重組馬流感病毒毒株、其製備方法及由其製備得到的疫苗的製作方法
2023-07-30 00:40:21 2
重組馬流感病毒毒株、其製備方法及由其製備得到的疫苗的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種重組馬流感病毒毒株、其製備方法及由其製備得到的疫苗。該重組馬流感病毒包含：馬流感病毒A/equine/xinjiang/3/07(H3N8)株的HA和NA基因，以及流感病毒A/Puerto?Rico/8/34/Mount?Sinai(H1N1)（A/PR/8/34(H1N1，簡稱PR8病毒）的PB2、PB1、PA、NP、M和NS六個內部基因。本發明的一種馬流感重組病毒毒株、命名為rH3N8-PR，該毒株的保藏號為CGMCC?NO.8161。本發明還公開了該馬流感重組病毒的製備方法以及由其製得的疫苗。與親本株相比，本發明的馬流感重組病毒在雞胚和MDCK細胞上均能產生很高的病毒滴度和血凝效價，而且對小鼠的致病性顯著降低，實驗結果表明由本發明的馬流感重組病毒製得的疫苗具有良好的免疫原性和保護效力。
【專利說明】重組馬流感病毒毒株、其製備方法及由其製備得到的疫苗
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種重組病毒株，尤其涉及ー種馬流感重組病毒、其製備方法及由其製備得到的疫苗。本發明屬於生物工程【技術領域】，
【背景技術】
[0002]馬流感(Equine influenza, EI)是由正黏病毒科、流感病毒屬的A型流感病毒中的馬流感病毒(Equine influenza virus, EIV)引起的馬屬動物一種嚴重的常見上呼吸道急性高度接觸性傳染疾病，多呈暴發性流行，傳播非常迅速而且廣泛。OIE規定EI為法定報告動物疫病，我國將其列為三類傳染病。 [0003]目前流行的EI主要為H3N8亞型，然而由於各種壓カH3N8亞型EIV也在不斷發生變異導致多個譜系病毒的出現，而且EIV已經跨越種間障礙，犬和豬感染EIV事件的發生，使得EI的防控具有重要的公共衛生學意義。近年來EI頻繁暴發，自2003年以來，在英國及其他歐洲國家和美國經常有EI暴發的報導。此外，其他很少發生EI疫情的地區也已受到影響，如2003年至2004年在南非以及2008年在印度也暴發了 EI疫情。澳大利亞這樣從未發生過EI的國家於2007年也遭受了 EI的襲擊。
[0004]我國大陸地區一直以來都是EI的高發區。自建國以來我國共發生5次EI疫情。2007-2008年，我國暴發了第四次EI疫情，給我國的養馬業及即將興起的賽馬業以沉重的打擊。疫情首先在新疆暴發，隨後蔓延至全國各地。2007年從新疆疫情中分離到ー株H3N8亞型 EIV，命名為 A/equine/Xinjiang/3/07(H3N8)(簡稱 XJ3)。2009 年在廣西省以及 2011年在貴州省也暴發了小規模EI疫情。自1974年我國首次暴發EI以來，除了海南，臺灣和福建不曾有文獻報導外，我國EI的分布幾乎遍及大江南北。
[0005]當前疫苗接種是控制EI的效策略。我國曾開展EI疫苗研製工作，但這些疫苗早已不用，一旦EI發生後，主要採取ー些對症治療措施。目前我國所用疫苗都依賴於國外引迸，主要是法國Merial公司生產的重組金絲雀活載體疫苗Proteq-Flul。在2008年北京奧運馬術比賽舉辦之際，為了預防EI，我國不得不從國外引進EI疫苗進行緊急預防接種。對我國分離的H3N8亞型EIV的序列分析表明:我國流行的EIV屬於美洲譜系佛羅裡達2群，而我國所使用的疫苗Proteq-Flul所對應的美洲譜系疫苗株屬於肯塔基亞譜系，兩者比較，在HA基因上有15個位點胺基酸發生了變異，其中有8個分別位於A、B和C抗原區上，這警示我國的EIV正在進行變異，而且實驗也證實進ロ疫苗對我國EI不能夠提供完全保護。基於進ロ疫苗的昂貴价格，以及抗原針對性不強等缺點，開發ー種擁有我國自主智慧財產權、保護性良好的新型高效EI疫苗具有重要意義。
【發明內容】
[0006]本發明目的之ー是提供一株重組EIV，其包含EIV XJ3的HA和NA基因、以及流感病毒 A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(HlNl) (A/PR/8/34 (HlNl)，簡稱 PR8 病毒)的 6 個內部基因。[0007]本發明目的之二是提供ー種上述重組EIV的製備方法。
[0008]本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的:
[0009]本發明的一株重組馬流感病毒(Equine influenza virus),是通過以下方法製備得到的:
[0010](1)將馬流感病毒4/69111116八111」1&叩/3/07 013呢)(簡稱XJ3病毒)株的HA基因插入到流感基因轉錄/表達雙向載體中，獲得含馬流感病毒HA基因的重組質粒；
[0011](2)將馬流感病毒A/equine/xin jiang/3/07 (H3N8)株的NA基因插入到流感基因轉錄/表達雙向載體中，獲得含馬流感病毒NA基因的重組質粒；
[0012](3)將流感病毒 A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(HlNl) (A/PR/8/34 (HlNl))的六個內部基因PB2、PBl、PA、NP、M和NS分別插入到流感基因轉錄/表達雙向載體中，分別獲得含有各基因的重組質粒；
[0013](4)將以上獲得的8個重組質粒共轉染293T細胞和MDCK細胞共培養細胞單層，轉染的細胞經培養後，反覆凍融3次，使細胞裂解，釋放出病毒粒子，將含有細胞裂解物的培養液離心後，取上清液接種SPF雞胚，培養2-3天後，取雞胚尿囊液，檢測其血凝活性，獲得重組馬流感病毒。
[0014]在本發明中，優選的，所述的流感基因轉錄/表達雙向載體為pHW2000。
[0015]在本發明中，優選的，所述的馬流感病毒A/equine/xinjiang/3/2007 (H3N8)株的HA基因具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，或與SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。
[0016]在本發明中，優選的,所述的馬流感病毒A/equine/xinjiang/3/2007 (H3N8)株的NA基因具有SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，或與SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。
[0017]在本發明中，優選的,流感病毒A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (HlNl)的六個內部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS的核苷酸序列分別為SEQ ID N0.3_8所示，或與SEQ IDN0.3-8所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。
[0018]在本發明的ー個具體實施例中，將得到的一株重組馬流感病毒命名為rH3N8_PR，分類命名為:H3N8馬流感病毒；保藏時間是:2013年9月6日；保藏單位是:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，其保藏號為CGMCC N0.8161。
[0019]本發明的目的之三在於提供該重組EIV在製備預防或治療馬流感藥物，特別是EI疫苗中應用。
[0020]本發明重組EIV，在雞胚和MDCK細胞上均能產生比親本毒株高很多倍的病毒滴度和血凝滴度，可作為研製EI疫苗的優良種毒。
[0021]本發明的ー種馬流感疫苗，其特徵在於由下述方法製備:用以上任一項所述的重組馬流感病毒接種SPF雞胚或MDCK細胞，收穫雞胚尿囊液或細胞培養上清，即得。
[0022]進ー步的，本發明還提出了ー種疫苗組合物，其特徵在於包含所述的馬流感疫苗，以及藥物學上可接受的載體、佐劑或賦形劑等。
[0023]從免疫效カ試驗結果可以看出，本發明重組EIV製備的滅活疫苗免疫馬後能夠對同源強毒攻擊提供100%的保護。由此可見，本發明重組EIV製備的滅活疫苗具有良好的免疫原性，可有效預防或治療EI，是理想的疫苗候選毒株。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1是本發明實施例1重組EIV rH3N8的製備流程圖；
[0025]圖2是本發明實施例1EIV XJ3的HA和NA基因的RT-PCR電泳圖；
[0026]I:DL2000DNA Marker ;2:擬基因；3:嫩基因；4:對照。
[0027]圖3是本發明實施例2重組EIV及親本毒XJ3在雞胚上的生長曲線比較圖；
[0028]圖4是本發明實施例2重組EIV及親本毒XJ3在細胞上的生長曲線比較圖；
【具體實施方式】
[0029]下面結合附圖和實施例對本發明作進ー步詳細的說明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
[0030]實施例1本發明重組EIV rH3N8的拯救[0031 ] 1、EIV XJ3HA 和 NA 基因的 RT-PCR 擴增
[0032]使用華舜柱式病毒RNA提取試劑盒提取馬流感病毒A/equine/xinjiang/3/07 (H3N8)(簡稱XJ3病毒)的RNA，具體步驟參見試劑盒說明書。以A型流感病毒反轉錄通用引物Un1-12:5』 -AGCAAAAGCAGG-3』為反轉錄引物製備XJ3cDNA，反轉錄體系如下:DEPC H2019.0uL, XJ3RNA5.0uL, AMV RT buffer8.0u L,2.5mmol/L dNTPmixture4.0 u L、Un1-12 通用引物 2.0 u L、RNase Inhibitorl.0 u L 和 AMV ReverseTranscriptasel.0 u L,總體積40.0 u L0將上述反轉錄體系混勻，室溫靜置IOmin後，放於42°C水浴鍋中反轉錄lh，然後將反轉錄產物立即置於-4°C靜置2min，隨後使用或置於-20で保存。以XJ3cDNA為模板，用HA和NA基因的特異性引物(表1)分別進行PCR擴增。PCR 反應體系為:10XPCR bufferl0.0ii L、Ex Taq 酶 0.5 y L、2.5mmol/L dNTPmixture2.0 u L, I Opmo I/L HA 或 NA 基因上、下遊引物各 l.0u L、cDNA 模板 2.0 y L 和 ddH2083.5uL,總體積100.0uL0 PCR反應程序如下:94°C預變性5min、94°C變性30sec、53°C退火45sec、72°C延伸2min、72°C後延伸lOmin，共計30個循環。同時設無模板的陰性對照。反應結束後，PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑑定大小。結果如圖2所示，有2條PCR條帶出現，大小分別為HAl.7kb和NAl.4kb，與預期的相符。
[0033]表1擴增EIV HA和NA基因的特異性引物
[0034]
【權利要求】
1.一株重組馬流感病毒(Equine influenza virus),其特徵在於所述的重組馬流感病毒是通過以下方法製備得到的: (1)將馬流感病毒A/equine/xinjiang/3/07 (H3N8)株的HA基因插入到流感基因轉錄/表達雙向載體中，獲得含馬流感病毒HA基因的重組質粒； (2)將馬流感病毒A/equine/xinjiang/3/07 (H3N8)株的NA基因插入到流感基因轉錄/表達雙向載體中，獲得含馬流感病毒NA基因的重組質粒； (3)將流感病毒A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(HlNl)的六個內部基因 PB2、PB1、PA、NP、M和NS分別插入到流感基因轉錄/表達雙向載體中，分別獲得含有各基因的重組質粒; (4)將以上獲得的8個重組質粒共轉染293T細胞和MDCK細胞共培養細胞單層，轉染的細胞經培養後，反覆凍融3次，使細胞裂解，釋放出病毒粒子，將含有細胞裂解物的培養液離心後，取上清液接種SPF雞胚，培養2-3天後，取雞胚尿囊液，檢測其血凝活性，獲得重組馬流感病毒。
2.如權利要求1所述的重組馬流感病毒，其特徵在於所述的流感基因轉錄/表達雙向載體為pHW2000。
3.如權利要求1所述的重組馬流感病毒，其特徵在於所述的馬流感病毒A/equine/xinjiang/3/2007 (H3N8)株的HA基因具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，或與SEQ IDN0.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。
4.如權利要求1所述的重組馬流感病毒，其特徵在於所述的馬流感病毒A/equine/xinjiang/3/2007 (H3N8)株的NA基因具有SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，或與SEQ IDN0.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。
5.如權利要求1所述的重組馬流感病毒，其特徵在於流感病毒A/PuertoRico/8/34/Mount Sinai(HlNl)的六個內部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS的核苷酸序列分別為SEQ IDN0.3-8所示，或與SEQ ID N0.3-8所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。
6.如權利要求1-5任一項所述的重組馬流感病毒，其特徵在於所述的重組馬流感病毒命名為rH3N8-PR，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC N0.8161。
7.權利要求1-6任一項所述的重組馬流感病毒在製備預防或治療馬流感藥物中的應用。
8.ー種馬流感疫苗，其特徵在於由下述方法製備:用權利要求1-6任一項所述的重組馬流感病毒接種SPF雞胚或MDCK細胞，收穫雞胚尿囊液或細胞培養上清，即得。
9.ー種疫苗組合物，其特徵在於包含權利要求8所述的馬流感疫苗，以及藥物學上可接受的載體、佐劑或賦形劑。
【文檔編號】A61P31/16GK103602638SQ201310589569
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】劉明, 劉春國, 相文華, 劉大飛, 張雲, 曲連東 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所