸道病毒的siRNA序列的RM。這種載體是以允許表達的方式克隆進表達載體的DNA分子，所述的表達載體包含有效連接的位於病毒靶向序列旁側的調控序列。與病毒RM反義的RNA分子通過笫一個啟動子(例如，克隆DNA3'的啟動子序列)轉錄並且病毒RM靶標的有義鏈的RNA分子通過第二個啟動子(例如克隆DNA5'的啟動子序列)從該載體轉錄。有義和反義鏈然後在體內雜交以產生用於沉默病毒基因的靶向呼吸道病毒的siRNA構建體。備選地，可以使用兩個構建體來產生siRNA構建體的有義和反義鏈。此外，克隆DNA能夠編碼具有二級結構的轉錄產物，其中單個轉錄產物具有來自乾基因或基因的有義序列和互補的反義序列兩者。在這個實施方案的一個實例中，髮夾結構的RNAi產物與全部或部分靶基因相似。在另一個實例中，髮夾結構的RNAi產物是siRNA。在病毒序列旁側的調控序列可以是相同的或者可以是不同的，這樣它們的表達可以獨立地調控，或以時間或空間的方式調控。在某些實施方案中，siRNA通過克隆病毒基因模板進含有，例如來自小核RM(snRM)U6或人RNasePRNAHl的RM聚合酶III轉錄單位的栽體而得以在細胞內轉錄。載體系統的一個實例是GeneSuppressorTMRNA幹擾試齊寸盒(購自Imgenex)。U6和Hl啟動子是in型Poiin啟動子的成員。類U6啟動子的+i核苷酸總是鳥噤呤核苷，然而hi啟動子的+i核苷酸是腺嘌呤核苷。這些啟動子的終止信號由5個連續的胸腺嘧啶脫氧核苷確定。轉錄產物通常在第二個尿苷後裂解。在該位置裂解在表達的siRM中產生了3'UU突出端，其類似於合成的siRM的3'突出端。長度少於400個核苷酸的任何序列可以通過這些啟動子轉錄，從而它們理想地適合約21-核苷酸的siRNA在例如大約50-核苷酸RNA莖環(stem-loop)轉錄產物中的表達。已經研究了RNAi和影響siRNA效力的因子的特徵(參見，例如Elbashir，Lendeckel和Tuschl(2001)Genes&Dev.15:188-200)。對可利用的核苷酸序列文庫進行初始BLAST同源性檢索選擇的siRNA序列以確保只靶向病毒基因，而不是宿主基因。參見，Elbashir等，2001EMB0J.20(23):6877-88。多核普酸的合成對應靶向核普酸序列的寡核苷酸，以及包含靶向序列的多核苷酸可以通過標準合成技術，例如使用自動化DNA合成儀來製備。用於合成寡核苷酸的方法包括熟知的化學方法，包括(但不限於)連續添加核苷酸亞磷醯胺至表面4汙生j匕顆淨立，如由T，Brown和DorcasJ.S.Brown在01igonucleotidesandAnaloguesAPracticalApproach,F.Eckstein,editor,OxfordUniversityPress,Oxford,pp.1-24(1991)中描述的，並且在這裡將其通過全文引用作為參考。合成方法的一個實例使用ExpediteRNA亞磷醯胺和胸苷亞磷醯胺(Proligo公司，德國)。將使合成的寡核苷酸去保護並進行凝膠-純化(Elbashir等，(2001)Genes&Dev.15，188-200)，隨後通過Sep-PakC18柱(Waters,Milford，Mass.,USA)純化(Tuschl等，(1993)Biochemistry,32:11658-11668)。將互補的ssRNA在90匸下於退火緩衝液(100mM醋酸鉀、pH為7.4的30mMHEPES-KOH、2mM醋酸鎂)中培養1分鐘，隨後在37。C下培養1小時以便與對應的ds-siRNA雜交。寡核苷酸合成的其它方法包括(但不限於)根據磷酸三酯和磷酸二酯方法的固相寡核苷酸合成法(Narang等，(1979)Meth.Enzymol.68:90)和H-磷酸酯方法(尤其是Garegg，P.J等，(1985)"Formationofinternucleotidicbondsviaphosphonateintermediates'1,Chem.Scripta25，280-282;和Froehler，B.C等，(1986a)"SynthesisofDNAviadeoxynucleosideH-phosphonateintermediates",NucleicAcidRes.，14，5399-5407)和載體合成方法(Beaucage等，(1981)TetrahedronLetters22:1859-1862)以及氨基磷酸酯技術(Caruthers，M.H等,"MethodsinEnzymology，'1Vol.154，pp.287-314(1988))、美國專利5,153,319、5,132,418、4，500，707、4，458，066、4，973，679、4，668，777和4，415，732，以及在"SynthesisandApplicationsofDNAandRNA，，，S.A.Narang，editor,AcademicPress,NewYork,1987中描述的其它方法，以及其中包括的參考文獻，以及非亞磷醯胺技術。固相合成法有助於寡核苷酸從雜質和過剩的試劑中分離。一旦從固體載體分離，寡核苷酸可以進一步通過已知的技術分離。本發明的抑制性多核苷酸本發明廣泛提供了用於一旦進入呼吸道病毒病原體感染的細胞中就能引起RNA幹擾現象的寡核苷酸。本發明，雖然不限於呼吸道病毒靶標的種類，但重點是靶向RSV和多種甲型流感林的寡核苷酸。RNA幹擾通過合適的雙鏈RNA在細胞中發生，所述的雙鏈RNA的一條鏈與病毒靶基因中的序列一致或高度相似。通常，靶向呼吸道病毒的寡核苷酸可以是DNA或RNA，或者它可能包含核糖核普酸和脫氧核糖核苷酸的混合物。後者的實例是在3'末端以脫氧二核苷酸序列，例如d(TT)、d(UU)、d(TU)、d(UT)，以及其它可能的二核苷酸的終止的RNA序列。在另外的實施方案中，3'突出端可以由具有上面指定鹼基或其它鹼基的核糖核苷酸構成。此外，寡核苷酸藥物製劑可以是單鏈的或雙鏈的。本發明的治療性寡核苷酸的數個實施方案可以認為是寡核糖核苷酸或具有3'd(TT)末端的寡核糖核苷酸。單鏈的靼向多核苷酸，一旦進入哺乳動物細胞中，容易通過細胞中存在的內源性酶活性轉化成雙鏈分子。最一般的，本發明提供了長度可以是15個核苷酸至200個核苷酸的任何長度的寡核苷酸或多核苷酸。多核苷酸包括靶向呼吸道合胞體病毒或甲型流感病毒的基因組的笫一核苷酸序列。所述的笫一核苷酸序列由a)其長度是15-30之間任何數目的核普酸的序列，或b)它的互補序列構成。這種多核苷酸在這裡稱為線性多核苷酸。圖3提供了本發明多核苷酸的某些實施方案的示意圖。本發明/>開了在RSV或多種甲型流感林中的靶序列，或在某些方案中公開了與靶序列稍微錯配的siRNA序列，所有的這些在SEQIDNO:1-263中提供。在此公開的序列長度為19個核苷酸至25個核苷酸。靶向序列在圖3中通過淺的陰影區段表示。圖3小圖A,a)闡明了一個實施方案，其中顯示為"SEQ"的公開序列可以任選地包含於全長可以達到200個核苷酸的更長的多核苷酸中。本發明另外提供的是，在靶向多核苷酸中，選自SEQIDNO:1-263的序列可以是更長的靶向序列的部分，這樣該靶向多核苷酸就可以靶向比由SEQ表示的第一核苷酸序列長的病毒基因序列。這在圖3，小圖A,b)中得以闡明，其中完整的靶向序列用多核苷酸上方的水平線顯示，並且用在SEQ區段周圍的較暗的陰影顯示。如在多核苷酸的所有實施方案中，這種較長的序列可以任選地包含於更長的多核苷酸(長度為200或少於200的鹼基)中(圖3,小圖A,b)。本發明進一步提供了是任意SEQIDNO:1-263的片段的序列，所述的片段長度至少為15個核苷酸(並且至多比參照SEQIDNO:短一個鹼基；在圖3，小圖A，c)中說明)，以及其中多達5個核苷酸可以與SEQIDNO:1-263提供的靶序列不同的序列(在圖3,小圖A，d)中闡明，在該實例中顯示了由三條較暗的直條表示的三個不同的鹼基)。本發明更進一步提供了與任何的上述序列互補的序列(在圖3，小圖A,e)中顯示，並稱為"C0MPL")。任何這些序列包含於本發明的寡核苷酸或多核苷酸中。本發明的任何線性多核苷酸可以只由在上面a)-e)中描述的序列構成，或者任選可以包含另外的鹼基達到200個核苷酸限制。由於RNA幹擾需要雙鏈RNA,靶向多核苷酸本身可以是雙鏈的，該雙鏈包括與SEQIDNO:1-263提供的至少一個序列互補並與其雜交的第二條鏈，或者可依靠細胞內過程來產生互補鏈。從而，多核苷酸可以是單鏈的，或者它可以是雙鏈的。在更進一步的實施方案中，多核苷酸僅包含脫氧核糖核苷酸，或者它僅包含核糖核苷酸，或者它包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸兩者。在於此描述的多核苷酸的重要實施方案中，靶序列由長度可以是15個核苷酸(nt),或16nt、或17nt、或18nt、或19nt、或20nt、或21nt、或22nt、或23nt、或24nt、或25nt、或26nt、或27nt、或28nt、或29nt、或30nt的序列構成。依然在另外有利的實施方案中，靶向序列可以與病毒病原體基因組中的靶序列有多達5個鹼基的差別。在本發明的多個實施方案中，多核苷酸是由靶向序列構成的siRM，其任選包含如在此描述的3'二核苷酸突出端。備選地，鑑於在RM幹擾中需要雙鏈RM，寡核苷酸或多核苷酸可以製備形成分子內髮夾環狀的雙鏈分子。這種分子由先前段落的任何實施方案中描述的第一個序列、後面的短的環序列、該環序列後面依次接著的與第一個序列互補的笫二個序列構成。這種結構形成了期望的分子內髮夾結構。而且，據公開這種多核苷酸同樣具有200個核苷酸的最大長度，這樣，列舉的這三種需要的結構可以構成具有任何全長達到200個核苷酸的任何寡核苷酸或多核苷酸。髮夾環狀的多核苷酸在圖3，小圖B中說明。作為耙標的RSV株對於RSV，儘管可以粑向病毒基因組的任何部分，合理的是耙向編碼病毒特異性酶促功能的基因應該提供有效的候選siRM。這些基因包括L、F、G和P基因。L基因，位於病毒基因組的5'末端，只少量地表達，因此有效的RNAi沉默可能只需要少量的siRNA。也可以靶向結構基因。RSV亞型A和B的以下代表性病毒林的序列可用於選擇耙序列，所述的靶序列是亞型A和B之間共有的(表1)或者是亞型A特異性(表2)或亞型B特異性(表3)。亞型A:A2林(GenBankM74568)和Long林(僅P-mRNA，GenBankM22644和F-mRNA，GenBankM22643)。亞型B:Bl抹(GenBankNC-001781)和林9320(GenBankAY353550)。比對病毒基因序列以尋找共有的或特有的區域。對於每種靶基因或區，選擇至少兩個靶標，除非不適用(NA)。尋找兩種亞型共有的靶序列比尋找它們之一特有的靶標更困難，因為只存在非常少的同源或相同的序列可利用。表1.RSV亞型A和B(A2、Bl和9230株)共有的耙基因tableseeoriginaldocumentpage28在這種情況(表1)下，有時需要將錯配引入至RNA雙鏈體一個末端的5'鹼基中。表2.亞型A特異性靶標基因(林A2&Long林的F/P)tableseeoriginaldocumentpage29M=不適用tableseeoriginaldocumentpage30為了提供靶向病毒基因組的5'末端的siRNA試劑，林Bl或林9320單獨特有的末尾-靶標在下面顯示(表4)。該(+)鏈(抗-基因組RNA)的5'末端是靶標，即病毒基因組開始複製時使用該正RNA鏈(抗基因組RNA)作為模板產生的新生引導序列。表4.RSV亞型B的兩種抹的尾部耙標tableseeoriginaldocumentpage31用在伴闢伴孕標出的鹼基表示錯配。基於在上述表l-表4中列出的靶標，siRNA可以如下產生a)提供3'-dTdT突出端給雙鏈siRNA的每條鏈，b)在需要"錯配"的情況下，將G:C改為G:T或G:A;A:T將會改成A:C或A:G;並且C:G將會改成C:T或C:A。作為靶標的曱型流感抹在(+)鏈mRNA序列中的，25和19個核苷酸長度的siRM乾序列已經在所有的8個片段中得以確定。該序列在表5-表12中顯示。siRNA序列來自8個片段的每一個。每個序列的片段也顯示了從5'末端的mRM中的起始核苷酸位點。表5.靶向甲型流感林的血凝素基因(A/chicken/Thailand/CH-2/2004(H5N1);GenBankAY649382)的siRNA序列。tableseeoriginaldocumentpage32表6.靶向甲型流感病毒的基質蛋白2和基質蛋白1(M)基因(A/Thailand/1(KAN-1)/2004(H5N1);GenBankAY626144)的siRNA序列。起始核苷酸no.序列tableseeoriginaldocumentpage33表7.靶向甲型流感病毒的神經氨酸酶基因(A/chicken/Thailand/CH-2/2004(H5Nl);GenBankAY649383)的siRNA序列。tableseeoriginaldocumentpage34表8.靶向曱型流感病毒的核殼體蛋白(NP)基因(A/Thailand/1(KAN-1)/2004(H5N1);GenBankAY626145)的siRNA序列。tableseeoriginaldocumentpage35表9.靶向甲型流感病毒的非結構蛋白1和非結構蛋白2(NS)基因(A/Thailand八(KAN-l)/2004(H5Nl);GenBankAY626146)的siRNA序列。起始核香酸NO.序列seqidto:82TCTTTGGCATGTCCGCAAACGAnT1"299GACA濕ctctos-雄aaa微caa"2509CCATOrcTTCTCTKXAGGACATA143564TCCTCATCGGAGGACTKMATGGAA144鄉CCTCATCGOA織CTTOMTGOMT145TC微微CTTCAATGGAATGATM〗46GAGTCACTGAAACTATACAGAGATT147827GCAAGAGATAAGAG(XTTCTCGTTT148咖GAGCCTTCTCGTTTCAGCTTATTTA149柳GCCTrCTCCTrrCAGCmrn'AAT15048o;aacacto爾caagctt15163gctttcagotagacto:tt〗5288GCATGTCCGCAAAC腿TT153165CCCTAAGAGGAAGAGGCAA154253GGAGTCTGATAAGGCACTT355324GGGACTG€TTCATGCTCAT，56330GGTTCATGCrCATGCCOAA157337GCTCATOCCCAAGOAGAAA840GCCTTCTCGTTTCACOTA譜841CCTTCTCGTTrcAGCTTAT160表10.靶向曱型流感病毒的聚合酶酸性蛋白(pa)基因(A/Thailand/1(KAN-1)/2004(H5N1);GenBankAY626147)的siRNA序列。tableseeoriginaldocumentpage37表11.靶向甲型流感病毒的聚合酶鹼性蛋白1(PB1)基因(A/Thailand/1(KAN-1)/2004(H5N1);GenBankAY626148)的siRNA序列。tableseeoriginaldocumentpage38表12.靶向甲型流感病毒的聚合酶鹼性蛋白2(PB2)基因(A/Thailand/1(KAN-1)/2004(H5N1);GenBankAY626149)的siRNA序列。tableseeoriginaldocumentpage39用於選擇靶向曱型流感的有效siRNA候選序列的另一種方法是，集中於兩種重要的病毒表面糖蛋白，即血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的亞型特異性。已報導能引起人感染的亞型是H5N1、H7N7和H9N2。下面是亞型特異性HA和M靼標的實例。表13.固l血凝素(HA)的siRNA耙序列(基於GenBankDQ023145GI:66775624):tableseeoriginaldocumentpage40表15.H5N1神經氨酸酶(NA)的siRNA靶序列(基於GenBankDQ023147，GI:66775628)。tableseeoriginaldocumentpage41上述序列是六種H5N1林共有的，所述的MNl林從2001年和2003年之間中國的經HPAI病毒感染的雞或豬分離。這些MNl林在下面的表16中列出。表16No.定義登記號AY747618,GJLS41265326Sl您9，敬，娜27表17.H7N7血凝素(HA)的siRNA耙序列(基於GenBankAY999986,GI:66394837):tableseeoriginaldocumentpage42所有這些上述的序列是六種H7N7株共有的，所述的H7N7株從2002年瑞典的野鴨分離。這些H7N7林在下面的表18中列出。通過比較這這六種HA序列，發現HA1相關的結構域具有更高頻率的點突變，因而，從HA2結構域選擇10個靶標。表18tableseeoriginaldocumentpage42確定了對抗多種曱型流感H5N1mRNA序列的另外的siRNA雙鏈體。這些在表19中顯示。它們的位置在圖4中說明。表19.粑向H5N1禽流感的RNAi序列tableseeoriginaldocumentpage42siRNA的組合物本發明的多個實施方案提供了包含兩種或多種寡核苷酸或多核苷酸的藥物組合物，所述的每種寡核苷酸或多核苷酸包含靶向呼吸道病毒的基因組中的基因的序列。相關的實施方案提供了使用該組合物治療細胞的方法和治療呼吸道病毒感染的方法，以及這些組合物在生產用於治療呼吸道病毒感染的藥物組合物中的用途。該組合物的獨立多核苷酸成分可靶向病毒病原體基因組中的相同基因或不同基因的不同部分，或一個基因以及多個基因的數個部分。使用寡核苷酸或多核苷酸的組合的一個優勢是，抑制所考慮基因的表達的效果在組合時增加。效果。通過乾向病毒基因組中的多個基因在抑制病毒複製方面獲得了增加的效果。藥物組合物本發明的靶向多核苷酸在此稱為"活性化合物"或"治療劑"。這些治療劑可以整合至適合施用給受試者的藥物組合物中。如此處使用的，"可藥用載體"旨在包括任何和所有與藥物施用兼容的溶劑、分散介質、包被物、抗細菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等。合適的載體由Delgado和Remers、Lippincott—Raven在教科書例如Remington'sPharmaceuticalSciences,GennaroAR(Ed.)20thedition(2000)Williams&WilkinsPA,USA，和WilsonandGisvold'sTextbookofOrganicMedicinalandPharmaceuticalChemistry中描述，將其在這裡通過引用作為參考。可用於這些載體或稀釋劑中的成分的優選實例包括(但不限於)水、鹽水、磷酸鹽、羧酸鹽、胺基酸溶液、林格氏溶液、右旋糖(葡萄糖的同義詞)溶液和5%的人血清白蛋白。作為非限制性的實例，右旋糖可以作為5%或10%的含水溶液使用。也可以使用脂質體和不含水栽體如不揮發性油。這些介質和試劑作為藥物活性物質的使用是本領域熟知的。輔助性的活性化合物也可以整合至組合物中。本發明的藥物組合物配製成與其期望的施用途徑相協調。施用途徑的實例包括腸胃外的，例如靜脈內、皮內、皮下、經口、經鼻、通過吸入、經皮膚(局部)、經黏膜和直腸施用。用於腸胃外、靜脈內、皮內或皮下施用的溶劑或混懸劑包括下列成分無菌稀釋液如用於注射的水、鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶劑；抗菌劑如苯曱醇或尼泊金甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩衝劑如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及用於調節張力的試劑如氯化鈉或葡萄糖。對於通過吸入施用，化合物是以噴霧劑的形式從含有合適的推進物例如氣體(如二氧化碳)的壓力容器或分配器遞送，或者從噴霧器遞送。在一個實施方案中，將活性化合物和防止化合物從體內快速清除的載體一起製備，如控釋製劑，包括埋植劑和微嚢遞送系統。持續釋放製劑的合適實例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半透性基質，所述的基質是成形的商品形式，如薄膜或微膠嚢劑。持續釋放基質的實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-曱基丙烯酸羥乙酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利No.3,773,919，在此通過全文引用作為參考)、L-穀氨酸和L-穀氨酸y乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPR0NDEPOT(由乳酸-羥基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射的微球體)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然聚合物例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能夠使分子釋放超過100天，但某些水凝膠在較短時間周期內釋放藥物活性劑。有利的聚合物是生物可降解的或生物相容的。脂質體混懸劑(包含針對受感染細胞的脂質體，脂質體含有針對病毒抗原的單克隆抗體)也可以用作可藥用載體。這些可以根據本領域那些技術人員已知的方法，例如，如在美國專利No.4,522,811中描述的方法製備。具有有利形式(例如微球體形式)的持續釋放的製劑可以從材料如上面描述的那些製備。本發明的siRNA多核苷酸可以插入至載體中並且用作基因治療載體。基因治療載體可以通過任何多種途徑，例如，如在美國專利No.5,703,055中描述的途徑的任任途徑遞送給受試者。因而遞送也包括，例如靜脈內注射、局部施用(見美國專利No.5,328,470)或立體注射(見，例如Chen等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:30S4-3057)。基因治療載體的藥物製劑可以包括可接受稀釋劑中的基因治療載體，或者可以包括基因遞送載體嵌入其中的緩釋基質。備選地，其中全部的基因遞送載體可以從重組細胞完整地產生，例如逆轉錄病毒載體，藥物製劑可以包括產生基因遞送系統的一種或多種細胞。藥物組合物可以與施用說明書一起包含於試劑盒，例如容器、包裝或分配器中。也包含於本發明的是，治療劑在生產用於在受試者中治療呼吸道病毒感染的藥物組合物或藥劑中的用途。遞送在多個實施方案中，本發明的siRNA多核苷酸通過脂質體介導的轉染，例如通過4吏用可商業獲得的製劑或4支術，如01igofectamineTM、LipofectAmineTM試劑、LipofectAmine2000(Invitrogen乂>司)以及通過電穿孔法和類似技術遞送至培養基中的細胞中。另外，siRM多核苷酸通過吸入和滴注入呼吸道中來遞送給動物模型，例如嚙齒類或非人的靈長類。用於動物模型的另外的途徑包括靜脈內(IV)、皮下(SC)和相關的施用途徑。含有siRM的藥物組合物包含保護siRNA穩定性、延長siRM壽命、加強siRM功能，或者使siRNA靶向特定的組織/細胞的的另外的成分。這些包括多種生物可降解的聚合物、陽離子聚合物(例如聚乙烯亞胺)、陽離子共聚多肽例如組氨酸-賴氨酸(HK)多肽(見，例如Mixson等的PCT出版物W001/47496、Biomerieux的W002/096941，和MassachusettsInstituteofTechnology的WO99/42091)、PEG化陽離子多肽，以及配體整合的聚合物等、正電荷的多肽、PolyTran聚合物(天然的多糖，也稱為硬葡聚糖)、由耙向配體綴合的聚合物組成的毫微粒(TargeTran變體)、表面活性劑(Infasurf;ForestLaboratories,公司；0NY公司)，以及P曰離子聚合物(例如聚乙烯亞胺)。Infasurf(calfactant)是用於氣管內滴注的從牛肺分離的天然肺表面活性劑；它包含磷脂類、中性脂類和與疏水性表面活性劑-結合的蛋白質B和C。聚合物可以是一維或多維的，並且還可以是直徑小於20微米、在20-100微米之間或大於100微米的微粒或毫微粒。所述的聚合物可以攜帶對受體或特殊組織或細胞的分子的特異性的配體分子，從而可用於siRNA的靶向遞送。siRNA多核苷酸也可以通過基於陽離子脂質體的載體，例如DOTAP、DOTAP/膽固醇(Qbiogene公司)和其它類型的脂質含水溶液遞送。而且，低百分比(5%-10%)的葡萄糖含水溶液，以及Infasurf是用於導氣管遞送siRNA的有效載體3°。使用懸浮於5%葡萄糖和Infasurf的經口-氣管遞送溶液中的螢光標記的siRNA,通過螢光顯微術檢驗，已經顯示在siRNA通過鼻孔或通過經口-氣管途徑遞送至小鼠中並洗滌肺組織後siRNA廣泛分布於肺中(參見共同擁有的W02005/01940，在此通過全文引用作為參考)。據顯示，將siRNA遞送至小鼠的鼻道和肺(上呼吸道和呼吸道深處)中成功地沉默了與質粒中的siRNA同時遞送的指示基因(GFP或螢光素酶)，所述的質粒含有該指示基因和siRNA靶標的融合物(見共同擁有的WO2005/01940)。另外，由發明人(與其它人一起工作)報導的實驗已經證明，在SARS感染的恆河猴中siRNA物質抑制SARS冠狀病毒的複製，從而減輕肺部病狀3°。siRNA重組載體本發明的另一方面關於含有本發明siRNA多核苷酸的載體，優選為表達栽體。如在此使用的，術語"載體"意指能夠轉運其已經連接的另一種核酸的核酸分子。一種類型的載體是"質粒"，其指另外的DNA片段可連接至其中的環狀雙鏈DNA環。另一種類型的載體是病毒載體，其中另外的DNA片段可以連接進該病毒基因組。某些載體能夠引導它們有效連接的基因的表達。這種載體在此指"表達載體，，。一般而言，用於重組DNA技術中的表達載體常常是質粒形式。在本說明書中，"質粒"和"載體"可替換使用，由於質粒是最普遍使用的載體形式。然而，本發明旨在包括提供等價功能的這種其它形式的表達載體，例如病毒載體(如複製缺陷性逆轉錄病毒、腺病毒和腺病毒伴隨病毒)。本發明的重組表達載體包含適合核酸在宿主細胞中表達的形式的本發明核酸，這表示重組表達載體包含有效連接至要表達的核酸序列的一個或多個調控序列，所述的調控序列的選擇是基於用於表達的宿主細胞。在重組表達載體中，"有效連接"旨在表示目標核苷酸序列以允許該核苷酸序列表達(例如，在體外轉錄/翻譯系統中或當載體引入進宿主細胞時在細胞中)的方式連接至調控序列。術語"調控序列，，旨在包括啟動子、增強子和其它的表達控制元件(例如，多腺苷酸化信號)。這種調控序列例如在Goeddel(1990)GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY185，AcademicPress,SanDiego，Calif中描述。調控序列包括在許多類型的宿主細胞中引導核苷酸序列組成型表達的那些調控序列和只在某些宿主細胞中引導核苦酸序列表達的那些調控序列(例如，組織特異性調控序列)。然而在另一個實施方案中，本發明的核酸使用哺乳動物表達栽體在哺乳動物細胞中表達。哺乳動物表達載體的實例包括pCDM8(Seed(1987)Nature329:840)和pMT2PC(Kaufman等，(1987)EMB0J6:187-195)。當在哺乳動物細胞中使用時，表達栽體的控制功能通常由病毒調控元件提供。例如，普遍使用的啟動子源於多瘤病毒、腺病毒2、巨細胞病毒和猿猴病毒40。另外的載體包括微小染色體例如細菌人工染色體、酵母人工染色體或哺乳類人工染色體。對於其它對原核細胞和真核細胞兩者適合的表達系統，參見，例如Sambrook等的第16和17章,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL.2nded.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989。在另一個實施方案中，重組哺乳動物表達栽體能夠優選在特殊細胞類型例如呼吸道的細胞中引導核酸的表達。組織特異性調控元件是本領域已知的。本發明進一步提供了包含克隆進表達載體的本發明DM分子的重組表達載體。DNA分子以允許RM分子表達(通過DNA分子轉錄)的方式有效地連接至調控序列，所述的RNA分子包含靶向病毒RM的siRM。可以選擇有效連接至核酸的調控序列來引導RNA分子在多種細胞類型中的連續表達，例如病毒啟動子和/或增強子，或者可以選擇調控序列來引導反義RM的組成型的、組織特異性或細胞類型特異性表達。載體DNA可以通過常規的轉化或轉染技術來介導進原核或真核細胞中。如在此使用的，術語"轉化"和"轉染"旨在指用於將外來核酸(如DNA)介導進宿主細胞中的多種領域公認的技術，包括磷酸鋦或氯化4丐共沉澱、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂轉染或電穿孔。用於轉化或轉染宿主細胞的合適方法可以在Sambrook等，(2001)、Ausubel等，(2002)，以及其它實驗室手冊中找到。病毒滴度或數量的檢測方法在實踐中，本發明檢測病毒可以通過多種方法完成。作為非限制性的實例，這些方法之一是免疫印跡法(蛋白質印跡)、免疫沉澱法(I.P)，以及組合的逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測法等。這樣的方法測量可能存在於感染的組織培養基的溶解產物或上清液中的耙標mRM或它們的蛋白質產物的合成的減少。同樣，這些檢測法可以用作診斷方法，用於測量靶標mRNA或它們的產物的合成的減少，所述的耙標mRM或它們的產物可能存在於從感染的動物或人受試者獲得的勻化的組織樣品、鼻咽洗出液、分泌物中。在RT-PCR檢測法中，病毒基因組RNA的合成用引物來測定，所述的引物與跨越NS1和NS2ORF之間的結合處的序列互補。使用NS1/NS2引物的這種RT-PCR的結果將反映全部基因組RNA的合成。方法進一步包括其中siRNA誘導的組織培養基中病毒複製的幹擾通過實時定量PCR(RTQ-PCR)、TCID50、病毒噬菌斑檢測法、螢光免疫檢測法，以及免疫組織化學等測量的檢測法，如本發明領域中熟練的技術人員已知的。另外，方法進一步包括檢測病毒存在，採用上述TCID50方法來監控組織培養基中病毒複製的抑制，其中病毒的滴定度通過任何類型的細胞致病滴定終點測量，作為非限制性的實例，包括細胞融合、細胞病變效應(CPE)、細胞吸附等。方法進一步包括其中在實驗動物中所述siRNA介導的病毒複製通過RTQ-PCR、病理學、免疫組織化學和病毒的再分離法(re-isolationofvirus)等測量的檢測法。設計了用於RT-PCR測定法的引物，所述的RT-PCR測定法用於測量通過RNAi引起的mRM合成的減少。RT反應用六聚物或聚-dT引物起始；並且PCR通過使用對siRM靶向的每種基因特異的上遊和下遊引物來完成。對於基因組RNA合成的檢測，設計一對引物(下遊和上遊)與NS1和NS20RF中的序列一致。使用"跨越結合點(joint-crossing)的，，引物而不是與病毒基因組的任一末端互補的引物的目的是避免難以控制的大的整個RM轉錄產物(大約15K-nt長)。通過設計，這種RT-PCR的產物將反映全部基因組RNA的合成。已經確定的引物和RT-PCR產物的大小在下表20、21和22中列出。表20.用於RSV林A2(亞型A)的引物。tableseeoriginaldocumentpage49tableseeoriginaldocumentpage50實施例實施例1.在細胞培養基中抗-H5Nl甲型流感的siRNA分子的效力。本實施例報導了培養基中siRNA對H5Nl-感染細胞的抑制效果的評估。siRNA的設計與合成產生了分別耙向H5N1的NP(NP-1&NP-2;表19，SEQIDNOS:)和M2(M2-l&M2-2;表19，SEQIDNOS:)基因的兩種siRNA。這些siRNA的耙序列可在許多H5N1病毒林中觀察到(例如gi147834945-10-1506、gi|8452827-H497、gi113925158誦46-1542、gi|61927237_46-1542、gi|59940391—44->1535、gi19802277—46-1542)。在5'-有義鏈處用螢光素標記的ds-siRNA通過ProligoBioTechLtd(巴黎，法國)化學合成。它們的抗-H5Nl效力在用H5N1病毒感染的siRNA-轉染的MDCK細胞(Madin-Darby犬腎；ATCCNumber:CCL-34，Manassas,VA)中測定。如下面描述的，對H5N1的抑制通過細胞病變效應(CPE)測定，通過標準TCID5。(50%組織培養物感染劑量)方法反滴定在培養基中釋放的病毒並且使用實時RT-PCR來定量細胞內的病毒RNA。細胞培養siRNA轉染和H5N1病毒感染將MDCK細胞培養和維持於具有10%胎牛血清(FBS，Invitrogen公司)的MEM培養基中。將大約5000個細胞裝入96-孔平板的每個孔中用於病毒感染和複製檢測。用與0.5mLipofectamine2000(Invitrogen,CA)混合的100、50、25和12.5nM的siRNA轉染細胞。無關的siRNA靶向的螢光素酶(GL2i)或siRNA靶向的SARS冠狀病毒(C-l)和轉染子Lipofectamine2000單獨(C-2)包含於實驗中作為陰性對照。轉染後6小時，在H5N1病毒感染之前移除培養基並用PBS洗滌細胞兩次。將稀釋於具有1%FBS的MEM中100微升的100TCID5。H5N1病毒(林:A/香港/486/97)7加入至轉染的細胞中。分別在感染後的12、16和24小時收集培養上清液和細胞用於檢測釋放的病毒滴度和細胞內的病毒RNA拷貝。感染後的24小時，在相差顯微鏡檢查下觀察和記錄CPE。將該實驗以一式三份進行並至少重複3次。定量RT-PCRQ-RT-PCR如下完成。全部的細胞內RNA根據生產商的說明書，使用RNeasyMinikit(Qiagen/〉司，德國)分離。逆轉錄實驗4吏用The函ScriptRT-PCR系統(Invitrogen公司，力口拿大)，通過寡-dT引發進行。隨後使用在表23中顯示的引物完成實時PCR。表23.用於Q-RT-PCR的H5N1引物tableseeoriginaldocumentpage52將5ja1RT產物(模板)、1|il的每種正向引物和反向引物(終濃度為500nM)、2ju125mMMgCl2和9jj1的水與2jn1的SYBRGreenIMasterMix(Roche,美國)MasterMix混合併且使用ABI7900序列檢測系統完成實時定量。PCR條件是在50。C下5分鐘，95。C下IO分鐘，然後循環40個循環的95t:下10秒鐘、61。C下5秒鐘以及在72。C下5秒鐘。肌動蛋白的拷貝作為內部對照也進行測量。計算每1000個p-肌動蛋白拷貝的細胞內病毒RNA的拷貝數，並表示為與未處理對照比較的相對病毒RNA拷貝(處理的拷貝/未處理的拷貝x100%)。病毒滴定度的測量用或未用siRNA處理的培養基中的病毒滴定度如下測定。簡而言之，將來自感染細胞的條件培養基在具有1%FBS的MEM中IO倍系列梯度稀釋。根據標準TCIDs。方法將每種稀釋物用於感染細胞。簡而言之，在感染之前16小時將細胞裝入96-孔器皿中。感染後72小時，在相差顯微鏡檢查下觀察CPE並測定CPE-陽性(CPE+)細胞。隨後如下評估TCID5。(大於50%的稀釋度時的％孔(CPE+))-50。/(大於50K稀釋度時的54孔(CPE+))-(小於50%稀釋度時的％孑L(CPE+))其中，h-內插稀釋梯度的logw值，其加至高於50%的值的logi。梯度。計算感染病毒滴定度並同未處理對照相比而表示成產生的相對病毒(處理的滴定度/未處理的滴定度x100%)。結果siRMNP-1處理(表19)在濃度為12.5-100nM時大於99%地減少了培養基中H5N1病毒的產生(圖5，小圖A)和細胞中病毒RNA拷貝的複製(圖5，小圖B)，而用靶向NP-2的siRNA處理(表19)在濃度為100nM時只抑制了細胞培養基中約60°/。的病毒生長。相反，不相關的siRNA處理對照(C-l)和用載體處理的對照(C-2)同未處理對照相比沒有顯著地抑制病毒生長。用針對M2-l的siRNA處理(表19)在不同濃度時也顯示出對病毒生長(圖5，小圖C)和病毒RNA複製(圖5，小圖D)有約80-94%的抑制效果，然而針對M2-2的siRM在濃度為100nM時顯示出大約60%的抑制效果，但更低試驗濃度沒有抑制效果。在另一個實驗中，培養基中的細胞用50nM的多種siRNA處理。在三個時間點收集培養基上清液中產生的病毒。通過測定感染培養基中50%的細胞所需的組織培養感染劑量(TCID5。)滴定樣品(圖6，小圖A;注意這在對數縱軸刻度上顯示)。病毒RNA拷貝數/1000個P-肌動蛋白拷貝數通過實時RT-PCR測定(圖6，小圖B)。不相關的siRM(C-l)和轉染子(C-2)在實驗中用作對照。發現NP-1和NP-2siRNA高度有效地抑制了病毒顆粒的生長和病毒RNA的增加。Ml-1和M2-2siRNA的使用部分有效地防止了病毒複製。該實施例中的結果顯示，針對H5N1基因組中不同基因的多種siRNA高度有效地抑制了培養基中生長的感染細胞中的病毒複製。實施例2.針對H5N1曱型流感的siRNA的組合。確定了針對H5N1基因組中不同基因的siRNA組合以便提供有效的抗-H5Nl活性。該實施例顯示了兩種這樣的組合。組合A:NP-1:5'-GGAUCUUAUUUCUUCGGAGWTdT)^'(SEQIDNO:256)、M2-l:5'-ACAGCAGAAUGCUGUGGAU(dTdT)-3'(SEQIDNO:260)和HA-1:5'-TGGTAGATGGTTGGTATGG(dtdt)-3'(SEQIDNO:221、鹼基3-21，加上3'末端(dtdt))。組合B:NP-1:5'-GGAUCUUAUUUCUUCGGAG(dTdT)-3'(SEQIDNO:256)、M2-l:5'-ACAGCAGAAUGCUGUGGAU(dTdT)-3'(SEQIDNO:260)和NA-1:5'-TCTGTATGGTAATTGGAAT(dtdt)-3'(SEQIDNO:230、鹼基3-21，加上3'末端(dtdt))。實施例3.siRNA對細胞中的乾基因和病毒複製的體外抑制在該實施例中，靶向不同的呼吸道病毒基因，能最有效地沉默同源耙基因或抑制病毒複製的siRNA和siRNA的組合，在細胞培養基中通過實驗得以確定。在體外有效的siRNA是需進一步在體內實驗和使用的候選物。將允許培養的細胞系，例如A549(作為非限制性實例)(ATCCNumber:CCL-185,II型肺泡上皮肺癌細胞系)用RSV病毒抹或曱型流感病毒抹如H5N1感染，並且然後用多種siRNA獨立地轉染或組合轉染。在組合的情況下，採用耙向一個單基因的兩種siRNA或耙向兩個或多個基因的siRNA的組合。單一的或組合的siRNA的總siRNA劑量保持相同。在不同的實驗方法中，siRNA轉染在RSV或曱型流感感染之前的數小時進行，或與病毒感染同時進行，或在感染後的數小時進行。這些不同的方法提供了試驗siRNA是否在細胞水平上顯示出預防和/或治療效果的信息。以多種方法檢測了對靶基因的抑制或病毒複製抑制的程度。檢測法的非限制性實例包括下列方法1)用細胞溶解產物和對抗給定病毒抗原的RSV或甲型流感特異性抗體進行免疫印跡(蛋白免疫印跡)。2)同上，用細胞溶解產物和如上對抗單個基因產物的RSV或曱型流感特異性抗體進行免疫沉澱法UP)。3)實施rvtr-PCR來證明mRNA轉錄的抑制或病毒RNA複製的抑制。設計了特定的引物來測定靼標基因的轉錄或測定試驗siRNA寡聚物是否也能夠耙向基因組RNA。4)基於細胞融合的TCID"的測量可用於比較經特異性siRNA處理和不相關的對照siRNA處理的細胞培養物，用於監控病毒複製的抑制。5)免疫螢光或免疫組織化學也可以用於滴定病毒滴度，從而監控對病毒複製的siRNA-介導的抑制。實施例4.在小型動物模型中通過siRNA對乾基因的抑制在該實施例中，檢驗多種siRNA(單獨地或它們的組合)來測定它們在動物模型中治療RSV或禽流感H5N1的效力。通過吸入或滴注通過氣道用RSV或流感H5N1林感染受試動物。siRNA通過相同的途徑遞送，並且在RSV或流感H5N1感染之前，與其同時或在其之後施用。通過改變siRNA遞送時間，能夠獲得有關siRNA在試驗動物中抑制RSV或流感H5N1複製、減輕RSV或流感H5N1引起的病狀，和減輕類似RSV或流感H5N1症狀的效力的信息，以及有關RSV或流感H5N1特異性siRNA是否在動物中顯示出對實驗性RSV或流感H5N1感染有預防或治療效果的信息。雖然RSV和流感H5N1能夠感染廣的範圍的動物種類，但小鼠和棉鼠普遍用於RSV或流感H5N1動物模型研究中。齧齒動物的感染通常導致低水平至中等水平的病毒複製，複製在第四天達到峰值並迅速消失。這些動物未顯示出明顯的呼吸道疾病，但顯示出肺部病變。在高劑量的病毒感染時它們顯示出指示疾病的重量減輕、肺功能變化和毛髮折皺。將與上面實施例3中描述的相同的診斷檢測法用於在從動物獲得的樣品(例如鼻、口腔或咽喉拭子)上監控siRNA介導的基因沉默和對RSV或流感H5N1感染抑制。另外，進行肺病理學、肺免疫組織化學和症狀觀察來測定體內siRNA對RSV或流感H5N1感染的效力。實施例5.在非人靈長類動物模型中通過siRNA對耙基因的抑制該實施例描述了在非人靈長類中對RSV或流感H5N1病毒複製的siRNA介導的抑制的試驗。劑量施用的效力和安全性是該研究的主要目的。基於我們在用於另一種呼吸道疾病(SARS)的恆河猴模型上使用的方法，達到30mg/kg體重的siRNA的劑量是可容許的，對動物未顯示出毒性症狀。(")呼吸道遞送(通過吸入和滴注)在非靈長類哺乳動物中經預篩選的siRNA顯示出對病毒複製，以及減少病毒引起的病理學和疾病樣症狀(disease-likesymptoms)的重大的作用。對於該RSV或流感H5N1試驗，使用了相同的遞送途徑，並遞送相似劑量的siRNA。除了描述小型動物研究的試驗(實施例4)夕卜，下列檢測法容易在靈長類動物中實施並有助於更直接地評估治療效果。1)病毒脫落用受感染的猴子的鼻咽洗脫樣品測量病毒脫落。病毒產量通過TCID50(基於細胞融合)和/或螢光免疫檢測法滴定。2)鼻咽洗脫樣品的RTQ-PCR:以監控病毒基因組拷貝數量的變化。3)症狀監控當在人嬰兒患者中觀察時，可能發現細支氣管炎症狀。雖然已經就它的多個實例性實施方案來描述和闡明了本發明，但可以在其中和對它們作出等價的實施方案和多種其它的改變、添加和省略而不背離本發明的精神和範圍。參考文獻1.Holmes,E.C.2004，Science,303:1787-1788.2.Abbott,A.2003，Nature,424:121-123.1.YuenKY等，Lancet.351:467-71.1998.2.ClaasEC等，Lancet.351:472-7.1998.3.PeirisJS，...YuenKY等,Lancet.363:617-9.2004.4.世界衛生組織http://www,who,int/csr/disease/avian一influenza/country/cases-table-2005_06_28/en/index.html5.世界衛生組織http://鼎w，who,mt/csr/disease/avianinfluenza/6.LiKS，.，YuenKY等，Nature.430:209-13.2004.7.ChenH等，Nature.436:191-2.2005.8.LiuJ等,Science,www.sciencexpress.org/6July2005/Page1/10.1126/science.1115273.2005.9.BridgesCB等，JInfectDis181:344~8.2000.10.UngchusakK等，NEnglJMed352:333-40.200511.世界衛生組織http://www,who,int/csr/resources/publications12.Collins,R.M等，2001，Virology(4thed)，p.1443—1485.13.www,msdimmun.com14.Smith,D.W等，1991，NEnglJ.Med，P325:24-2915.Sharp,P.A.2001，Genes&Development,15:485-490.16.Tuschl,T.2001，Chembiochem，2:239-245.17.Dykxhoorn,D.M.等，2003，NatRevMo1CellBiol，4(6):457-67.18.Elbashi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