高產纖維素酶活力的菌株及其篩選方法和使用方法
2023-08-02 06:53:01
專利名稱：高產纖維素酶活力的菌株及其篩選方法和使用方法
技術領域：
本發明涉及釀酒領域，具體涉及一種高產纖維素酶活力的菌株，xqx-6，煙麴黴Aspergillus fumigatus保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址為武漢大學，郵編為430072，保藏號為CCTCC NO. M 2012231，及其篩選方法和使用方法。
背景技術：
纖維素酶是一種複合酶，主要由外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶等組成，它可將纖維素分解成多糖或單糖。纖維素酶在飼料、酒精、紡織和食品等領域具有巨大的市場潛力，已被國內外業內人士看好，將是繼糖化酶、澱粉酶和蛋白酶之後的第四大工業酶種，因此纖維素酶是酶製劑工業中的一個新的增長點。 纖維素酶廣泛存在於自然界的生物體中。細菌、真菌、放線菌、動物體內等都能產生纖維素酶。纖維素細菌的纖維素酶產量不高，主要是葡聚糖內切酶，而且大多數對結晶纖 維素沒有活性，所分泌的酶是胞內酶或吸附在細菌細胞壁上，很少能分泌到細胞外。纖維素放線菌的纖維素酶產量極低，研究很少。纖維素真菌產生的多為胞外酶，產酶效率高，而且纖維素酶的酶繫結構較為合理，同時產生許多半纖維素酶、果膠酶和澱粉酶等，是降解纖維素原料的主要類群。其中比較典型的有木黴屬(Trichoderma)、麴黴屬(Aspergillus)和青黴屬(Penicillium)。但產生纖維素酶的菌種多易退化，從而導致產酶能力降低。目前工業生產纖維素酶有兩種方法，液體發酵和固體發酵。液體發酵工藝控制簡單，容易擴大規模。但其生產原料多為葡萄糖，對生產設備及環境等都要求很高，且廢水處理量大，提高了生產成本。固態發酵法原料多採用纖維質原料，來源廣泛，價格低廉，但其得到的是纖維素酶曲，後期萃取、濃縮較為困難。這就導致目前市場上見到的纖維素酶多為液體發酵得到的，價格相對較高。因此，解決固態發酵後期處理問題是目前纖維素酶菌種低廉、聞效利用的關鍵。中國白酒產量巨大，其廢棄產物白酒丟糟每年可產生上千萬噸。白酒丟糟主要含有纖維素，半纖維素和木質素三種組分，此外還含有少量澱粉，粗蛋白等。其中僅少量白酒丟糟被用來生產動物飼料或產沼氣等，大部分白酒丟糟的利用已成為白酒廠亟待解決的問題。因此，利用白酒丟糟生產燃料酒精越來越受到大家的關注。但由於其自身結構原因，需對白酒丟糟進行預處理後才能用來發酵產生酒精。採用化學處理方法一般都需要在高溫高壓下，不僅生產成本高，而且過程繁瑣，不易操作，用生物方法可以很好的解決這一問題，但纖維素酶價格卻較貴。
發明內容
本發明提供一種高產纖維素酶活力的菌株及其篩選方法和使用方法，能夠提高白酒丟糟的發酵率。本發明提供了一種高產纖維素酶活力的菌株，xqx-6,煙麴黴Aspergillusfumigatus保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC N0.M2012231。
本發明還提供了一種上述的高產纖維素酶活力的菌株的篩選方法，包括如下步驟A.通過纖維素無機鹽液體培養基富集培育菌；B.將步驟A富集培育的菌在浸有無機鹽培養基的濾紙上進行一次或多次接種；C.獲取所述濾紙斷裂處的培養物並將其在羧甲基纖維素培養基平板上進行一次或多次劃線分離，得到純菌株；D.將步驟C得到的所述純菌株在無機鹽培養基中進行培養並進行纖維素分解；E.將步驟D中纖維素分解能力強的所述純菌株接種於滅菌的固態發酵培養基中進行培養；F.通過水浴法提取粗酶液並進行酶活力測定得到所述纖維素酶菌株。 所述步驟A、所述步驟B、所述步驟D中的所述無機鹽培養基優選包括以重量份數計，NH4NO3I 份，K2HPO4O. 5 份，KH2PO4O. 5 份，MgSO4O. 5 份，NaCl I. O 份，CaCl2O. I 份，FeCl3O. 02份，酵母膏O. 05份，水1000份；和/或，所述步驟A、所述步驟B、所述步驟D中的所述無機鹽培養基的PH值優選為7. O 7. 2。所述固體發酵培養基優選為白酒酒糟8份、麩皮4份、Mandels營養液1(Γ50份；所述Mandels營養液包括以重量份數計，ΚΗ2Ρ042000份、硫酸(NH4)2SO4HOO份、MgSO4. 7Η203000 份、CaCl2300 份、FeSO4. 7H20 5 份、MnSO4L 6 份、氯化 ZnCl2L 7 份、CoC122. O 份、溶於1000份蒸餾水；和/或，所述固體發酵培養基的PH值優選為5. O。在所述步驟A之前，所述篩選方法優選進一步包括通過無菌水進行溶解；步驟A包括取所述溶解後的懸液加入到含有纖維素無機鹽液體培養基的三角瓶中，靜置培養；和/ 或，所述步驟AJP /或所述步驟E中的培育溫度優選為28 32°C，培養時間為5 7天；和/ 或， 所述步驟B的接種量優選為10% ；和/ 或，所述步驟D的培養時間優選為7 28天。所述步驟E優選包括將步驟D得到的分解纖維素能力強的菌株培養成熟，刮下成熟的孢子，製成孢子菌懸液，取:T5mL的孢子菌懸液接種於滅菌的固態發酵培養基中，28 32 °C下培養5、天。所述步驟F優選包括在步驟E的固態發酵培養基中加入80 100毫升蒸餾水，在40 50°C的水浴提取I 2小時；用四層紗布過濾；離心分離得上清液；離心速率優選為3500轉/分鐘；對上清液進行纖維素酶酶活測定確定為高產纖維素酶活力的菌株。本發明還提供一種利用上述任一種所述的篩選方法篩選的上述的高產纖維素酶活力的菌株的使用方法，包括利用上述任一種所述的篩選方法篩選的上述的高產纖維素酶活力的菌株；所述菌株與釀酒酵母復配使用，以白酒丟糟、麩皮為主要原料進行發酵。所述白酒丟糟優選為溼白酒丟糟。
通過本發明提供一種高產纖維素酶活力的菌株及其篩選方法和使用方法，能夠達到如下的有益效果I.本發明提供一種高產纖維素酶活力的菌株及其篩選方法、使用方法，該菌株在篩選時經過無機鹽培養基培育、接種、羧甲基纖維素培養基平板劃線、將劃線得到的純菌株再進行無機鹽培養基培養並纖維素分解，將分解能力強的接種於滅菌的固態發酵培養基中培養，水浴法提取得到纖維素酶粗酶液；將此纖維素酶菌株同釀酒酵母、白酒丟糟、麩皮一起進行發酵，得到酒精。篩選到的纖維素酶菌株分解纖維素能力強、篩選條件簡單、易操作，在發酵酒精中不需要添加多餘的纖維素降解酶，利用篩選的菌株直接降解白酒丟糟中的纖維質成分產生可發酵糖類，進而發酵產生乙醇，達到高效分解白酒丟糟的效果。2.本發明中沒有將固態發酵產生的酶液提取出來製成纖維素酶，而是利用丟糟為發酵基質，在菌體發酵培養中產生的纖維素酶直接用於降解含大量纖維素的丟糟，即邊利用丟糟培養菌株產酶，邊利用產生的酶降解丟糟產生還原糖，不僅解決了纖維素酶固態發酵生產的後期萃取問題，還為利用白酒丟糟生產酒精提供了一條廉價、無汙染的有效途徑。3.本發明的篩選方法和使用方法均操作簡單，方法容易掌握，且原料來源廣泛，價格低廉,生產成本低。
為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，以下將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，以下描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員而言，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖所示實施例得到其它的實施例及其附圖。圖I為本發明一個實施例中高產纖維素酶活力的菌株的篩選方法基本流程圖。該生物材料保藏在中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCC NO. M2012231，保藏日期為2012年6月14日。
具體實施例方式以下將結合附圖對本發明各實施例的技術方案進行清楚、完整的描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動的前提下所得到的所有其它實施例，都屬於本發明所保護的範圍。本發明提供一種高產纖維素酶活力的菌株，中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCC NO. M 2012231，保藏日期為2012年6月14日，曲酶菌Aspergillusfumigatus。本發明還提供了一種上述高產纖維素酶活力的菌株的篩選方法，包括如下步驟A.通過纖維素無機鹽液體培養基富集培育菌；B.將步驟A富集培育的菌在浸有無機鹽培養基的濾紙上進行一次或多次接種；C.獲取所述濾紙斷裂處的培養物並將其在羧甲基纖維素培養基平板上進行一次或多次劃線分離，得到純菌株；D.將步驟C得到的所述純菌株在無機鹽培養基中進行培養並進行纖維素分解；
E.將步驟D中纖維素分解能力強的所述純菌株接種於滅菌的固態發酵培養基中進行培養；F.通過水浴法提取粗酶液並進行酶活力測定得到所述纖維素酶菌株。本發明篩選到的纖維素酶菌株分解纖維素能力強、篩選條件簡單、易操作。下面通過一些實施例來詳細描述下篩選過程，見圖1，所示101，選取待篩選的樣品；樣品的選取可以任意定，只要是通過纖維素髮酵釀製的白酒即可，本發明的一個具體實施例中採用的是習酒2010年I月發酵31的大曲。102，將樣品通過無菌水進行溶解、稀釋；
具體的操作步驟為將樣品放入容器中，加入無菌水，振蕩，搖勻。103，將102溶解、稀釋的樣品通過無機鹽培養基培育菌；具體的操作步驟為取部分或全部102溶解、稀釋的樣品加入到裝有纖維素無機鹽培養基的容器中，在28 32°C靜置培養，培養時間為5 7天。其中，無機鹽培養基包括=NH4NO3I份，K2HPO4O. 5 份，KH2PO4O. 5 份，MgSO4O. 5 份，NaCl
I.O 份，CaCl2O. I 份，FeCl3O. 02 份，酵母膏 O. 05 份，水 1000 份；PH 值為 7. O 7. 2。上面的份數均為重量份數，水可以以水的密度換算成體積的方式。104，將103培養的菌在浸有無機鹽培養基的濾紙上進行一次或多次接種；具體操作步驟為待103中培養的菌大量生長後，按一定的接種率(比如10%)接種到滲有無機鹽培養基的濾紙條上，靜置培養，培養溫度為28°C，待菌體大量生長後，再轉接到新鮮的無機鹽培養液中，接種率與上次相同，如此轉接數代。105，獲取所述濾紙斷裂處的培養物並將其在羧甲基纖維素培養基平板上進行一次或多次劃線分離，得到純菌株；具體操作步驟經過104多次接種後，觀察濾紙的斷裂情況，在濾紙斷裂處挑取培養物在羧甲基纖維素培養基平板上劃線分離，28°C培養獲得單菌落。為了得到較純的菌株，可以進行反覆劃線純化，期間可以結合顯微鏡鏡檢，直至純化得到純菌株。106，將105得到的純菌株在無機鹽培養基中進行培養並進行纖維素分解；具體操作步驟為將105得到的純菌株進行均分，放入裝有同樣的無機鹽基礎培養基的不同試管中，其中每個試管中浸泡一條濾紙，濾紙寬度依易於放入試管為宜，濾紙長度為5-7釐米。室溫培養7 28天，然後觀察每個試管中濾紙的分解情況，從中判斷菌株分解纖維素的能力。107，將106中纖維素分解能力強的所述純菌株接種於滅菌的固態發酵培養基中進行培養；具體操作步驟為將106中得到的分解纖維素能力強的菌株培養成熟，刮孢子懸液接種於滅菌的固態發酵培養基中，28 32°C下培養5-9天。所述固體發酵培養基包括以重量份數計，白酒酒糟8份、麩皮4份、Mandels營養液1(Γ50份；所述Mandels營養液包括按重量份數計，ΚΗ2Ρ0420 00份、硫酸(NH4)2SO4HOO份、MgSO4. 7Η20 3000 份、CaCl2300 份、FeSO4. 7H20 5 份、MnSO4L 6 份、氯化 ZnCl2L 7 份、CoC122. O份、溶於1000份蒸餾水；和/或，所述固體發酵培養基的PH值為5. O。108，通過水浴法提取粗酶液並進行酶活力測試得到高產纖維素酶活力的纖維素酶菌株。具體操作步驟為向發酵後的固態發酵培養基中加入蒸餾水，在4(T50°C水浴提取廣2小時，用多層紗布過濾(比如四層紗布)得到的液體紀委粗酶液。對粗酶液進行離心分離，離心速率為3500轉/分鐘，收集離心後的上清液。根據纖維素酶製劑輕工行業標準(QB2583-2003)對纖維素酶酶活力進行測定，選出高活力產纖維素酶的菌株。下面，通過一個較為具體的實施例來描述篩選方法實施例I :本實例所用原料為習酒2010年I月發酵31的大曲。稱取該大曲樣品10g，置於250mL裝有小玻璃珠的三角瓶中，加入90mL無菌水120r/min振蕩lOmin。取ImL懸液加入到纖維素無機鹽液體培養基的三角瓶中，28°C靜置培養。待菌體大量生長後，按10%接種到裝有濾紙條的無機鹽培養基中，28°C靜置培養數天，待菌體大量生長後，再轉接到新鮮的培養液中，接種量為10%，如此轉接數代，淘汰失去分解能力和不穩定的培養物。觀察濾紙條斷裂情況，在濾紙條斷裂處挑取培養物在羧甲基纖維素培養基平板上劃線分離， 28°C培養獲得單菌落。將單菌落反覆劃線純化，結合顯微鏡鏡檢，純化得到純菌株即為具有產纖維素酶能力的菌株。以白酒丟糟為碳源，從上述中篩選的菌株中篩選優良的高產纖維素酶的菌株。250mL三角瓶中裝入以白酒丟糟為碳源的固態發酵培養基。開始發酵前，接入培養成熟的孢子菌懸液5mL,於28°C下培養靜止培養,每天搖瓶一次。培養過程中定時取樣，以檢測固態發酵培養基中各纖維質成分的變化和纖維素酶活力。篩選出產纖維素酶活力最高的菌株xqx-6，煙麴黴AspergiIIus fumigatus保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址為武漢大學，郵編為430072，保藏號為CCTCC NO. M 2012231，保藏日期為2012年6月14日。本發明還提供了一種利用上述任一種所述的篩選方法篩選的上述的高產纖維素酶活力的菌株的使用方法，包括A.利用上述任一種所述的篩選方法篩選的上述的高產纖維素酶活力的菌株；B.所述菌株與釀酒酵母復配使用，以白酒丟糟、麩皮為主要原料進行發酵。本發明在發酵酒精中不需要添加多餘的纖維素降解酶，利用篩選的菌株直接降解白酒丟糟中的纖維質成分產生可發酵糖類，進而發酵產生乙醇，達到高效分解白酒丟糟的效果。釀酒酵母可以採用現有技術中的任意一種釀酒酵母。在本方法中，白酒丟糟為碳源，麩皮為氮源。本發明的酒精產率約為2% 7%，以幹白酒丟糟計。所述白酒丟糟優選為溼白酒丟糟。下面將通過幾個較為具體的實施例來詳細描述本使用方法實施例2 :利用實施例1中篩選的菌株xqx-6以白酒丟糟為碳源，發酵生產酒精。IOOOmL三角瓶中裝入幹白酒丟糟55g，麩皮27g，硫酸銨18g，水500mL，121°C高溫蒸煮20min。冷卻後接入xqx_6種子液25mL,安琪酵母種子液25mL,於30°C下直徑培養15d。其酒精產率為5%。實施例3 :利用實施例I中篩選的菌株xqx-6以白酒丟糟為碳源，發酵生產酒精。IOOOmL三角瓶中裝入溼白酒丟糟500g,水50mL, 121°C高溫蒸煮20min。冷卻後接入xqx_6種子液20mL，安琪酵母種子液20mL，於28°C下直徑培養20d。其酒精產率為3%。
實施例4 :利用實施例2中篩選的菌株xqx-6以爆破白酒丟糟為碳源，發酵生產酒精。250mL三角瓶中裝入爆破的白酒丟糟50g (爆破條件添加I倍幹秸杆量的O. IM 丁酮溶劑，於溫度175°C，壓力3. IMPa,維壓時間7min後爆破，物料於溫度75°C乾燥8h脫毒)，水400mL，121 °C高溫蒸煮20min。冷卻後接入xqx-6種子液10mL，安琪酵母種子液10mL，於37°C下靜止培養10d。其酒精產率為7%。注安琪牌釀酒酒精酵母由湖北安琪酵母公司提供。通過本發明提供一種高產纖維素酶活力的菌株及其篩選方法和使用方法，能夠達到如下的有益效果1.本發明提供一種高產纖維素酶活力的菌株及其篩選方法、使用方法，該菌株在篩選時經過無機鹽培養基培育、接種、羧甲基纖維素培養基平板劃線、將劃線得到的純菌株再進行無機鹽培養基培養並纖維素分解，將分解能力強的接種於滅菌的固態發酵培養基中培養，水浴法提取得到纖維素酶粗酶液；將此纖維素酶菌株同釀酒酵母、白酒丟糟、麩皮一起進行發酵，得到酒精。篩選到的纖維素酶菌株分解纖維素能力強、篩選條件簡單、易操作，在發酵酒精中不需要添加多餘的纖維素降解酶，利用篩選的菌株直接降解白酒丟糟中的纖維質成分產生可發酵糖類，進而發酵產生乙醇，達到高效分解白酒丟糟的效果。2.本發明中沒有將固態發酵產生的酶液提取出來製成纖維素酶，而是利用丟糟為發酵基質，在菌體發酵培養中產生的纖維素酶直接用於降解含大量纖維素的丟糟，即邊利用丟糟培養菌株產酶，邊利用產生的酶降解丟糟產生還原糖，不僅解決了纖維素酶固態發酵生產的後期萃取問題，還為利用白酒丟糟生產酒精提供了一條廉價、無汙染的有效途徑。3.本發明的篩選方法和使用方法均操作簡單，方法容易掌握，且原料來源廣泛，價格低廉,生產成本低。本發明提供的各種實施例可根據需要以任意方式相互組合，通過這種組合得到的技術方案，也在本發明的範圍內。顯然，本領域技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和範圍。這樣，倘若對本發明的這些修改和變型屬於本發明權利要求及其等同技術的範圍之內，則本發明也包含這些改動和變型在內。
權利要求
1.一種高產纖維素酶活力的菌株，其特徵在於，xqx-6,煙麴黴Aspergillusfumigatus，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC NO. M 2012231。
2.—種權利要求I所述的高產纖維素酶活力的菌株的篩選方法，其特徵在於，包括如下步驟 A.通過纖維素無機鹽液體培養基富集培育菌； B.將步驟A富集培育的菌在浸有無機鹽培養基的濾紙上進行一次或多次接種； C.獲取所述濾紙斷裂處的培養物並將其在羧甲基纖維素培養基平板上進行一次或多次劃線分離，得到純菌株； D.將步驟C得到的所述純菌株在無機鹽培養基中進行培養並進行纖維素分解； E.將步驟D中纖維素分解能力強的所述純菌株接種於滅菌的固態發酵培養基中進行培養； F.通過水浴法提取粗酶液並進行酶活力測定得到所述纖維素酶菌株。
3.如權利要求2所述的高產纖維素酶活力的菌株的篩選方法，其特徵在於， 所述步驟A、所述步驟B、所述步驟D中的所述無機鹽培養基包括以重量份數計，NH4NO3I 份，K2HPO4O. 5 份，KH2PO4O. 5 份，MgSO4O. 5 份，NaClI. O 份，CaCl2O. I 份，FeCl3O. 02 份，酵母膏O. 05份，水1000份；和/或，所述步驟A、所述步驟B、所述步驟D中的所述無機鹽培養基的pH值為7. O 7. 2。
4.如權利要求2所述的高產纖維素酶活力的菌株的篩選方法，其特徵在於， 所述固體發酵培養基包括以重量份數計，白酒酒糟8份、麩皮4份、Mandels營養液10^50份；所述Mandels營養液包括按重量份數計，KH2P042000份、硫酸(NH4)2SO4HOO份、MgSO4. 7H20 3000份、CaCl2 300份、FeSO4. 7H20 5份、MnSO4L 6份、氯化ZnCl2L 7份、CoC122. O份、溶於1000份蒸餾水；和/或,所述固體發酵培養基的pH值為5. O。
5.如權利要求2-4任一項所述的高產纖維素酶活力的菌株的篩選方法,其特徵在於， 在所述步驟A之前，所述篩選方法進一步包括通過無菌水進行溶解；步驟A包括取所述溶解後的懸液加入到含有纖維素無機鹽液體培養基的三角瓶中，靜置培養； 和/或， 所述步驟AjP /或所述步驟E中的培育溫度為28 32°C，培養時間為5 7天； 和/或， 所述步驟B的接種量為10% ； 和/或， 所述步驟D的培養時間為7 28天。
6.如權利要求2-4任一項所述的高產纖維素酶活力的菌株的篩選方法，其特徵在於， 所述步驟E包括 將步驟D得到的分解纖維素能力強的菌株培養成熟，刮下成熟的孢子，製成孢子菌懸液，取:T5mL的孢子菌懸液接種於滅菌的固態發酵培養基中，28 32°C下培養5、天。
7.如權利要求6所述的高產纖維素酶活力的菌株的篩選方法，其特徵在於，所述步驟F包括 在步驟E的固態發酵培養基中加入80 100毫升蒸餾水，在40 50°C的水浴提取I 2小時；用四層紗布過濾；離心分離得上清液；離心速率優選為3500轉/分鐘； 對上清液進行纖維素酶酶活測定確定為高產纖維素酶活力的菌株。
8.一種利用權利要求2-7任一種所述的篩選方法篩選的權利要求I所述的高產纖維素酶活力的菌株的使用方法，其特徵在於，包括 利用權利要求2-7任一種所述的篩選方法篩選的權利要求I所述的高產纖維素酶活力的菌株； 所述菌株與釀酒酵母復配使用，以白酒丟糟、麩皮為主要原料進行發酵。
9.如權利要求8所述的高產纖維素酶活力的菌株的使用方法，其特徵在於， 所述白酒丟糟為溼白酒丟糟。
全文摘要
本發明涉及釀酒領域，具體涉及一種高產纖維素酶活力的菌株及其篩選方法和使用方法。本高產纖維素酶活力的菌株為麴黴菌，該篩選包括A.通過無機鹽培養基富集培育菌；B.將A富集培育的菌在浸有無機鹽培養基的濾紙上進行一次或多次接種；C.獲取濾紙斷裂處的培養物並將其在羧甲基纖維素培養基平板上進行一次或多次劃線分離，得到純菌株；D.將C得到的純菌株在無機鹽培養基中進行培養並進行纖維素分解；E.將D中纖維素分解能力強的純菌株接種於滅菌的固態發酵培養基中進行培養；F.通過水浴法提取粗酶液並進行酶活力測試得到高產纖維素酶菌株。該菌株與釀酒酵母復配使用，以白酒丟糟、麩皮為主要原料進行發酵。本發明能夠提高白酒丟糟的發酵率。
文檔編號C12R1/865GK102876589SQ20121039503
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月17日 優先權日2012年10月17日
發明者鍾方達, 胡峰, 唐雲容, 李波, 楊開梅, 張文學, 趙盈盈, 吳正雲, 鍾霞 申請人:貴州茅臺酒廠(集團)習酒有限責任公司