蘋果MdMYB1基因中與著色相關的兩處突變及其檢測方法
2023-07-30 16:08:26
專利名稱：蘋果MdMYB1基因中與著色相關的兩處突變及其檢測方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及蘋果MdMYBl基因中的兩處突變與蘋果果實著色性狀的關係及突變檢測方法。
背景技術：
蘋果(Malus domestica Borkh.)是我國果樹產業中重要的大宗水果，其著色問題是影響我國許多產區蘋果質量的一個重要因素，培育著色好的品種是生產中急需的。通過研究利用蘋果著色相關基因的序列變異，開發果實著色性狀的分子標記，提早鑑定雜交後代植株果實著色性狀，對雜交後代植株提早進行篩選，將有助於降低早期試驗費用和工作量，以低成本儘快培育出著色好的蘋果新品種，增強我國蘋果的質量和市場競爭力。蘋果的著色與果皮中的花色苷有關，花色苷的合成涉及查爾酮合成酶(OB)、類黃酮3-羥基化酶(F3H)、二氫黃酮醇還原酶(DFR)、UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡萄糖轉移酶 (UFGT)等酶的基因。研究表明，花色苷的積累與這些基因、特別是UFGT基因的表達水平有關，這些基因的表達受到MYB家族轉錄因子的調控，MdMYBl基因是一個與果實著色有關的功能基因(Takos 等，2006)。Takos 等 Q006)通過分析MdMYBl-I (GenBank登錄號 DQ886414) 等基因序列，找到了一個與果實著色性狀有關的鹼基突變位點，開發出一個dCAPS標記。 dCAPS標記是一種改進的CAPS標記(derived CAPS)，而CAPS標記是指切割擴增的多態性序列標記(Cleaved amplified polymorphic sequence)。Takos 等(2006)開發的 dCAPS 標記雖然不能將澳洲青蘋等品種與一些著色品種區分開，但可以區分其它一些著色與非著色品種，可以完全區分雜交親本植株(粉紅女士姊妹株、金帥)及其後代植株，在雜交後代植株的早期選擇中利用價值高。該dCAPS標記的缺點是酶切後的片段長度僅有^bp的差異， 利用普通的瓊脂糖電泳無法檢測，需要用價格約為7000元/125g的昂貴NuSieve GTG瓊脂糖進行電泳檢測。本發明的目的是通過進一步分析MdMYBl基因序列，尋找其它與蘋果果實著色性狀相關的突變位點，開發可用普通瓊脂糖電泳檢測的分子標記(例如CAPS標記) 用來鑑定蘋果植株果實著色性狀。參考文獻[1]苑克俊，張毅，孫瑞紅，張振成.蘋果、葡萄花色苷生物合成研究進展.山東農業科學，1998,6 :46-49.[2]張學英，張上隆，駱軍，葉正文，李世誠.果實花色素苷合成研究進展.果樹學報，2004，21 (5) :456-460.[3] Takos, Α. M.，Jaffe, F. W.，Jacob, S. R.，Bogs, J.，Robinson, S. P.，Walker, A. R. Light-Induced Expression of a MYB Gene Regulates Anthocyanin Biosynthesis inRed Apples. Plant Physiology,2006,142(3) :1216-1232.[4] Ban, Y. , Honda, C. , Hatsuyama, Y. , Igarashi, Μ. , Bessho, H. and Moriguchi, T.Isolation and functional analysis of a MYB transcription factor gene that isa key regulator for the development of red coloration in apple skin. PlantCellPhysiology,2007,48(7) :958-970
發明內容
本發明找出蘋果MdMYBl基因中兩處突變與蘋果果實著色性狀相關，提供檢測這些突變、進而鑑定蘋果果實著色性狀的分子標記方法和測序方法。本發明解決問題所採用的技術方案是根據蘋果MdMYBl基因(GenBank登錄號 DQ886414)序列設計引物，利用設計的引物對8個不同蘋果品種的基因組DNA進行PCR擴增，通過對這些蘋果品種的PCR擴增產物測序與序列比對尋找突變，然後分析這些蘋果品種的基因突變與果實著色性狀的關係，找出與蘋果果實著色性狀相關的兩處突變，開發用普通瓊脂糖電泳檢測突變的分子標記方法(例如CAPS標記方法)用來鑑定蘋果果實著色性狀，也可通過測序方法獲得突變位點鹼基信息鑑定蘋果果實著色性狀。本發明的有益效果是(1)本發明通過實驗新找出蘋果MdMYBl基因中兩處突變與蘋果果實著色性狀相關，可用來開發新的方法鑑定蘋果果實著色性狀。(2)與現有的利用另外一處突變鑑定蘋果果實著色性狀的dCAPS標記相比，本發明新開發的CAPS標記鑑定方法簡單實用。現有dCAPS標記的PCR擴增產物酶切後，片段長度僅有^bp的差異，利用普通的瓊脂糖電泳無法檢測；本發明CAPS標記PCR擴增產物的酶切產物，通過設計引物可將酶切產物的片段長度差異控制在70 200bp，可利用普通的瓊脂糖電泳檢測，而且由於片段差異大，電泳時間可縮短。( 與現有技術相比，本發明CAPS標記方法節省實驗成本效果突出。現有dCAPS標記實驗在3%的NuSieve GTG瓊脂糖上進行電泳檢測，NuSieve GTG瓊脂糖價格昂貴為6900元/125g ；本發明CAPS標記實驗在1. 2%的普通瓊脂糖上電泳檢測，價格僅220元/100g。一次實驗按IOOml凝膠溶液計算，則現有dCAPS標記實驗瓊脂糖費用 165. 6元，本發明CAPS標記實驗瓊脂糖費用僅2. 64元，實驗成本顯著降低。(4)利用本發明可鑑定蘋果品種和雜交後代植株果實著色性狀後，進而對蘋果雜交後代植株進行早期選擇，捨棄一部分植株，節省雜交後代植株的管理與篩選成本。總之，本發明為蘋果的果實著色性狀改良提供了一種簡單易用的低成本分子標記育種手段。這裡需要說明的是本發明所用8個蘋果品種富士、國光、嘎拉、紅星、紅玉、印度、 金帥、青香蕉全部為生產上栽培的品種，公眾能得到；本發明涉及基因序列為已知MdMYBl 基因序列，不涉及核苷酸或胺基酸序列表；本發明設計人曾在2009年11月21-22日於廣州召開的「慶祝中國園藝學會創立80周年暨第十一次會員代表大會」發表「蘋果著色相關基因的分子標記及其利用研究」論文摘要，但該論文是研究另一突變，本發明權利要求中與蘋果果實著色性狀有關的兩處MdMYBl基因突變及其檢測方法未發表。為慎重起見，我們還是填寫了發明專利請求書(19)不喪失新穎性寬限聲明。
圖1是8個蘋果品種PCR擴增產物的電泳圖。圖中M. DNA分子量標記，數字和bp
為標記大小與單位，1.富士，2.國光，3.嘎拉，4.紅星，5.紅玉，6.印度，7.金帥，8.青香 >、、、 圖2是已知位點227的鹼基信息、本發明新找出的206與280兩處突變位點的鹼基信息與果實著色性狀；
圖3是本發明第一個實施例8個蘋果品種PCR擴增產物酶切後的電泳圖，圖中 M. DNA分子量標記，數字和bp為標記大小與單位，1.富士，2.國光，3.嘎拉，4.紅星，5.紅玉，6.印度，7.金帥，8.青香蕉；
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。本發明測序方法檢測突變實施步驟步驟1，試材富士和嘎拉蘋果及其雜交後代植株的葉或花，以及金帥、國光、紅星、紅玉、印度、青香蕉六個蘋果品種的葉或花。步驟2，基因組DNA提取試材研磨後立即加入預熱至65°C的0.6mL 2% CTAB提取緩衝液[2 % CTAB，100mmol/L Tris-HCl (pH8. 0), 20mmol/L EDTA, 1. 4mol/L NaCl,2 % PVP-40,2% β -巰基乙醇]，在65°C水浴中提取30min，這期間輕輕倒置樣品試管3次。取出加入0. 6mL氯仿異戊醇04 1)，輕輕翻轉，充分混勻，12000rpm離心lOmin。將上清液轉入另一個新試管，加入等體積經-20°C預冷的異丙醇，輕輕搖勻，在12000rpm離心IOmin 後將上清液移去。試管中的DNA球用500 μ L冷的70%乙醇(_20°C )漂洗2次，將試管置於室溫下晾乾，加入30 50 μ L滅菌無離子水或0. 2Χ的ΤΕ，再加入1 μ LRNase A (2. 5mg/ ml)處理除去RNA，在4°C冰箱中保存備用，暫時不用的DNA則冷凍保存。步驟3，PCR擴增利用MdMYBl基因序列在突變兩側設計正向引物Mb2f (序列為 TTGGGTGTTTGCTGTTGC)和反向引物 Mb2R(序列為 TTCCCTTATTTGTTCCGTTG)，也可設計其它正向和反向引物。PCR反應液(20 μ L)含有0. 5yU25ng)基因組DNA和19. 5 μ L反應混合物，一份混合物由0. 4 μ L dNTPs (10mmol/L)、2 μ L IOx Taq緩衝液、0. 5 μ L正向引物 (10ymol/L)、0.5yL 反向引物(10 μ mol/L)、0· 25 μ L(5U)的 Taq DNA 聚合酶禾口 15. 85 μ L 水組成。PCR反應35個循環，每一循環包括94°C變性30s、56°C退火Imin和72°C引物延伸 2min。步驟4，電泳檢查將3 μ L PCR產物、6 μ L /K和1 μ L上樣染料混合，溴化乙錠染色，在120V電壓、1. 2%瓊脂糖膠上進行電泳檢查PCR產物，結果如圖1所示。步驟5，PCR產物測序由專門的生物技術公司進行。測序後通過對獲得的各蘋果品種序列進行比對分析找出突變位點，然後分析這些突變位點與前人開發的dCAPS標記突變位點的關係，結果如圖2所示，新找出位點206和位點280兩個突變位點(也就是 MdMYBl-I基因轉錄起始點上遊-16Mbp處和-1550bp處)，能提供與前人蘋果著色性狀 dCAPS分子標記突變位點227相同的信息(即在每一突變位點前6個蘋果品種都含有一個相同的鹼基，後6個蘋果品種都含有一個相同的鹼基)，表明PCR產物測序新獲得的突變位點鹼基信息可直接用來鑑定蘋果果實著色性狀，也可用來開發可鑑定蘋果果實著色性狀的分子標記。本發明CAPS標記方法檢測突變實施步驟步驟1，試材同上述測序方法。步驟2，基因組DNA提取同上述測序方法。步驟3，PCR擴增同上述測序方法。步驟4，電泳檢查PCR產物同上述測序方法。
5
步驟5，酶切實驗取5μ LPCR產物加入試管中，再加入2μ L反應緩衝液(IOx)、 1 μ L(IOU)限制性內切酶Riil I和12 μ L水，在37°C水浴2 3h進行酶切。步驟6，電泳檢查酶切產物20 μ L酶切產物加5 μ L上樣染料混合，溴化乙錠染色， 在120V電壓、1.2%瓊脂糖膠上進行電泳檢查酶切產物，結果如圖3所示。有2個蘋果品種PCR擴增產物酶切後僅出現一條與蘋果果實著色性狀有關的495bp帶，有2個蘋果品種 PCR擴增產物酶切後僅出現一條與蘋果果實非紅色性狀有關的698bp帶，有4個蘋果品種 PCR擴增產物酶切後出現一條與蘋果果實著色性狀有關的495bp帶和一條與蘋果果實非紅色性狀有關的698bp帶。^MM 1 :CAPSt示iPi去撒_突奪、鑑定蘋果品種棺株著盧,t牛狀步驟1，試材富士、嘎拉、金帥、國光、紅星、紅玉、印度、青香蕉8個常見蘋果品種的葉或花。步驟2，基因組DNA提取同前述測序方法。步驟3，PCR擴增同前述測序方法。步驟4，酶切實驗取5μ LPCR產物加入試管中，再加入2μ L反應緩衝液(IOx)、 1 μ L(IOU)限制性內切酶Riil I和12 μ L水，在37°C水浴2 3h進行酶切。20 μ L酶切產物加5 μ L上樣染料混合，溴化乙錠染色，在120V電壓、1. 2%瓊脂糖膠上進行電泳檢查酶切產物，結果如圖3所示。步驟5，蘋果品種植株著色性狀分析鑑於新找出的兩個突變位點能提供與前人蘋果著色性狀dCAPS分子標記突變位點相同的信息，表明利用新獲得的突變位點鹼基信息開發的蘋果果實著色性狀分子標記，同前人的蘋果著色性狀dCAPS分子標記一樣可鑑定蘋果雜交後代植株果實著色性狀。根據前人的dCAPS分子標記分析蘋果著色性狀結果，8個蘋果品種中，國光和紅玉2個蘋果品種PCR擴增產物酶切後僅出現一條495bp帶，蘋果果實著色性狀為紅色；金帥和青香蕉2個蘋果品種PCR擴增產物酶切後僅出現一條698bp帶，蘋果果實著色性狀為非紅色性狀；富士、嘎拉、紅星和印度4個蘋果品種PCR擴增產物酶切後出現一條698bp帶和一條495bp帶，蘋果果實著色性狀可能為紅色(包括桔紅色，如富士、嘎拉和紅星)，也可能為非紅色(如印度)。實施例2 :CAPS標記法檢測突變、鑑定蘋果雜交後代植株著餼性狀步驟1，試材利用富士和嘎拉蘋果作為親本進行雜交獲得種子，種子播種後獲得的蘋果雜交後代植株葉作為試材。步驟2，基因組DNA提取同前述測序方法。步驟3，PCR擴增同前述測序方法。步驟4，酶切實驗取5μ LPCR產物加入試管中，再加入2μ L反應緩衝液(IOx)、 1 μ L(IOU)限制性內切酶Riil I和12 μ L水，在37°C水浴2 3h進行酶切。20 μ L酶切產物加5 μ L上樣染料混合，溴化乙錠染色，在120V電壓、1. 2%瓊脂糖膠上進行電泳檢查酶切產物。步驟5，蘋果雜交後代植株著色性狀分析鑑於新找出的兩個突變位點能提供與前人蘋果著色性狀dCAPS分子標記突變位點相同的信息，表明利用新獲得的突變位點鹼基信息開發的蘋果果實著色性狀分子標記，同前人的蘋果著色性狀dCAPS分子標記一樣可鑑定蘋果雜交後代植株果實著色性狀。根據前人的dCAPS分子標記分析蘋果著色性狀結果，
6本發明實施例蘋果雜交後代植株中，有些植株PCR擴增產物酶切後僅出現一條495bp帶，其果實為紅色；有些植株PCR擴增產物酶切後僅出現一條698bp帶，其果實為非紅色；有些植株PCR擴增產物酶切後出現一條698bp帶和一條495bp帶，其果實為紅色(包括桔紅色)。 如果研究的目的是篩選非紅色品種，可保留僅出現一條698bp帶的雜交後代植株，捨棄其它雜交後代植株，因此可節約後期管理和篩選費用。如果研究的目的是篩選紅色品種，可捨棄僅出現698bp帶的雜交後代植株，保留其它雜交後代植株，節約後期管理和篩選費用。^MM 3 禾丨用突奪位點206鑑定蘋果品禾料首株著盧/丨牛狀步驟1，試材同前述測序方法。步驟2，基因組DNA提取同前述測序方法。步驟3，PCR擴增同前述測序方法。步驟4，電泳檢查同前述測序方法。步驟5，PCR產物測序同前述測序方法。步驟6，蘋果品種植株著色性狀分析鑑於新找出的突變位點206(也就是 MdMYBl-I基因轉錄起始點上遊_1624bp處)能提供與前人蘋果著色性狀dCAPS分子標記突變位點相同的信息，表明新獲得的突變位點206的鹼基信息，同前人的蘋果著色性狀dCAPS 分子標記一樣可鑑定蘋果雜交後代植株果實著色性狀。根據前人的dCAPS分子標記分析蘋果著色性狀結果，8個蘋果品種中，國光和紅玉2個蘋果品種PCR產物序列位點206含有G， 蘋果果實著色性狀為紅色；金帥和青香蕉2個蘋果品種PCR產物序列位點206含有A，蘋果果實著色性狀為非紅色性狀；富士、嘎拉、紅星和印度4個蘋果品種PCR產物序列位點206 含有G和A，蘋果果實著色性狀可能為紅色(包括桔紅色，如富士、嘎拉和紅星)，也可能為非紅色(如印度)。實施例4 利用突變位點280鑑定蘋果品種植株著餼性狀步驟1，試材同前述測序方法。步驟2，基因組DNA提取同前述測序方法。步驟3，PCR擴增同前述測序方法。步驟4，電泳檢查同前述測序方法。步驟5，PCR產物測序同前述測序方法。步驟6，蘋果品種植株著色性狀分析鑑於新找出的突變位點觀0(也就是 MdMYBl-I基因轉錄起始點上遊_1550bp處)能提供與前人蘋果著色性狀dCAPS分子標記突變位點相同的信息，表明新獲得的突變位點280的鹼基信息，同前人的蘋果著色性狀dCAPS 分子標記一樣可鑑定蘋果雜交後代植株果實著色性狀。根據前人的dCAPS分子標記分析蘋果著色性狀結果，8個蘋果品種中，國光和紅玉2個蘋果品種PCR產物序列位點280含有T， 蘋果果實著色性狀為紅色；金帥和青香蕉2個蘋果品種PCR產物序列位點280含有C，蘋果果實著色性狀為非紅色性狀；富士、嘎拉、紅星和印度4個蘋果品種PCR產物序列位點280 含有T和C，蘋果果實著色性狀可能為紅色(包括桔紅色，如富士、嘎拉和紅星)，也可能為非紅色(如印度)。
權利要求
1.蘋果MdMYBl基因的一處突變，其特徵是在MdMYBl-I基因轉錄起始點上遊-1624bp 處的鹼基發生與蘋果果實著色性狀相關的突變或者雜合突變G — A、G — G/A、G — Α/Τ ；基於該處突變可開發檢測方法鑑定蘋果果實著色性狀。
2.蘋果MdMYBl基因的一處突變，其特徵是在MdMYBl-I基因轉錄起始點上遊-1550bp 處的鹼基發生與蘋果果實著色性狀相關的突變或者雜合突變T — C、T — T/C、T — C/A ；基於該處突變可開發檢測方法鑑定蘋果果實著色性狀。
3.—種檢測上述權利1所述突變的CAPS分子標記方法，其特徵在於，包括以下步驟 步驟1 提取DNA樣本；步驟2 在上述權利1所述突變兩側利用MdMYBl基因設計引物； 步驟3:進行PCR擴增； 步驟4 電泳檢查PCR產物； 步驟5 用RnlI酶酶切PCR產物；步驟6 普通瓊脂糖電泳檢測酶切產物，與前人需要在昂貴NuSieve GTG瓊脂糖上電泳檢測的dCAPS分子標記相比，其實驗成本顯著降低。
4.一種檢測上述權利1或2所述突變的測序方法，其特徵在於，包括以下步驟 步驟1 提取DNA樣本；步驟2 在上述權利1或2所述突變兩側利用MdMYBl基因設計引物； 步驟3:進行PCR擴增； 步驟4 普通瓊脂糖電泳檢測PCR產物； 步驟5:PCR產物測序檢測。
5.根據權利要求1或2所述的突變，其特徵是可以用來鑑定蘋果品種及雜交後代植株果實著色性狀，對蘋果雜交後代植株著色性狀進行早期選擇，捨棄一部分植株，節省雜交後代植株的管理與篩選成本，為蘋果果實著色性狀改良提供一種有效的低成本分子育種手段。
全文摘要
蘋果MdMYB1基因中與著色相關的兩處突變及其檢測方法。本發明屬生物技術領域，為蘋果著色性狀改良提供一種低成本分子育種手段。利用蘋果著色相關基因MdMYB1設計一對引物，以蘋果基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得PCR擴增片段。對8個蘋果品種的PCR擴增片段進行測序和分析，找出兩處與蘋果著色性狀有關的基因突變，其中一處為Pml I酶切位點。利用該酶切位點開發出一個檢測突變的CAPS標記Mb2P，其顯著進步是它能用普通瓊脂糖電泳檢測，實驗成本顯著降低，不象前人的dCAPS標記需用昂貴的NuSieve GTG瓊脂糖電泳檢測。通過CAPS標記或測序方法檢測突變，可鑑定蘋果品種及雜交後代果實著色性狀，對蘋果雜交後代果實著色性狀進行早期選擇，捨棄部分植株，節省後代植株的管理與篩選成本。
文檔編號C12Q1/68GK102242186SQ201010168149
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月11日 優先權日2010年5月11日
發明者劉慶忠, 苑克俊, 魏海蓉, 黃立香 申請人:山東省果樹研究所