一種血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒株及其應用的製作方法

2023-07-12 06:52:32

本發明屬於微生物病毒領域，具體涉及一種血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒株及其應用。
背景技術：
：Ⅰ群禽腺病毒屬於腺病毒科、禽腺病毒屬。Ⅰ群禽腺病毒，代表株為致死雞胚孤兒病毒。它們享有一種共同的群特異性抗原，其中從雞分離的有12個血清型(FAV1-12)，火雞兩個血清型(TAV1-2)，鵝三個血清型(GAV1-3)和鴨1個血清型。Ⅰ群禽腺病毒可引起禽類不同程度的疫病，且各血清型之間交叉保護效果不佳。近年不斷有報導，血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒力增強，在國內多地爆發疫病，造成嚴重的經濟損失。2015年湖北也有多個養雞場雞群發病，部分雞隻急性死亡。剖檢發現，心包積水、肝臟質脆變色、腎臟腫大、腺胃網狀出血。通過病毒分離鑑定、病毒基因組測序分析、動物回歸試驗等實驗證明該病是由血清4型的Ⅰ群禽腺病毒所引起。但國內尚無預防Ⅰ群禽腺病毒的商品化疫苗，也無預防血清4型的Ⅰ群禽腺病毒的商品化疫苗。Ⅰ群禽腺病毒疫苗的研製均處在臨床階段或實驗室階段。獲得生產特性優良的疫苗毒株，並儘早研發出用於預防血清4型Ⅰ群禽腺病毒的疫苗是有效防控疫病的關鍵。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒株及其應用。本發明的目的通過下述技術方案實現：一種血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒株，本發明將其命名為CPHB03株，CPHB03株於2016年9月20日保藏於中國典型培養物保藏中心(保藏地址：中國.武漢.武漢大學)，其分類命名為Ⅰ群禽腺病毒CPHB03AviadenovirusCPHB03，保藏號為CCTCCNO：V201651。所述的Ⅰ群禽腺病毒毒株CPHB03株毒力強，可作為Ⅰ群禽腺病毒疫苗效力檢驗時的攻毒用強毒使用。所述的Ⅰ群禽腺病毒毒株CPHB03株可用於製備I群禽腺病毒疫苗。一種Ⅰ群禽腺病毒疫苗，包含所述的Ⅰ群禽腺病毒毒株CPHB03株。綜上，本發明的血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株可作為疫苗生產毒株和疫苗檢驗毒株生產疫苗、防控疫病。本發明具有的優點和有益效果：本發明將血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株滅活後與礦物油佐劑混合乳化製成滅活疫苗，免疫易感動物(雞)，免疫後21日，血清中和抗體效價幾何平均值10000左右。免疫後21日攻毒，免疫組死亡率、排毒率顯著低於空白雞攻毒組。血清學研究、攻毒保護研究的結果顯示，CPHB03株製備的疫苗能夠使易感動物產生較高效價的中和抗體、能抵禦本病的致死性攻擊，能明顯降低感染後的排毒率。附圖說明圖1是血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株的遺傳進化分析結果圖。圖2是血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株的同源性分析結果圖。具體實施方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。實施例1血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株的分離、培養與鑑定2015年湖北某養雞場蛋雞群發病、部分雞隻急性死亡。剖檢發現，心包積水、肝臟質脆變色、腎臟腫大、腺胃網狀出血。無菌取病死雞的肝臟，用研缽將肝臟研碎，向其中加入滅菌生理鹽水，混勻後樣品移入15mL離心管，3000rpm離心10min，上清經0.22μm濾器過濾除菌，即為病毒液，備用。將上述病毒液原倍、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀釋度分別接種長勢良好的原代雞胚肝細胞，置於37℃培養120小時左右，凍收細胞病變達70％左右的最高稀釋度的培養物，分裝，標記為F1代病毒液，冷凍保存。將F1代病毒液原倍、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀釋度分別接種長勢良好的原代雞胚肝細胞，置於37℃培養120小時左右，凍收細胞病變達70％左右的最高稀釋度的培養物，分裝，標記為F2代病毒液，冷凍保存。如上操作獲得F3代。將F3代病毒液原倍、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀釋度分別接種長勢良好的原代雞胚肝細胞，37℃孵育1小時，吸取、棄去病毒液，加入37℃的含1％瓊脂糖的細胞維持液，待瓊脂糖凝固後置於37℃、5％CO2培養箱培養120小時左右，10-7稀釋度的細胞培養皿中有多個獨立存在的可見噬斑，挑取其中一個獨立的噬斑，即為F4代病毒，凍融後備用。將F4代病毒液按0.1％(V/V)接種長勢良好的原代雞胚肝細胞，置於37℃培養48小時左右，細胞病變達70％左右，凍收細胞培養物，分裝，標記為F5代病毒液，冷凍保存。按《中國獸藥典》中外源病毒檢驗方法檢驗F5代病毒液，結果顯示，F5代病毒液無外源病毒汙染，是純淨的病毒液。按此方法傳代、放大培養，用於後續研究。Hexon蛋白是禽腺病毒主要的抗原蛋白，含有型、組特異性抗原表位及中和抗原表位。編碼Hexon蛋白的Hexon基因在親緣關係較近的禽腺病毒中相對保守，可以用於確定禽腺病毒毒株在禽腺病毒的分類學位置並確定其與其他毒株的進化關係。設計特異性引物(表1)分段(A、B、C三段)測定Hexon基因序列，A、B、C三片段拼接後可獲得Hexon全基因序列。提取F5代病毒DNA，用特異性引物(表1)進行PCR檢測，1％瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。將PCR產物基因測序，並進行同源性分析和遺傳進化分析。由結果(圖1、2)可以看出，所分離病毒屬於Ⅰ群禽腺病毒，與血清4型的Ⅰ群禽腺病毒同源性最接近，與其他型的Ⅰ群禽腺病毒同源性低。因此，鑑定所分離病毒為血清4型的Ⅰ群禽腺病毒，將其命名為CPHB03株。表1.特異性引物血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株於2016年9月20日保藏於中國典型培養物保藏中心(保藏地址：中國.武漢.武漢大學)，其分類命名為Ⅰ群禽腺病毒CPHB03AviadenovirusCPHB03，保藏號為CCTCCNO：V201651。實施例2血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株的毒力測定1、CPHB03株對雞胚肝細胞的毒力(CPHB03株的病毒含量)製備雞胚肝細胞鋪96孔細胞培養板，37℃、5％CO2條件下培養24小時左右，棄去96孔細胞培養板內的細胞生長液。F5代CPHB03株病毒液用細胞維持液做10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-8、10-9稀釋病毒液接種96孔細胞培養板，0.1mL/孔，每個稀釋度6個重複孔，置於37℃、5％CO2培養箱培養。接種後7天，顯微鏡下觀察96孔細胞培養板，統計各稀釋度出現、不出現細胞病變孔的數量，以Reed-Muench法計算被檢樣品病毒含量。CPHB03株F5代病毒含量為108.0TCID50/0.1mL。按照上述方法多次測定不同代次(F6代-F13代)的CPHB03株病毒含量，結果見表2。結果顯示，CPHB03株病毒含量高，F5代到F13代的病毒含量在108.0TCID50/0.1mL到109.2TCID50/0.1mL之間，明顯高於現有技術已知的血清4型Ⅰ群禽腺病毒毒株。業內公知，以體液免疫為主的疫病，其疫苗中的抗原病毒含量是決定滅活疫苗保護效果的重要指標，據此，血清4型Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株應用於疫苗中更具有優勢。表2.各代次CPHB03株病毒含量表代次病毒含量(TCID50/0.1mL)F6代108.0F7代108.5F8代108.0F9代109.2F10代109.0F11代109.2F12代108.5F13代109.02、CPHB03株對易感動物(雞)的毒力將108.0TCID50/0.1mL、106.0TCID50/0.1mL、104.0TCID50/0.1mL、102.0TCID50/0.1mL的CPHB03株分別肌肉注射接種42日齡SPF雞10隻，每隻0.2mL。觀察記錄發病情況。攻毒後第1、3、5、7、10日，採集喉頭、洩殖腔棉拭子，檢測喉頭、洩殖腔排毒情況。試驗雞攻毒後2-5日出現發病的臨床症狀，表現為精神沉鬱、羽毛逆立，發病後1-2日部分雞隻死亡，不死的雞逐漸康復；各組死亡率分別為8/10、6/10、5/10、6/10；剖檢死亡雞可見典型的心包積水、肝臟質脆變色、腎臟腫大、腺胃網狀出血。攻毒後10日內排毒率10/10。該結果表明，CPHB03株毒力較強，可作為疫苗效力檢驗時的攻毒用強毒使用。實施例3血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株的免疫原性評價向病毒含量為107.5TCID50/0.1mL的CPHB03株病毒液中加入終濃度0.1％(v/v)的甲醛溶液，37℃滅活24小時。取0.5mL滅活後的抗原接種培養了16-24小時的雞胚肝細胞，作為F1代；F1代培養72小時如無細胞病變再接種培養了24小時的雞胚肝細胞，作為F2代；F2代培養168小時未見細胞病變說明為被檢抗原滅活完全。滅活的抗原中加入吐溫80使吐溫80佔總體積的4％，混勻即為水相；白油中加入司本80和硬脂酸鋁，使司本80佔總體積的6％、硬脂酸鋁與白油的質量體積比為1.5％，混合加熱溶解，滅菌後即為油相。水相:油相(體積比)＝1:2的比例以剪切機高速剪切，使成為油乳劑疫苗。取21日齡SPF雞40隻，隨機分為4組，每組10隻，1、3組頸部皮下注射疫苗，每隻0.3mL，2、4組為不免疫對照組。接種後第21日，檢測免疫雞血清中和抗體效價，血清中和抗體效價幾何平均值10000左右(表3)。「幾何平均值10000左右」是一次免疫能夠獲得的較高的抗體效價，從而反映CPHB03株毒株具有較好的免疫原性。表3.血清中和抗體效價中和抗體效價(log10)平均值±標準差1組4.4、4.4、3.6、4.0、4.5、4.0、4.5、3.5、4.4、3.64.1±0.43組4.0、4.5、4.4、4.0、3.6、3.4、4.25、4.0、5.4、4.54.2±0.6接種後第21日，1、2組雞肌肉注射CPHB03株病毒液106.0TCID50/0.1mL，每隻0.2mL；3、4組雞肌肉注射CPHB03株病毒液102.0TCID50/0.1mL，每隻0.2mL。觀察14日，攻毒後第1、3、5、7、10日，採集喉頭、洩殖腔棉拭子，檢測喉頭、洩殖腔排毒情況。死亡、排毒情況見表4。結果說明，CPHB03株製備的疫苗能夠使易感動物產生較高效價的中和抗體、能抵禦本病的致死性攻擊，能明顯降低感染後的排毒率。表4.死亡、排毒情況組別死亡比例攻毒後第5日排毒比例攻毒後10日內排毒比例10/101/101/1025/109/1010/1030/101/101/1045/1010/1010/10上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。SEQUENCELISTING武漢中博生物股份有限公司一種血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒株及其應用16PatentInversion3.3126DNAArtificialA片段上遊引物1gggcgcctgaagctgcaacaagatct26228DNAArtificialA片段下遊引物2cgcggcggtgttgttggtgtagagttta28323DNAArtificialB片段上遊引物3cgggcatgaacgtggtggtcgag23426DNAArtificialB片段下遊引物4ccgctgttgtccgtggtaggggtgta26528DNAArtificialC片段上遊引物5cgacggcgccagcatcatctacaacgag28630DNAArtificialC片段下遊引物6ggccggtttgtacatattctcgtggttgac30當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp