一種蛋白質烷基化修飾劑peg修飾能力的檢測方法及其應用的製作方法

2023-08-02 11:54:46 1

一種蛋白質烷基化修飾劑peg修飾能力的檢測方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種蛋白質烷基化修飾劑PEG修飾能力的檢測方法及其應用。本發明方法設置GSH經修飾劑修飾與GSH不經修飾兩組，分別用5,5－二硫代對二硝基苯甲酸（DTNB）為顯色劑，利用分光光度計測定在波長412nm下兩組反應體系的吸光值，根據兩組吸光值的差異來檢測蛋白質氨基PEG化修飾劑的修飾能力。本發明進行修飾劑修飾能力的檢測，既能實現定性檢測又能實現定量檢測，整個測定過程在60min內可完成，具有快速、簡便、可靠的有益效果。
【專利說明】ー種蛋白質烷基化修飾劑PEG修飾能力的檢測方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，更具體地，涉及ー種蛋白質烷基化PEG修飾劑修飾能力的檢測方法和應用。
【背景技術】 [0002]20世紀50年代末期，用化學修飾的方法研究蛋白質分子的結構與功能的關係成為生物化學和分子生物學領域的熱點。蛋白質化學修飾的目的是用於生物醫學和生物技術方面。在生物醫學方面，化學修飾可以降低免疫原性的免疫反應性、抑制免疫球蛋白E的產生等；在生物【技術領域】，酶經過化學修飾後能夠在有機溶劑中高效地發揮催化作用，並表現出新穎的催化性能。
[0003]蛋白質修飾劑與蛋白質發生反應的性質，主要可以分為四種類型:(I)醯化及其相關反應，這類修飾劑可以與蛋白質的側鏈基團發生醯基化反應；(2)烷基化反應，這類修飾劑的特點是帶有活潑的滷素原子，由於滷素原子的電負性，使烷基帶有部分正電荷，很容易導致蛋白質分子的親核基團發生烷基化；(3)氧化和還原反應，這類修飾劑具有氧化性，能將側鏈基團氧化；(4)芳香環取代反應，蛋白質胺基酸殘基的酚羥基在3和5位上很容易發生親電取代的碘化和硝化反應。有代表性的修飾劑有こ醯咪唑、滷代こ酸、N-乙基馬來醯亞胺、碳化二亞胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、N-滷代琥珀醯亞胺、こ二酸/丙二酸的共聚物、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯/順丁烯二醯肼共聚物、多聚唾液酸、聚胺基酸、葡聚糖、環糊精、聚乙二醇(PEG )等。其中，PEG溶解性好，毒性低，無免疫原性，蛋白質經其修飾後不但保持了水溶性而且在有機溶劑中的溶解性也増加了，因此PEG類修飾劑應用最多。
[0004]由於PEG的醇羥基化學性質不活潑，所以必須通過特定的活化劑與其反應使之活化。其中氰尿醯氯法是比較經典的方法。該法具有活化反應操作簡單、所活化的PEG修飾能力強、修飾蛋白質穩定性高等優點，是目前最常用的PEG活化方法之一。經氰尿醯氯活化後的PEG帶上^!素原子，由於滷素原子的電負性，使烷基帶有部分正電荷，很容易導致蛋白質分子的親核基團(例如-SH，-NH2等)發生烷基化反應，且巰基基團是蛋白質分子中最容易反應的側鏈基團。因此活化的PEG修飾劑很容易與蛋白質中的巰基與氨基發生反應。
[0005]但是氰尿醯氯也存在著易水解的問題，水解後的氰尿醯氯即失去活化PEG的能力，此外活化後修飾劑的放置時間對其修飾能力產生很大影響，通常情況下，隨著活化PEG在冰箱中放置時間的延長，其修飾蛋白質的能力會越來越低，並最終失去修飾能力。另外在製備PEG修飾劑的過程中，隨著操作及反應條件的變化，PEG修飾能力也會有較大的差異。所以及時了解和掌握PEG修飾劑修飾蛋白質的能力具有重要的意義。
[0006]目前還沒有理想有效的測定各種活化PEG修飾蛋白質的能力的方法的相關報導。常遠等(1996)以牛血清白蛋白(BSA)為模型蛋白，採用凝膠電泳法來測定各種活化PEG的修飾能力，但該方法操作麻煩、操作時間長、結果不理想，而且不能定量的檢測活化PEG修飾蛋白質的能力。

【發明內容】

[0007]本發明要解決的技術問題是克服現有檢測活化PEG修飾蛋白質的能力的技術不足，提供一種檢測蛋白質烷基化PEG修飾劑修飾能力的方法，該方法既能實現定性檢測又能實現定量檢測，快速、簡便、可靠。
[0008]本發明的另ー目的是提供所述方法的應用。
[0009]本發明的目的通過以下技術方案予以實現:
提供ー種蛋白質烷基化修飾劑修飾能力的檢測方法，包括以下步驟:
51.測定組:按照2:1的摩爾比分別準備修飾劑與穀胱甘肽(GSH)溶液；對照組:穀胱甘肽(GSH)溶液；
52.將SI測定組準備好的修飾劑與穀胱甘肽溶液進行反應，反應體系的pH值為8.0~
10.0、反應溫度為35°C~55°C、反應時間為30~50min ；
53.S2所述反應結束後分別在測定組和對照組加入顯色劑DTNB得混合體系，在波長412nm下於3~6min內分別測定混合體系的吸光值；
54.根據S3測定的測定組和對照組混合體系的吸光值差異計算出修飾劑的修飾能力。
[0010]本發明所述活化的蛋白質烷基化修飾劑優選為活化的聚乙二醇。
[0011]作為優選的修飾劑活化方`法，包括以下步驟:
511.用無水苯重結晶三聚氰氯；優選重結晶2次；所述無水苯經3A分子篩除水；
512.取Sll處理的三聚氰氯溶解於含無水碳酸鈉的無水苯中，加入單甲氧基聚乙二醇mPEG,室溫下攪拌過夜後過濾；
取濾液在攪拌下加入こ醚，得白色沉澱，繼續攪拌後抽濾，所得沉澱用無水苯溶解；上述沉澱、溶解重複操作多次，直到紫外檢測無三聚氰氯的吸收峰為止；
513.將S12處理的PEG真空抽乾後得到白色粉末mPEG(活化的PEG)，密封冷藏保存備用。可以採用真空乾燥器抽乾，抽乾後置於冰箱密封保存備用。
[0012]其中，修飾劑活化反應機理如下:.'I)/11, ；イ....?:.?.へ又' ' ——へ又'
「......................................................V1...............................................................................................................1:......................................................................三5!#1#>mPEG丨I
優選地，SI所述穀胱甘肽溶液的濃度為1.0mmol/Lo
[0013]優選地，S2所述pH值為9.0，所述pH值使用0.lmol/L pH9.0的巴比妥鈉-鹽酸
緩衝溶液調節。
[0014]優選地，S2所述反應時間為40min。
[0015]優選地，S2所述反應溫度為45°C。
[0016]優選地，S3所述顯色劑DTNB濃度為1.0mmoI/L0[0017]本發明所述蛋白質氨基烷基化修飾劑修飾能力的檢測方法可應用於蛋白質氨基烷基化修飾劑質量檢測方面。
[0018]本發明方法應用以下原理:
本發明利用上述氰尿醯氯法活化的蛋白質烷基化修飾劑(例如活化的PEG)帶有活潑的滷素原子，由於滷素原子的電負性，使烷基帶有部分正電荷，很容易導致蛋白質分子的親核基團(例如-NH2, -SH等)發生烷基化反應，因此蛋白質分子的側鏈基團氨基、巰基等在一定的條件下可以與活化的PEG反應，生成PEG-蛋白。以GSH為例，GSH與活化的PEG修飾劑的反應式見圖1。
[0019]蛋白質的巰基可以與5，5 一二硫代對二硝基苯甲酸(DTNB)反應，斷裂DTNB的二硫鍵產生2-硝基-5-硫代苯甲酸(NTB-)，在中性或鹼性pH條件下的水中可以離子化，生成呈現黃色的NTB2- 二價陰離子，可在可見-紫分光光度計上檢測到。以穀胱甘肽GSH為例，GSH與顯色劑DTNB的反應式見圖2。
[0020]當GSH的巰基與修飾劑發生反應後，再加入DTNB溶液，GSH就不再與DTNB發生反應生成淺黃色5-硫代-2-硝基苯甲酸陰離子，因而被修飾後的GSH不顯色，因此根據修飾前後測定的反應體系吸光值的差異，可以檢測修飾劑的修飾能力，即相同質量的修飾劑修飾GSH後，再加入DTNB顯色劑，進行平行對比，生成的黃色越淺，說明修飾劑的修飾能力越強。
[0021]進ー步地，本發明根據修飾前後測定的反應體系吸光值數值可以定量檢測修飾劑的修飾能力。
[0022]修飾能力計算公式為:
【權利要求】
1.ー種蛋白質烷基化修飾劑修飾能力的檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟: 51.測定組:按照2:1的摩爾比分別準備活化的蛋白質烷基化修飾劑與穀胱甘肽溶液；對照組:穀胱甘肽溶液；52.將SI測定組準備好的修飾劑與穀胱甘肽溶液進行反應，反應體系的pH值為8.0?10.0、反應溫度為35°C?55°C、反應時間為30?50min ； 53.S2所述反應結束後分別在測定組和對照組加入顯色劑5，5 一二硫代對ニ硝基苯甲酸得到混合體系，在波長412nm下於3?6min內分別測定混合體系的吸光值；54.根據S3測定的測定組和對照組的吸光值差異判斷和/或計算出修飾劑的修飾能力。
2.根據權利要求1所述的蛋白質烷基化修飾劑修飾能力的檢測方法，其特徵在於，所述活化的蛋白質烷基化修飾劑為活化的聚こニ醇。
3.根據權利要求1或2所述的蛋白質烷基化修飾劑修飾能力的檢測方法，所述修飾劑的活化包括以下步驟: 511.用無水苯重結晶三聚氰氯； 512.取Sll處理的三聚氰氯溶解於含無水碳酸鈉的無水苯中，加入單甲氧基聚こニ醇mPEG,室溫下攪拌過夜後過濾； 取濾液在攪拌下加入こ醚，得白色沉澱，繼續攪拌後抽濾，所得沉澱用無水苯溶解；上述沉澱、溶解重複操作多次，直到紫外檢測無三聚氰氯的吸收峰為止； 513.將S12處理的mPEG真空抽乾後得到白色粉末的活化mPEG，密封冷藏保存備用。
4.根據權利要求1所述的蛋白質烷基化修飾劑修飾能力的檢測方法，所述穀胱甘肽溶液的濃度為1.0mmol/Lo
5.根據權利要求1所述的蛋白質烷基化修飾劑修飾能力的檢測方法，所述顯色劑DTNB濃度為 1.0mmol/Lo
6.根據權利要求1所述的蛋白質烷基化修飾劑修飾能力的檢測方法，S2所述反應體系的PH值為9.0，所述pH值採用0.lmol/L pH9.0的巴比妥鈉-鹽酸緩衝溶液調節。
7.根據權利要求1所述的蛋白質烷基化修飾劑修飾能力的檢測方法，S2所述反應時間為40min。
8.根據權利要求1所述的蛋白質烷基化修飾劑修飾能力的檢測方法，S2所述反應溫度為45で。
9.權利要求1至8任一項所述蛋白質烷基化修飾劑修飾能力的檢測方法在蛋白質烷基化修飾劑質量檢測方面的應用。
【文檔編號】G01N21/78GK103558213SQ201310471944
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月11日 優先權日:2013年10月11日
【發明者】陳芳豔, 馮定遠, 王林川 申請人:華南農業大學