黑色素細胞懸浮液的保存方法

2023-07-30 10:54:16 4

專利名稱：：黑色素細胞懸浮液的保存方法
技術領域：
：本發明關於一種粘附性細胞懸浮液的保存方法，更具體地，關於一種黑色素細胞懸浮液的保存方法。
背景技術：
：白化症(Leukoderma)中的白斑病(Viti1igo)為一種斑狀色素缺失疾病，約發生在1%2%的人口中，其臨床症狀為皮膚或黏膜上出現不規則的白色斑塊，白斑病患部上的黑色素細胞幾乎全數缺失。在白斑病的治療方面，除了利用染劑或化妝品的染色與遮蓋方式夕卜，也可利用局部塗抹類固醇製劑，或植皮的方式治療，然而這些方法除了不適用於大面積之外，也可能會產生皮膚萎縮等副作用。目前治療白斑最常使用的方法為口服或外用的感光劑(如Psoralen)與長波長紫外光(UVA)的合併治療，或是窄頻UVB治療。但這些治療方式療程冗長，一般需要100到250次治療，為時l到2年。此外，經過此冗長的療程後，大約只有50%的病人能得到明顯療效。另一種較新穎的治療方式是藉由黑色素細胞的移植來進行治療，此種黑色素細胞移植治療法與前述口服、照光等相比，僅需數次門診，且幾周之內就可看到色素再現，療效迅速而明顯。由於黑色素細胞為粘附性細胞，故在培養此類型細胞時必須有可粘附的基材與適當的培養基。因此，在臨床上使用培養的黑色素細胞來治療皮膚白化病灶時，須考濾培養基的去除及粘附基材的處理等因素。其中，關於粘附基材的處理方式可以有下列三種方式第一，將細胞與所粘附的基材一同覆蓋到病灶上，然而此方式需要考濾生物兼容性/生物可分解性等因素而開發適合的粘附基材，技術上較複雜困難；第二，將細胞從粘附基材上分離後，與水膠混合再覆蓋到病灶上，此方式成本較昂貴，且多一道處理步驟；第三，將細胞從粘附基材上分離，和生理兼容液體混合(也即製成細胞懸浮液)，再移植到病灶上。此三種方式相較，以第三種方式(製成細胞懸浮液)較易於進行，也較經濟實惠。然而當粘附性細胞(例如黑色素細胞)一旦被製成細胞懸浮液時，由於失去細胞粘附分子的訊號傳遞，往往在短時間內即死亡；此外，該細胞也容易聚集沉降，難以打散，若將此聚集細胞團移植到要治療的無色素病灶上(例如白斑症)，則會因細胞分布不均而形成色素斑點；再者，若要作後續的細胞培養，聚集細胞團不能均勻分布於培養皿，也會妨礙培養效果。因此，如何製備並保存該細胞懸浮液是一個重要課題。傳統上，細胞的保存多以低溫冷凍(例如儲存於液態氮)的方式進行，以達到長期保存的效果。但是對於需立即使用，而不需再經處理的細胞(例如運送到醫院供病人治療用的細胞)，則並不適合以上述的低溫冷凍方式保存。因為冷凍細胞時需加入特殊試劑，例如DMSO來防止冷凍對細胞造成傷害，而這些試劑無法直接用於臨床上。再者，低溫冷凍的細胞運送保存時需用乾冰或液態氮或其它方式來維持低溫狀態，造成運送保存困難。此外，冷凍細胞的使用需一定的解凍程序，故也存在使用便利性的問題。臨床應用的細胞懸浮液，一般是以非冷凍的方式保存於室溫下。科學上一般將室溫視為25°C。然而細胞對溫度非常敏感，不同的環境溫度會對細胞生理有不同的影響，如果要達到好的保存效果，必須找出最適的保存溫度範圍，而室溫未必是最適合的保存溫度。一個非冷凍、且溫度低於最適合細胞生長的環境，或許能降低細胞化學反應及代謝速率，進而延長細胞壽命。但該低溫環境也可能造成細胞內的蛋白質結構改變、細胞生長周期變慢，甚至是使酵素功能喪失等，進而造成細胞的死亡。此外，當細胞回溫使用時，也常會引發不良的熱休克反應(heatshock),造成細胞的再度損傷。因此，尋找合適的低溫環境，使之同時滿足降低代謝速率而延長細胞壽命及最低的細胞傷害是一個重要的課題。然而，目前關於非冷凍保存方式對於細胞影響的了解很有限，其中關於低溫環境對粘附性細胞影響的研究，僅限於粘附於培養皿上的粘附性細胞，並未對製備成懸浮液的粘附性細胞作研究。而且，溫度因子對特定細胞的影響，例如低溫對黑色素細胞的影響，更是付之闕如。綜合上述，當粘附性細胞，尤其是黑色素細胞，被製成細胞懸浮液商品化時，其運送過程及臨床手術前存放的保存條件皆足以影響到該細胞的活性、存活率及細胞在溶液中分布的均勻性。因此，粘附性細胞的細胞懸浮液的最佳化保存條件已經成為研究目標。因此，本發明關於粘附性細胞懸浮液的保存，尤其是黑色素細胞懸浮液的保存，特別是以非冷凍的方式保存黑色素細胞懸浮液，使細胞活性和存活率受到最佳保護，同時避免細胞聚集。
發明內容本發明提供一種黑色素細胞的保存方法，先將黑色素細胞製備成懸浮液，較佳以漢氏培養液(Ham'sNutrientMixtureF-12，Ham'sF12)配製，再分別於約4-22.5°C溫度範圍下，保存該黑色素細胞懸浮液，其中成人黑色素細胞懸浮液較佳的保存溫度範圍約為10-22.5t之間，於此溫度範圍，24小時後成人黑色素細胞仍保有約72。/。以上的活性及存活率，並且細胞無聚集現象。而新生兒黑色素細胞懸浮液較佳的保存溫度範圍約為4-15t之間，於此溫度範圍下，48小時後新生兒黑色素細胞仍保有約71%以上的活性及存活率。依照本發明的一個較佳實施例，黑色素細胞的懸浮液也可由杜貝可最低基本培養液(Dulbecco，sModifiedEaglemedia，DMEM)、最低基本培養液(MinimalEssentialMedium,MEM)、磷酸生理食鹽7jC(phosphatebufferedsaline,PBS)、羅斯威爾帕克糹己念機構1640培養液(RoswellParkMemorialInstitute1640Medium,RPMI1640Medium)、一般生理食鹽水(normalsaline)或其它生理兼容溶液所配製。本發明還提供一種黑色素細胞懸浮液的保存方法，該黑色素細胞懸浮液用於治療缺乏黑色素細胞疾病，該方法包含製備黑色素細胞懸浮液，於約4-22.5'C溫度範圍內保存黑色素細胞懸浮液。與傳統低溫保存方式相比，本發明是利用懸浮液的方式，不需低溫冷凍即可保存黑色素細胞，且本發明的黑色素細胞懸浮液可保存至少24小時，對於遠距離運送而言，24小時的運送時間已相當充裕，無論是否馬上使用或將黑色素細胞懸浮液暫存於前述適合的保存溫度，對於黑色素細胞的活性及存活率的影響差異不大，同時也降低細胞聚集的情形。由於傳統懸浮液的治療方式，被黑色素細胞的保存所局限，因此，本發明在醫療用途上或對於黑色素細胞的商品化具有極為顯著的效益。為讓本發明的上述和其它目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，對附圖的詳細說明如下圖1是依照本發明的一個較佳實施例的黑色素細胞保存條件實驗的概括流程圖；圖2是本發明的一個較佳實施例的黑色素細胞懸浮液的製備流程圖；圖3是本發明的一個較佳實施例的新生兒黑色素細胞保存實驗的流程圖；圖4是本發明的一個較佳實施例的成人黑色素細胞保存實驗的流程圖-,圖5是本發明的一個較佳實施例的新生兒黑色素細胞保存實驗的統計長條圖；圖6是本發明的一個較佳實施例的成人黑色素細胞保存實驗的統計長條圖；圖7A至圖7G顯示本發胞於不同溫度下的聚集情形圖8A至圖8D顯示本發胞保存在DMEM、於不同溫度圖9A至圖9D顯示本發胞保存在MEM、於不同溫度下的聚集情形。圖IOA至圖10D顯示本發明的一個較佳實施例中，成人黑色素細胞保存在PBS、於不同溫度下的聚集情形。明的一個較佳實施例中，成人黑色素細明的一個較佳實施例中，成人黑色素細下的聚集情形。明的一個較佳實施例中，成人黑色素細圖IIA至圖11D顯示本發明的一個較佳實施例中，成人黑色素細胞保存在RPMImedium1640、於不同溫度下的聚集情形。具體實施方式實驗流程圖1是依據本發明較佳實施例的黑色素細胞保存實驗的概括流程。為了測試保存溫度及時間對黑色素細胞活性及存活率的影響，先從新生兒的包皮或是成人表皮組織，取得並培養皮膚黑色素細胞(dermalmelanocyte)後，製備成懸浮液(步驟102)。接著，分別於不同的溫度下保存一段時間後(步驟104)，進行細胞活性及存活率測試(步驟106)，並觀察細胞聚集情形。此實施例中分別使用四氮唑鹽(Thiazolylblue)比色法及細胞計數法進行測試。四氮唑鹽比色法是一種生物學上常用以測定細胞存活率或增殖作用的方法，其主要依賴活細胞內線粒體中的琥珀酸去氫酶的作用，將四氮唑鹽的四唑(tetrazolium)轉為藍色甲瓚(forraazan)產物，並堆積於細胞中。當加入二甲基亞碸(dimethylsulfoxide;DMSO)將其溶解後，則可利用吸光值(opticaldensity;OD)的測定得知細胞的還原能力(甲瓚產量)，此吸光值代表了線粒體的活性，即細胞活性，故四氮唑鹽比色法可用作細胞存活率的指針。而細胞計數則是利用錐蟲藍(TrypanBlue)對細胞進行染色來計數。由於錐蟲藍無法穿透活細胞的細胞膜，但是當細胞受傷或死亡，其細胞膜會破損，則錐蟲藍可以通透細胞膜進入細胞內，使細胞染成藍黑色。利用這一特點，配合血球計數器的使用，則可以在顯微鏡底下，分辨出細胞樣本中的活細胞與死細胞，以方便細胞計數。本發明的詳細實驗流程及其結果詳述如下。(一)製備成人黑色素細胞懸浮液參照圖2，首先，利用水泡吸附法取得成人的表皮組織(步驟201)。在此步驟中，以酒精將皮膚消毒後，將針筒放置於皮膚上，以200-300毫米汞柱的吸力吸附皮膚長達60-120分鐘，使皮膚形成水泡，再將表皮組織剪下，一般而言，表皮組織上含有約86-90%的角質細胞及5-7%的黑色素細胞。接著，將剪下的表皮組織切碎後(步驟202)，先以胰蛋白溶液浸泡(步驟203)，再移入胰蛋白-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA)溶液中(步驟204)，使黑色素細胞從表皮組織分離，最後以離心的方式收集表皮細胞(g卩，角質細胞和黑色素細胞)(步驟205)，並於細胞培養皿中培養(步驟206)。其中角質細胞因無法生長而迅速減少，黑色素細胞則持續增生，而得到接近純黑色素細胞的細胞族群。由於黑色素細胞屬於粘附型細胞(adherentcell)，因此需利用胰蛋白酶(Trypsin)分解細胞與培養皿間的附著蛋白(步驟207)，讓黑色素細胞脫落下來，這是收集粘附型細胞常用的方法。接著，洗滌取得的黑色素細胞(步驟208)。之後，以約1.2-1.5X107ml的密度，將黑色素細胞重新懸浮於漢氏培養液(Ham'sF12)中(步驟209)。漢氏培養液(Ham，sFl2)為常見的市售培養液，內含胺基酸、糖類、脂肪酸、鹽類等基本細胞生長必須物質。除了漢氏培養液(Hara'sF12)外，也可採用杜貝可最低基本培養液(DMEM)、最低基本培養液(MEM)、磷酸生理食鹽水(PBS)、羅斯威爾帕克紀念機構1640培養液(RoswellParkMemorialInstitute1640Medium,RPMI1640Medium)、一般生理食鹽水(normalsaline)或其它生理兼容溶液來配製。最後，將黑色素細胞懸浮液分裝入試管中(步驟210),以進行下述的實驗。(二)新生兒黑色素細胞保存實驗首先，為了模擬在運送過程中，時間及溫度對黑色素細胞活性及存活率的影響，因此，將取得的新生兒黑色素細胞分兩階段儲存。如圖3所示，先將存有新生兒黑色素細胞的試管分別保存於保冷箱中，時間由0小時至24小時不等(步驟301)，此階段保冷箱的溫度仿照運送過程中的溫度，其約為1-15T:之間。接著，於第二階段中，再將存於保冷箱的試管置入4'C冰箱內(步驟302)，此過程模擬黑色素細胞運抵治療機構後，存放於4'C冰箱內的狀況，同樣地，時間也由0小時至48小時不等。最後，將新生兒黑色素細胞轉移至培養皿中於37。C下恢復5天後(步驟303)，以四氮唑鹽比色法(步驟304)及細胞計數(步驟305)的方式測試細胞活性及存活率。表一顯示此實施例中，新生兒黑色素細胞的兩階段保存條件200610121539.8說明書第7/12頁(a)未經保存階段，即直接分析；(b)4'C保存4小時；(c)^C保存24小時；(d)4。C保存48小時；(e)保冷箱保存8小時、4'C保存16小時，低溫保存共24小時；(f)保冷箱保存24小時；(g)保冷箱保存24小時、4°C保存24小時，低溫保存共48小時。表一新生兒黑色素細胞兩階段保存條件標示保冷箱(1-15'C)的保存時數(小時)4t;冰箱的保存時數(小時)保存總時數(小時)000b044c02424d0484881624f24024g242448(三)成人黑色素細胞保存實驗由於已於上述實驗(二)新生兒黑色素細胞保存實驗中，模擬運送過程溫度及時間對黑色素細胞的影響。因此，於此實驗中，僅就成人黑色素細胞的最佳保存溫度及時間作測試，而不分兩階段儲存。參照圖4，取得成人黑色素細胞後，分別於0°C、4°C、l(TC、15°C、22.5°C、32.5°C、37°C下，保存24小時或48小時(步驟401)。接著，將成人黑色素細胞轉移至培養皿中於37'C下恢復5天(步驟402)，以四氮唑鹽比色法(步驟403)及細胞計數(步驟404)的方式測試細胞活性及存活率。並觀察不同溫度下細胞聚集的情形(步驟405)。表二則顯示實施例中，成人黑色素細胞的保存溫度及時間(h)未經保存階段，直接分析；(i)4。C保存24小時；(j)10。C保存24小時；(k)15。C保存24小時；(1)22.5"保存24小時；(m)32.5。C保存24小時；(n)37。C保存24小時；(0)4。C保存48小時；(p)l(TC保存48小時；(q)15。C保存48小時；(r)22.5°C保存48小時；(s)32.5°C保存48小時；(t)37t:保存48小時。表二成人黑色素細胞保存條件tableseeoriginaldocumentpage11結果與討論(A)新生兒黑色素細胞的保存條件表三顯示了新生兒黑色素細胞於不同溫度及時間下，活性及存活率測試結果。表三新生兒黑色素細胞實驗結果新生兒黑色素細胞實驗四氮唑鹽比色法細胞數保冷箱/4i:冰箱保存時數(小時)百分比(%)標準差百分比(%)標準差tableseeoriginaldocumentpage12圖5為表三的統計長條圖。白色部份代表四氮唑鹽比色法所測試出的保存後細胞存活率，而斜線部份則為所計算出的保存後細胞個數，上述兩者的計算基準為(a)未經保存階段的新生兒黑色素細胞。參見圖5，a至d代表將新生兒黑色素細胞分別保存於4'C冰箱中，0小時至48小時後，讓細胞在37°C中恢復5天，所測試到的細胞活性與存活率。其結果與未經保存階段的細胞相比，差異不大，仍保有82%以上的細胞活性和存活率。由此可知，將新生兒黑色素細胞製成懸浮液後可保存於4"的冰箱中近48小時，直至需使用為止。依據圖5中的e至g，說明新生兒黑色素細胞在保冷箱保存數小時後，再移入4'C冰箱儲存一段時間，於37r下恢復5天的測試結果。其顯示儘管將新生兒黑色素細胞儲存於保冷箱長達8小時(e)或24小時(f、g)，無論是否轉移至4'C冰箱，仍然保有良好的活性與存活率，與未經低溫保存的新生兒細胞相較，也保有71%以上的存活率。由此可知，若為遠距離的運送，24小時的運送時間已相當充裕，無論是否馬上使用或將黑色素細胞懸浮液暫存於4t:冰箱，對於黑色素細胞的活性及存活率的影響差異不大。依據上述可知，新生兒黑色素細胞較佳的保存溫度範圍為4-15"，以此溫度保存48小時後，仍可保有至少71%以上的細胞存活率及活性。而此415°C的溫度範圍，遠低於公知常用的室溫範圍。(三)成人黑色素細胞的保存條件經由上述實驗(二)的結果可知，新生兒黑色素細胞於4-15°C下，保存48小時，仍保有71%以上的細胞存活率及活性。實驗(三)則擴大此溫度範圍，測試成人黑色素細胞的最佳保存溫度及時間。表四為成人黑色素細胞的活性及存活率測試結果。表四成人黑色素細胞實驗結果tableseeoriginaldocumentpage13圖6為表四的統計長條圖，其顯示於0-37'C之間，保存24小時或48小時後，成人黑色素細胞活性及存活率，h至n分別代表於0°C、4°C、10°C、15°C、22.5°C、32.5°C及37°C下，保存24小時後的測試結果，而o至t則為分別4°C、10°C、15°C、22.5°C、32.5°C及37t:下，保存48小時後的測試結果。同樣地，上述兩者的計算基準為(h)未經保存階段，即直接分析的成人黑色素細胞。顯然地，無論是24小時或48小時，保存在10-22.5。C之間的成人黑色素細胞，皆有較高的細胞活性及存活率，若以4'C以下或22.5°C以上的溫度保存，則明顯傷害細胞的活性及存活率。此外，以10-22.5'C保存24小時的成人黑色素細胞(圖6j、k、1)，甚至仍保有72%以上的細胞活性及存活率。然而，隨著時間的增加，48小時後(圖6o至t)，細胞活性及存活率比未經低溫保存的細胞降低許多。圖7A至圖7G分別顯示成人黑色素細胞於4°C、l(TC、15°C、22.5°C、25°C、32.5°C及37°C下，以Ham，sF12培養液保存24小時後，所觀測到的細胞聚集情形。由圖7A至圖7C可知，保存在15°C或更低溫度下的黑色素細胞無明顯聚集，以22.5t;保存的細胞則輕微聚集，隨著溫度上升，細胞聚集的情形則更為嚴重。此外，為了探討當黑色素細胞以其它生理兼容溶液保存時，此最佳保存溫度範圍是否仍具優越性，故先將黑色素細胞保存於4種不同的生理兼容溶液中，再分別置於15°C、22.5°C、25'C及37'C下24小時後，恢復5天後，最後觀察細胞聚集情形。此4種溶液為DMEM、MEM、PBS以及RPMImedium1640，實驗結果貝lj依序顯示於圖8A-8D、圖9A—9D、圖10A-10D以及圖11A-11D中，由15°C、22.5°C、25°C至37'C排列。如圖所示，於15度下，細胞均無聚集現象。保存於22.5度時，細胞略有聚集現象。然而，隨著溫度的上升，於25度和37度下的細胞則有嚴重的聚集現象。綜合細胞活性、存活率和聚集結果判斷，成人黑色素細胞的較佳保存溫度為10-22.5°C，以此溫度範圍保存24小時後，依然具有72%以上的存活率與活性。此外，上述的黑色素細胞懸浮液可用以治療缺乏黑色素細胞疾病，例如白斑症(Vitiligo)或白化症(Leukoderma)。由於此類型病症是因患部黑色素細胞缺乏所致，因而呈現白色，利用塗抹懸浮液的方式將黑色素細胞移植於患部上，可改善病徵。此外，本發明也可應用於任何缺乏黑色素細胞的情形，例如白髮現象，可利用此黑色素細胞懸浮液加以治療。由於人體的發色亦是由皮膚上的黑色素細胞所提供，可知白髮的產生原因之一可為黑色素細胞供給的短缺所致。因此可將本發明的黑色素細胞懸浮液注射於頭皮中，進而將黑色素細胞植入皮膚裡，改善黑色素細胞的缺乏情形，使黑色素細胞對毛髮提供色素，達到治療的效果。黑色素細胞在治療上的應用會為其保存條件所局限，然而，本發明的黑色素細胞懸浮液的保存條件，可使細胞在至少24小時以內，還保持良好的活性與存活率，也無嚴重細胞聚集現象，應用於臨床治療時，細胞可發揮功能，也不會有因為細胞聚集而產生的皮膚呈色不均勻的重大缺點。對於遠距離運送而言，24小時的運送時間己相當充裕，無論是否馬上使用或將黑色素細胞懸浮液暫存於適當溫度的冰箱，都可有良好使用效果。在醫療用途上或對於黑色素細胞商品化具有極為顯著的效益。雖然本發明已經以較佳實施例揭示如上，但是其並非用以限定本發明，任何本領域技術人員，在不脫離本發明的精神和範圍內，可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍應當視所附的權利要求所界定的為準。權利要求1.一種黑色素細胞懸浮液的保存方法，其特徵在於，以非室溫(25℃)條件進行保存處理，包含製備黑色素細胞懸浮液；於約4-22.5℃溫度範圍內，保存該黑色素細胞懸浮液。2.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，該黑色素細胞懸浮液以漢氏培養液、杜貝可最低基本培養液、最低基本培養液、磷酸生理食鹽水、羅斯威爾帕克紀念機構1640培養液、一般生理食鹽水或其它生理兼容溶液所配製。3.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，該黑色素細胞為成人黑色素細胞。4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，該溫度範圍約為10-22.5""C之間。5.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，該黑色素細胞為新生兒黑色素細胞。6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，該溫度範圍約為4-15。C之間。7.—種成人黑色素細胞懸浮液的保存方法，其特徵在於，以非室溫(25。C)條件進行保存，其包含製備一成人黑色素細胞懸浮液，其中該成人黑色素細胞懸浮液是以選自於由漢氏培養液、杜貝可最低基本培養液、最低基本培養液、磷酸生理食鹽水、羅斯威爾帕克紀念機構1640培養液、一般生理食鹽水或其它生理兼容溶液所組成的一族群配製而得；於約10-22.5'C溫度範圍，保存該懸浮液。8.—種新生兒黑色素細胞懸浮液的保存方法，其特徵在於，以非室溫(25°C)條件進行保存，其包含製備一新生兒黑色素細胞懸浮液，其中該新生兒黑色素細胞懸浮液是以選自於由漢氏培養液、杜貝可最低基本培養液、最低基本培養液、磷酸生理食鹽水、羅斯威爾帕克紀念機構1640培養液、一般生理食鹽水或其它生理兼容溶液所組成的一族群配製而得；於約4-15"C溫度範圍，保存該懸浮液。全文摘要本發明關於一種黑色素細胞的保存方法。將黑色素細胞製成懸浮液後可保存於4-22.5℃的溫度範圍內，其中新生兒黑色素細胞懸浮液的保存溫度較佳為4-15℃間，保存48小時後仍然保持71％以上的細胞存活率和活性。成人黑色素細胞的保存溫度較佳約為10-22.5℃間，保存24小時後亦保有72％以上的細胞存活率和活性。同時，於此溫度範圍下，可避免黑色素細胞聚集(aggregate)的情形產生。該黑色素細胞懸浮液可用以治療皮膚白化症(leukoderma)，及其它黑色素細胞缺乏的症狀。文檔編號A01N1/02GK101126079SQ200610121539公開日2008年2月20日申請日期2006年8月18日優先權日2006年8月18日發明者吳怡萍,廖智菁,施冰如,楊瑩蓉,申屠子萍申請人:財團法人工業技術研究院