一種表面展示家蠶乙醇脫氫酶重組芽孢及其製備方法

2023-07-23 14:43:31 1

專利名稱：一種表面展示家蠶乙醇脫氫酶重組芽孢及其製備方法
技術領域：
本發明屬於重組融合蛋白技術領域。具體涉及將乙醇脫氫酶作為外源活性蛋白展示在枯草芽孢桿菌表面的方法和重組芽孢。而言是指利用枯草芽孢桿菌在極端的溫度、乾燥以及暴露於有機溶劑和其他毒性化學物質等不利條件下能長期存活的性質，通過分子生物學方法將有活性的乙醇脫氫酶基因與芽孢衣殼蛋白基因重組後進行表達，使原先對溫度和PH不穩定的乙醇脫氫酶成為可在不同環境條件下具有相對穩定活性的乙醇脫氫酶融合蛋白。
背景技術：
乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)屬於氧化還原酶家族，能夠以煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)為輔酶，催化伯醇和醛之間的可逆反應。ADHs在很多生理過程中都起著重要作用，參與例如類固醇、類維生素A、脂質過氧化產物、脂肪酸、乙醇等代謝過程。在人和哺乳動物體內，ADH與乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase, ALDH)構成了乙醇脫氫酶系，參與體內乙醇代謝，是人和動物體內重要的代謝酶。目前，ADH的應用研究主要體現在以下幾個方面①ADH生物電極和乙醇生物傳感器，可用於工業分析乙醇濃度；②ADH的催化特性，在化學工業中應用於許多原材料及中間反應物的生產；③ADH作為人和動物重要的生理指標用於各項研究；④伴隨生物技術和酶工業的發展，ADH被作為新的實驗材料，用於開展各種新的研究。其中，利用乙醇脫氫酶開發有效的解酒產品已受到廣泛關注。在肝臟中，ADH與ALDH總活力的高低決定了乙醇代謝的速度。因此，在眾多的解酒藥物研究方面，ADH活性已被作為一項重要的檢測指標，用於觀察解酒藥物對ADH是否具有誘導作用，以便了解藥物能否加快乙醇分解代謝，從而減少乙醇對人體的損害。同時開發高活性的ADH與ALDH也已經成為解酒藥研究的重要方向之

然而，ADH對乙醇的催化活力對環境條件敏感，如溫度和PH值不適則易失活，這一缺點極大地影響了 ADH的應用前景。隨著生物工業生產對酶催化功能需求的日益增加，尋求一種新方法生產催化活性更穩定的酶蛋白是十分必要的。枯草芽孢桿菌OfeciBm subtilis)是好氧型的革蘭氏陽性菌，它在營養缺乏或其他脅迫條件下，能形成具有抗逆性的休眠體——芽孢，在適宜條件下芽孢又能萌發成具有繁殖能力的營養細胞。芽孢易培養易分離，可以免去複雜的分離純化操作。芽孢是生命世界中抗逆性最強的一種結構，其穩定性好，能耐氧化，耐高溫，並且在抗化學藥物和抗輻射等方面也十分突出，可在惡劣環境中存活幾年至幾十年。芽孢在酸性胃環境中能保持活性，可以耐唾液和膽汁的攻擊，從而順利通過動物消化道。研究證明，枯草芽孢桿菌對生物體無致病性，能作為抑制有害細菌(大腸桿菌、沙門氏桿菌)的益生素被人或動物口月艮(Mazza, P. 1994. The use of Bacillus subtil is as an antidiarrhoeal microorganism. Boll. Chim. Farm. 133:3 - 18.)目前市面上已有口服枯草芽孢桿菌活菌膠囊產品，北京紫竹藥業有限公司，國藥準字S20030018(http://WWW. 777aaa. com/html/ yao/20079182;3402711963569(^9.htm)，表明枯草芽孢桿菌芽孢可以通過人口服使用而產生藥效性。由於以上理化及生理特性，再加上其基因組的破譯和可操作的遺傳系統的建立，枯草芽孢桿菌芽孢成為備受關注的新型蛋白或酶類藥物載體。芽孢衣殼上的三種蛋白 CotBXotC和CotG由於暴露在芽孢表面而成為外源蛋白的新型表達系統，目前已有報導利用這種新型表達系統成功表達了一些外源蛋白，如對蝦白斑症候群病毒蛋白Vp^等，但是由於生物的特異性、基因表達受多種因素影響等原因，利用該表達系統是否能成功表達其他特定的活性蛋白仍有待研究。本發明以從模式生物家蠶力凡niori體內克隆得到的乙醇脫氫酶作為外源分子，以枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白CotC為載體，通過芽孢表面展示技術將家蠶乙醇脫氫酶 (BmADH, GeneBank登錄號NP_001037610. 1)展示在芽孢表面，使BmADH獲得大量表達的同時具有良好的抗逆性，提供了快速大量製備具有穩定活性的重組乙醇脫氫酶產品的方法。 本發明的產品在保持了枯草芽孢桿菌芽孢生理特性的基礎上，對乙醇的催化穩定性較之原家蠶乙醇脫氫酶蛋白有明顯提高，迄今尚未見類似的報導和發明專利。

發明內容
為了解決乙醇脫氫酶因在極端條件下的不穩定性而在工業應用上存在的困難，本發明以家蠶乙醇脫氫酶BmADH為例，提供了一種表面展示乙醇脫氫酶ADH的重組芽孢的製備方法和產品。本發明以枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白CotC為載體，通過芽孢表面展示技術將 BmADH展示在枯草芽孢桿菌的芽孢表面，得到在不同溫度、PH條件下具有較穩定活性的融合蛋白，可用於動物直接口服，成為一種新型的乙醇脫氫酶藥物營養品。相對於其他乙醇脫氫酶蛋白產品，本發明表面展示乙醇脫氫酶蛋白的製備方法和分離過程簡單快速，產生的融合蛋白生物活性更穩定，具有更廣泛的應用價值。本發明所採用的技術方案為
一種表面展示家蠶乙醇脫氫酶BmADH重組芽孢的製備方法，利用枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因為分子載體，與家蠶乙醇脫氫酶基因重組，構建融合表達的整合型重組質粒，並轉化枯草芽孢桿菌獲得枯草芽孢桿菌重組菌株，誘導重組菌株產生芽孢，在芽孢表面展示具有乙醇脫氫酶活性的融合蛋白。本發明的具體操作是通過反轉錄PCR的方法從家蠶cDNA文庫中擴增獲得家蠶乙醇脫氫酶BmADH的cDNA，將獲得的基因連接到克隆載體中測序正確之後，再將家蠶乙醇脫氫酶基因及aaofe連接到融合表達質粒pJS700(本實驗室保存)，構建出整合型重組質粒 pJS700-BmADH。用該質粒轉化枯草芽孢桿菌，採用耗竭法誘導宿主菌產生芽孢，在芽孢表面展示有融合蛋白CotC-BmADH。本發明選擇具有良好的轉化能力並且可以產生芽孢的枯草芽孢桿菌菌株為重組質粒的轉化菌株，例如feciBtts subtilis 168及其衍生的一系列菌株(Bacillus Genetic Stock Center, Department of Biochemistry, The Ohio State University, West 12th Avenue, Columbus, Ohio, 43210，USA)；選擇芽孢衣殼蛋白基因 coiC (GenBank 序列號 NP_389653)作為表面展示蛋白的分子載體，選擇家蠶乙醇脫氫酶基因及腕逾為重組基因。 枯草芽孢桿菌為環境友好型細菌，其在營養缺乏時會分化形成休眠體芽孢，芽孢具有極強的抗逆性，可耐酸鹼、耐高溫，存活能力較強；並因其比重大，容易進行分離純化。枯草芽孢桿菌的培養方法簡單方便，生長迅速，營養要求簡單，容易進行工業放大培養。在枯草芽孢桿菌的芽孢表面展示家蠶乙醇脫氫酶，使其在獲得快速大量表達的同時具有良好的抗逆性和穩定性，並且分離純化簡便快捷。本發明涉及發明所選擇的芽孢衣殼蛋白基因⑶M與ifeai/A基因編碼序列重組後構建的重組質粒，在此重組質粒中含有芽孢衣殼蛋白基因的啟動子、不含終止密碼子的編碼序列與iMaofe基因的編碼序列重組後的基因，可在枯草芽孢桿菌分化形成芽孢時融合表達CotC-BmADH。通過構建整合型重組質粒，使得融合基因cotC-Bmadh整合於枯草芽孢桿菌染色體上的特定位點並穩定地進行遺傳繁殖，避免了質粒在枯草芽孢桿菌細胞中容易丟失的缺點。納Bnmdh的表達載體可以通過熱擊法或電穿孔法轉化宿主細胞。使用本領域熟知的方法鑑定經過成功轉化帶有本發明構建的融合基因的細胞。如細胞的收集、裂解、澱粉板鑑定、提取染色體和PCR鑑定等，也可以在誘導表達後用BmADH特異抗體進行Western blotting 鑑定。本發明還涉及所構建的重組整合型質粒轉化枯草芽孢桿菌篩選所得到的重組菌株，這些重組菌株誘導形成的芽孢表面展示有重組家蠶乙醇脫氫酶，可通過SDS-PAGE和 Western blotting檢測其芽孢表面展示的重組蛋白，並檢測其對乙醇的催化活力。本發明涉及基因ifeai/A編碼序列片段克隆的引物序列
Bmadh-Y :5，-GGGGTACCATGGCACCGGATTTCGTGAAGCGTT-3『，下劃線表示 KpnI 限制性酶切位點；
Bmadh-R :5，-CGAGCTCCTATGTCTTGGAGAGTATTTGGA-3』，下劃線表示 SacI 限制性酶切位
點ο本發明涉及枯草芽孢桿菌澱粉酶基因也(GenBank序列號NP_388186)片段擴增的引物序列
awE-F :ATTGCTCGGGCTGTATGACTGG amy^-R :GTTACACCATCACTGTTCGTTCCTT
本發明的突出優點表現為將家蠶乙醇脫氫酶BmADH展示在枯草芽孢桿菌表面，利用芽孢所具有的獨特抗逆性，使得原本對溫度、PH值不穩定的酶蛋白成為具有相對穩定的乙醇催化活力的融合蛋白，克服了乙醇脫氫酶普遍具有的不穩定性缺點。本發明構建的表面展示家蠶乙醇脫氫酶BmADH的枯草芽孢桿菌重組芽孢可通過動物消化道屏障直接用於口服，成為一種新型的乙醇脫氫酶營養品或動物營養品。本發明產品表達量大、製備方法和分離過程相對於其他乙醇脫氫酶樣品更為簡單快速，具有更好的穩定性和更廣泛的應用價值，在一定程度上拓展了其工業應用前景，也為提高其他酶蛋白的穩定性提供了參考。


圖1是發明人克隆的家蠶乙醇脫氫酶BmADH在GenBank中檢索到的核苷酸序列和胺基酸序列，登錄號NP_001037610. 1。小寫字母為核苷酸序列，起始密碼子和終止密碼子用方框標出；大寫字母為胺基酸序列，TATA-box用斜體帶下劃線標出，Poly-A信號用下劃線標出，方框中的為保守胺基酸序列。圖2是融合表達CotC-BmADH整合型重組質粒pJS700-BmADH的構建方法及其結構圖譜。amyE 5』 -end和a 對3』 -end分別表示澱粉酶基因編碼序列的5』端和3』端』Aapr, Enf分別表示氨苄青黴素抗性基因和紅黴素抗性基因。姚Bacillus subtil is 168 (trpl的芽孢中融合表達CotC-BmADH重組蛋白的基因片段。oriC為大腸桿菌複製子片段。戰1MEmr-COtC-Bmadh^M六後在Bacillus subtilis 168 (ir/O 染色體中的整合示意圖。圖 4 是重組菌株 ^aciWw1S 力iihi 168 (ir/O/pJS700_BmADH 的澱粉酶活性分析。A 在澱粉平板上培養野生型菌株feciB^s subtilis 168 {trpl和重組菌株feciBm subtilis 168 (ir/O/pJS700-BmADH ；B 在澱粉平板上被碘液染色後的野生型菌株和重組菌株。圖 5是PCR檢測重組菌株中的片段。Marker: λ -EcoT14 I digest Marker ；分別以 feci/A/s 仰況i/is 168 {trpl (Wild-type, W) ^WBacillus subtilis 168 {trpl /pJS700-BmADH (Mutant, M)的染色體為模板，用 amyE-F/amyE-R、BmADH-F/ BmADH -R,BmADH -F/ amyE-R和amyE_F/ BmADH -R四對引物(引物對的在染色體中的位置見附圖3)進行PCR鑑定重組基因。圖6是轉基因重組芽孢表面展示的CotC-BmADH融合蛋白的SDS-PAGE和^festern blotting 鑑定。M 為 Marker，泳道 1 為野生型菌株feci/^As subtilis 168 (ir/O 對照， 泳道2為重組菌株融合蛋白。圖7是轉基因重組芽孢表面展示的CotC-BmADH融合蛋白與原BmADH蛋白在不同 PH值和溫度條件下的乙醇脫氫酶活力比較。實線所示PJS700-BmADH表示本發明所得融合蛋白，虛線所示BmADH表示原BmADH蛋白。
具體實施例方式實驗材料
各種限制性內切酶、T4 DNA ligase, 7 ^、7 《酶，pMD18_T載體均購至寶生物工程 (大連)有限公司，PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，測序由百奧邁科(Biomics) 生物技術有限公司完成，用於本發明的所有DNA片段的回收均採用Omega Bio-Tek Gel Extraction Kit分離純化，大腸桿菌菌株DH5 α (中國普通微生物保藏管理中心CGMCC，北京市朝陽區北辰西路1號院，中科院微生物研究所，100101)為本實驗室保存，其它試劑均為國產分析純。在本發明中所使用的術語，非特別說明的情況下，一般為本領域普通技術人員所理解的含義。以下實施例中未作具體說明的實驗操作方法均參照《分子克隆實驗指南》 (Sambrook等編著，科學出版社，1992年版)、試劑盒說明書、及產品說明書進行。以下的實施例只是為了舉例說明本發明，並非以任何方式限制本發明的範圍。在以下實施例中，未詳細描述的一些過程和方法都為本領域技術人員熟悉和了解的常規方法。所用試劑的來源、 商品名，均在首次出現時標明，其後所用相同試劑如無特殊說明，均與首次標明的相同。本發明實施例中涉及的由發明人保存的生物材料，均可向公眾提供20年。實施例1 家蠶乙醇脫氫酶及 基因的克隆、測序及鑑定
本發明所用家蠶品種由江蘇大學生命科學院飼養提供。取家蠶中腸組織，放入用液氮預冷的研缽中，加入液氮進行研磨，用RNA提取試劑盒分離mRNA，通過反轉錄PCR技術獲得家蠶乙醇脫氫酶基因的cDNA序列。家蠶乙醇脫氫酶及腕逾基因片段的PCR擴增引物為
Bmadh-Y 5' -GGGGTACCATGGCACCGGATTTCGTGAAGCGTT-3' ( SEQ ID NO. 1),下劃線表示KpnI限制性酶切位點；
Bmadh-R 5 -CGAGCTCCTATGTCTTGGAGAGTATTTGGA-3』 (SEQ ID NO. 2)，下劃線表示 SacI限制性酶切位點。PCR反應體系按TaKaRa LA Taq使用說明書嚴格進行，25 μ L反應體系中含TaKaRa LA Taq 0. 2 μ L, 10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) 2. 5 μ L, dNTP Mixture (各 2· 5 mM) 2. 5 μ L，模板DNA 1 μ L，上下遊引物(20 μ Μ)各0. 5 μ L，加滅菌超純水補齊。PCR條件為 94°C變性 5min，94°C lmin,61°C 40 s，72°C 2min，30 個循環。將大小為 825bp 的 PCR 產物克隆於PMD18-T載體中，轉化大腸桿菌DH5 α，篩選克隆菌株，提取質粒，通過PCR及^和 SacI雙酶切及瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆後，對重組質粒進行測序。克隆的重組質粒命名為pMD18-T-BmADH，重組子菌株命名為DH5 α /pMD18-T_BmADH。陽性重組菌株保存在含有 15%甘油的LB培養基中，凍存於_80°C。經測序重組質粒中乙醇脫氫酶Bmadh基因序列為SEQ ID NO. 3所示，測序結果與 GenBank ψ (http //blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi) WtlifSlj^^lJ—fji, JAL 1。實施例2 以CotC為載體展示BmADH的枯草芽孢桿菌重組芽孢的製備 1.重組整合型質粒pJS700-BmADH的構建
質粒pJS700(李倩.以CotX為分子載體表面展示WSSV囊膜蛋白Vpl9和Vp^的枯草芽孢桿菌重組芽孢的研究[D].江蘇鎮江江蘇大學，2010:36-38)由江蘇大學環境學院寧德剛副教授惠贈，該質粒大小約為5. 51Λ。在pJS700質粒中，也5』_end和也3'-end 分別表示澱粉酶基因amyE (GenBank登錄號NP_388186)編碼序列的5』端和3』端，通過同源重組整合在feciBm subtilis 168 (trpl染色體的澱粉酶基因中。澱粉酶基因_yE的PCR擴增引物為 amy^-￥ :ATTGCTCGGGCTGTATGACTGG (SEQ ID NO. 4) amy^-R :GTTACACCATCACTGTTCGTTCCTT (SEQ ID NO. 5)
Ampr, Emr分別表示氨苄青黴素抗性基因和紅黴素抗性基因，在大腸桿菌和ifeciBm subtilis 168 (trpl中作為篩選標記。coM為枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白CotC基因，該基因片段含有⑶乂基因(GenBank序列號NP_389653)的啟動子序列、不含有coM終止密碼子的CotC編碼序列。oriC為大腸桿菌複製子片段。分別用KpnY和5^1酶切質粒pMD18-T_BmADH和pJS700，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收汝 片段和？幾700，用T4 DNA Iigase連接兩雙酶切後純化好的片段，連接產物轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，轉化物塗布於含有50μ g/mL氨苄青黴素的LB平板中 37°C培養過夜，次日挑選陽性單克隆菌株於含有50 μ g/mL氨苄青黴素的LB液體培養基中， 37°C培養12至16h，提取質粒，通過PCR及f/wl和feci雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，鑑定正確後將重組整合型質粒命名為pJS700-BmADH，陽性重組菌株命名為DH5 α / pJS700-BmADHo該重組整合型質粒pJS700-BmADH中含有重組基因，該質粒的構建過程及其圖譜見圖2。
2.融合表達重組芽孢的枯草芽孢桿菌菌株的篩選與鑑定
將整合型重組質粒 pJS700-BmADH 轉化 feci/A/s subtil is 168 {trpl (Bacillus Genetic Stock Center, Department of Biochemistry, The Ohio State University, West 12th Avenue, Columbus, Ohio, 43210, USA)，兩者的同源區域發生重組，且重組基因插入澱粉酶基因破壞了其澱粉水解酶活性，見圖3。用含有0.4yg/mL紅黴素 (Sigma)的LB平板篩選重組子，從平板上挑選單菌落接種於含1%澱粉的LB平板中，37°C 過夜培養，次日用碘-碘化鉀溶液對澱粉平板染色來鑑定重組菌株。1%澱粉平板的製備方法100mL LB固體培養基中加可溶性澱粉0. Ig,高壓蒸汽滅菌後倒制平板。碘-碘化鉀溶液的配製碘化鉀2g，碘lg，蒸餾水300mL，先將碘化鉀溶於少量去離子水中，待全部溶解後再加入碘，振蕩溶解後稀釋至300mL，避光保存在棕色玻璃瓶中，用時可稀釋2 10倍。 取適量碘-碘化鉀溶液滴於澱粉平板上，菌落周圍產生透明水解圈表明重組基因沒有插入澱粉水解酶基因a 對中，菌落及其周圍顏色變藍表明重組基因成功的插入到了 subtiHs 168 {trpl染色體上的澱粉酶基因也中，因而導致澱粉水解酶失去活性，見圖 4。為了進一步鑑定重組菌株中正確插入了基因，發明人以枯草芽孢桿菌的染色體為模板，分別以 a _FE-F/a _FE-R、BmADH-F/BmADH-R、BmADH-F/amyE-R 和 amyE-F/BmADH-R四對引物進行PCR擴增。PCR反應體系按TM^Tfe LA Ti^使用說明書嚴格進行，25 μ L 反應體系中含 TaKaRa LA Taq 0. 2 μ L, 10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) 2. 5 μ L, dNTP Mixture (各 2.5 mM)2. 5 μ L，模板 DNA 1 μ L，上下遊引物(20 μ Μ)各 0· 5 μ L， 最後加滅菌超純水補齊。PCR反應條件根據各個引物對的特徵分別設置。在重組菌株中分別檢測到大小約為4200bp、825bp、700bp和2650bp的擴增片段，而野生型菌株中只檢測到約IlOObp的澱粉酶基因，見圖5。這表明重組菌株染色體上含有^/-coiC-^^ofe重組基因， 務lEnf-cotC-Bmadh重組片段成功的插入到了澱粉水解酶基因a 對中。將鑑定後的重組 MW^ Bacillus subti lis 168 {trpl /pJS700-BmADHo枯草芽孢桿菌染色體的提取方法為挑單菌落接於LB培養基中，在37°C搖床中培養至OD600值為1. 0左右。取1. 5mL菌液於Eppendorf管中，8000rpm離心IOmin,棄上清，加 100 μ L ρΗ8. 0的TE緩衝液(IOmM Tris-HCl，1 mM EDTA)洗沉澱，離心去上清，再加100 μ L TE懸浮沉澱；向懸浮液中加30 μ L 100mg/ml溶菌酶溶液，不要搖晃，在37°C培養箱中放 lh，加 50 μ L 10%SDS 和 20 μ L 20mg/mL 蛋白酶 K，37°C繼續培養 Ih ；補 TE 至 300 μ L，分別加150 μ L苯酚和氯仿抽提，12000rpm離心lOmin，取上清；再加300 μ 1氯仿，12000rpm離心 5min,取上清，加1/4體積5M的NaCl，2倍體積的無水乙醇，室溫下沉澱DNA 2h，12000rpm 離心lOmin，收集沉澱，用500yL 70%的乙醇洗沉澱，待揮發乾後，加IOyL TE緩衝液溶解沉澱，取1 μ L用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度，剩餘的可放於_20°C中保存備用。3.表面展示家蠶乙醇脫氫酶重組芽孢的誘導及鑑定
用 DSM 培養基誘導重組菌株 Bacillus subti lis 168 {trpl /pJS700-BmADH 形成芽孢。DSM 培養基的配方為0. 8% nutrient broth (營養肉湯 Difo)，0. 1% KCl,0. 025% MgSO4 · 7H20,1. OmM Ca(NO3)2 · 4Η20,10μΜ MnCl2,1. ΟμΜ FeSO4。將和重組菌株分別接種於 DSM培養基中，採用耗竭法培養48小時誘導宿主菌產生芽孢，取培養物進行處理。芽孢蛋白的處理方法12000rpmX IOmin離心收集菌體，重懸於相同體積的GTE Buffer (50mM葡萄糖，20mM pH7. 5 Tris-HCl, IOmM EDTA, 2mg/mL溶菌酶)中，37°C處理30分鐘用以破壞營養細胞，12000rpmX IOmin沉澱芽孢，用pH7. 4的PBS洗3次後重懸於相同體積的SDS-DTT緩衝液(0. ImM pH 7.4 PBS,50mM DTT，1. 5%SDS)中，65°C水浴處理 lOmin，進行 SDS-PAGE 後用考馬斯亮藍染色得到大小約為41kD的條帶。為了鑑定該條帶是否為目標融合蛋白，以兔抗 BmADH血清為一抗做Wfestern blotting檢測重組菌株和野生型菌株的芽孢蛋白。雜交結果顯示野生型菌株48h的培養物中沒有檢測到蛋白條帶，而重組菌株泳道出現大小約為 41kD的條帶，表示在芽孢形成的過程中，BmADH隨著芽孢衣殼蛋白CotC —同得到表達，因而能作為融合蛋白被BmADH特異抗體檢測到，見圖6。這表明重組芽孢中家蠶乙醇脫氫酶通過衣殼蛋白載體CotC被展示在了重組芽孢的表面。並且從PAGE膠上可以看出，孢子上的其他蛋白相對目標融合蛋白表達量十分小，即雜蛋白量少，體現了本發明純化步驟簡單的優點。4.融合蛋白的乙醇脫氫酶活力測定
由於乙醇脫氫酶在催化乙醇的過程中消耗輔酶NAD+產生NADH，其酶活力可通過用紫外分光光度計在;MOnm處檢測NAD+/NADH的含量測得。反應液成分及體積比為2 M乙醇 0. 5M NAD+ 緩衝液=1 3 :2。將本反應體系在一定溫度下孵育10分鐘後，按30 1的體積比加入重組孢子蛋白。在第1、4、6、8、10分鐘分別取混合液離心後記錄上清液在340nm處吸光值，讀數差值記為ΔΑ34。。以野生型菌株feciBm subtilis 168 (ir/7_)的孢子蛋白作為負對照。每分鐘消耗lymol NAD+被定義為1個單位(unit)的乙醇脫氫酶活力。計算公式(AA34tlXV) / (6.22 XbXWX At)，V為反應液總體積，b為比色皿厚度，W為樣本蛋白含量，用BCA蛋白定量試劑盒(Pierce)測得，Δ t為吸光值改變的前後時間差(分鐘)。為了測得融合蛋白酶活力在不同PH值下的穩定性，發明人選取了 0. IM醋酸鈉緩衝液，pH 4. 0 ；0. IM 磷酸鹽緩衝液(NaH2P04 - Na2HP04)，pH 7· 0 ；0. IM NaOH/ 甘氨酸緩衝液，ρΗ8. 0、9. 0、10. 0，分別作為緩衝液加入反應液體系，測定25°C時不同PH值條件下的酶活力。為了測得融合蛋白酶活力在不同溫度下的穩定性，發明人以PH9.0的0. IM NaOH/ 甘氨酸為緩衝液，分別測定融合蛋白在16°C、20°C、25°C、3(TC、37°C下的酶活力。將結果與原來的 BmADH 蛋白酶活力做比較(Nan Wang, et al. 2QII. Genetics and Molecular Biology, acc印ted)，結果顯示本發明所的產品的酶活力穩定性大大增加，見圖7。
權利要求
1.一種表面展示家蠶乙醇脫氫酶重組芽孢的製備方法，其特徵在於利用枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因為分子載體，與家蠶乙醇脫氫酶基因重組，構建融合表達的整合型重組質粒，並轉化枯草芽孢桿菌得到枯草芽孢桿菌重組菌株，誘導重組菌株產生的芽孢表面展示家蠶乙醇脫氫酶的重組芽孢。
2.按照權利要求1所述的表面展示家蠶乙醇脫氫酶重組芽孢的製備方法，其特徵在於所述的枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因為⑶^。
3.按照權利要求2所述的表面展示家蠶乙醇脫氫酶的重組芽孢的製備方法，其特徵在於所述的融合表達的整合型重組質粒是將枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因⑶M與家蠶乙醇脫氫酶基因重組構建的質粒。
4.按照權利要求3所述的表面展示家蠶乙醇脫氫酶的重組芽孢的製備方法，其特徵在於所述的枯草芽孢桿菌重組菌株是整合型重組質粒轉化枯草芽孢桿菌所得到的菌株，該菌株染色體上含有適用於枯草芽孢桿菌的選擇標記基因、以及芽孢衣殼蛋白基因與家蠶乙醇脫氫酶基因的編碼序列重組後的基因，這些基因插入澱粉酶基因中導致重組菌株的澱粉酶基因失活。
5.按照權利要求4所述的表面展示家蠶乙醇脫氫酶的重組芽孢，其特徵在於，重組芽孢是枯草芽孢桿菌重組菌株誘導形成的枯草芽孢桿菌的芽孢，芽孢表面展示有家蠶乙醇脫氫酶BmADH。
6.一種表面展示家蠶乙醇脫氫酶重組芽孢，其特徵在於是通過以下方法製備利用枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因為分子載體，與家蠶乙醇脫氫酶的基因重組，構建融合表達的整合型重組質粒，並轉化枯草芽孢桿菌得到枯草芽孢桿菌重組菌株，誘導重組菌株產生的芽孢表面展示家蠶乙醇脫氫酶的重組芽孢。
全文摘要
將家蠶乙醇脫氫酶作為外源蛋白展示在枯草芽孢桿菌表面，屬於重組融合蛋白技術領域。本發明以枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因cotC為分子載體，與家蠶乙醇脫氫酶基因Bmadh重組，構建出融合表達家蠶乙醇脫氫酶BmADH的整合型重組質粒。以之轉化枯草芽孢桿菌，通過同源重組使外源基因整合於染色體上特定位點的澱粉酶基因amyE中，使澱粉酶基因被破壞而導致重組菌株無澱粉酶活性，以此成功地篩選出含有融合表達CotC-BmADH的重組枯草芽孢桿菌菌株。通過誘導表達該重組菌株得到表面展示有家蠶乙醇脫氫酶融合蛋白的芽孢。本發明使原本對溫度和pH不穩定的乙醇脫氫酶成為可在不同環境條件下具有相對穩定活性的乙醇脫氫酶融合蛋白，所產生的重組芽孢可用於動物直接口服。
文檔編號C12R1/125GK102174557SQ20111006327
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月16日 優先權日2011年3月16日
發明者姚勤, 寧德剛, 李國輝, 王楠, 陳克平 申請人:江蘇大學