一種用於診斷乳腺癌的螢光定量pcr試劑盒的製作方法

2023-07-12 00:53:51

一種用於診斷乳腺癌的螢光定量pcr試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明屬於生物化學與分子生物學領域，提供一種用於診斷乳腺癌的螢光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有特異性擴增檢測人HERC4基因mRNA表達水平的螢光定量PCR引物：5』-GTCTCCACAGTTGCCAGTAATA-3』(SEQ?NO.1)，5』-CTAAAGCACTGCAGCATCAATAA-3』(SEQ?NO.2)；和螢光探針：5』FAM-ACCCAGTGATTGGTGCTCATAGTAGC-BHQ13』(SEQ?NO.3)。該試劑盒對乳腺癌中HERC4基因的表達檢測具有良好的敏感性和特異性，重複性很好，可以有效的區分乳腺癌癌變的上皮細胞和正常乳腺上皮細胞(或乳腺良性病變細胞，包括乳腺增生、乳腺囊腫、乳腺纖維瘤、乳腺炎導管內乳頭狀瘤等)，從而為乳腺癌的臨床診斷和鑑別診斷提供參考依據。
【專利說明】—種用於診斷乳腺癌的螢光定量PCR試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物化學及分子生物學領域，具體涉及包含核酸測定或檢驗方法的檢測試劑。
【背景技術】
[0002]自上世紀70年代末開始，全球乳腺癌發病率一直呈上升趨勢。世界衛生組織GL0B0CAN網站統計預測，2013年全球有130萬婦女被診斷患有乳腺癌，45萬死於乳腺癌。國家癌症中心和衛生部疾病預防控制局2012年公布的數據顯示:在全國腫瘤登記地區，2009年乳腺癌發病率位居女性惡性腫瘤的第I位，女性乳腺癌發病率(粗率)全國合計為42.55/10萬,城市為51.91/10萬,農村為23.12/10萬。可見乳腺癌已成為威脅女性生命和健康，影響當前社會的重大公共衛生問題。
[0003]乳腺癌的早期發現、早期診斷，是提高療效的關鍵。據國內資料報導，乳腺癌I期的5年生存率在90%~95%以上，II期是70%到80%，III期是50%到60%，IV期則是10%左右，其治癒率與臨床分期存在相關關係。早期乳腺癌的治癒率高，晚期的治癒率低，因此早期診斷、早期治療對於乳腺癌的防治具有重要意義。然而，早期乳腺癌往往不具備典型的症狀和體徵，不易引起重視。多數患者是自己無意中發現乳腺腫塊來醫院就診的，少數患者是通過定期體檢或篩查被發現乳腺腫物或可疑病變。這種被動診斷的結果常常造成了早期治療的延誤。
[0004]目前國內乳腺癌 的診斷主要是通過實驗室檢查和輔助檢查。應用免疫學的方法對於腫瘤標誌物的檢查，普遍存在特異性差、靈敏度低等問題，尤其對於早期乳腺癌的診斷效率更低。而影像學檢測對於佔位較大的腫瘤才有較高的診斷率。同樣脫落細胞學檢查主要是針對乳頭溢液塗片、乳腺腫物破潰處等症狀已經較為明顯的組織進行檢查。除此之外，中國屬於發展中國家，人口基數龐大，開展以影像學為主的篩查還需要一段時間。多數乳腺癌患者確診時已處於晚期，對於病人術後預後的檢測和有效治療方法的選擇需要更有效、更簡便的方法。
[0005]研發具有靈敏度高、特異性強、簡單方便的乳腺癌診斷產品，是提高乳腺早期檢出率，改善預後的關鍵之一。蛋白質的降解主要有兩條途徑，其中一條是通過溶酶體的非特異性降解；另外一條是通過泛素-蛋白酶系統(UPS)的特異性降解，被選擇的蛋白質連接有泛素「標籤」以後，就會被轉入26S蛋白酶體中進行特異性降解。泛素是由76個胺基酸組成的蛋白質，廣泛存在於生物體內。泛素連接至蛋白質的胺基酸殘基上主要通過三種酶的作用:泛素激活酶(El)、泛素結合酶(E2)和泛素連接酶(E3)。E3泛素連接酶決定了泛素化底物的特異性，大量研究表明，泛素-蛋白酶系統(UPS)在腫瘤的發展、發展過程中起到了關鍵作用。
[0006]HERC4是近年來才被鑑定出的一種E3泛素連接酶，其特點是具有HECT結構域和至少一個RCCl樣結構域。免疫螢光結果顯示HERC4定位於細胞的核內體和溶酶體中。研究證明，在小鼠中突變HERC4基因，可通過減弱成熟精子的運動性而間接影響雄性小鼠的生育能力。關於HERC4基因在乳腺癌發生、發展過程中起到的作用，及其可以作為一種新的乳腺癌臨床診斷和鑑別診斷的分子標誌物應用於臨床，目前國內外尚未有報導。

【發明內容】

[0007]本發明要解決的技術問題是提供一種用於診斷乳腺癌的螢光定量PCR檢測試劑盒，該試劑盒對乳腺癌中HERC4基因表達檢測具有良好的敏感性和特異性等特點。
[0008]本發明解決上述問題的技術方案具體是:
[0009]一種用於診斷乳腺癌的螢光定量PCR試劑盒，該試劑盒包括一對引物、螢光探針和定量陽性模板，其特徵在於，
[0010](I)所述的一對引物是特異性擴增HERC4基因的引物，其序列為:
[0011]上遊引物序列為:5』-GTCTCCACAGTTGCCAGTAATA-3』 (SEQ N0.1)； [0012]下遊引物序列為:5』-CTAAAGCACTGCAGCATCAATAA-3』 (SEQ N0.2)；
[0013](2)所述的螢光探針的序列為:
[0014]5』FAM-ACCCAGTGATTGGTGCTCATAGTAGC-BHQ13』 (SEQ N0.3),
[0015]其中FAM為標記在探針5』端的螢光基團，BHQl為標記在探針3』端的螢光淬滅基團；
[0016](3)所述的定量陽性模板為克隆有HERC4基因片段的pMD18-T載體重組質粒，其中所述的HERC4基因片段的序列為:
[0017]GTCTCCACAGTTGCCAGTAATAAAAAGAAACATTGGCTACTATGAGCACCAATCACTGGGTTATAGCTTTCAAAAT TATTGATGCTGCAGTGCTTTAG(SEQ N0.4)。
[0018]本發明所述的用於診斷乳腺癌的螢光定量PCR試劑盒還包括Taq DNA聚合酶預混液和參比染料。
[0019]本發明所述的特異性擴增HERC4基因的引和物螢光探針可以採用本領域常用的方法合成。
[0020]上述的螢光定量PCR試劑盒中的，所述的Taq DNA聚合酶預混液為來自大連寶生物(Takara)公司的Premix Ex Taq?,所述的參比染料為來自大連寶生物(Takara)公司的ROX Reference Dye II。
[0021]本發明所述的定量陽性模板的構建方法是將HERC4基因片段(SEQ N0.4)插入到PMD18-T質粒載體中構建重組質粒得到，其中所述的將HERC4基因片段(SEQ N0.4)插入到質粒載體的方法為本領域的常規方法，具體的步驟和參數按照所選的質粒載體、插入片段、DNA連接酶等而定。
[0022]根據Genbank檢索結果,HERC4基因在人體內主要有兩個可變轉錄本(transcriptvariant) ,Genbank登錄號分別為ΝΜ_022079.2及ΝΜ_015601.3，BLAST結果顯示，這兩個轉錄本僅有24個鹼基(I個外顯子)的差別，本發明人通過前期研究發現，這兩個轉錄本在正常乳腺上皮細胞中均不表達，而在乳腺癌組織中明顯高表達，因此本發明試劑盒針對HERC4基因的兩個轉錄本中的共有序列設計了上遊及下遊擴增引物(SEQ N0.1和SEQ N0.2)，其位置在靠近HERC4基因多聚腺苷酸尾部(如圖1所示)，以保證該片段在逆轉錄過程中能夠得到有效的合成。
[0023]本發明所述的試劑盒的使用方法為:[0024](I)螢光定量PCR，反應體系如下:
[0025]表1本發明試劑盒Real-Time PCR反應體系
【權利要求】
1.一種用於診斷乳腺癌的螢光定量PCR試劑盒，該試劑盒包括一對引物、螢光探針和定量陽性模板，其特徵在於， (1)所述的一對引物是特異性擴增HERC4基因的引物，其序列為: 上遊引物序列為:5』 -GTCTCCACAGTTGCCAGTAATA-3』 ； 下遊引物序列為:5』 -CTAAAGCACTGCAGCATCAATAA-3』 ； (2)所述的螢光探針序列為:
5』 FAM-ACCCAGTGATTGGTGCTCATAGTAGC-BHQ13』， 其中FAM為標記在探針5』端的螢光基團，BHQl為標記在探針3』端的螢光淬滅基團； (3)所述的定量陽性模板為克隆有HERC4基因片段的pMD18-T載體重組質粒，其中所述的HERC4基因片段的序列為:
GTCTCCACAGTTGCCAGTAATAAAAAGAAACATTGGCTACTATGAGCACCAATCACTGGGTTATAGCTTTCAAAAT TATTGATGCTGCAGTGCTTTAG。
2.根據權利要求1所述的一種用於診斷乳腺癌的螢光定量PCR試劑盒，其特徵在於，所述的試劑盒還包括Taq DNA聚合酶預混液和參比染料。
【文檔編號】C12Q1/68GK103981276SQ201410243062
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月3日 優先權日:2014年6月3日
【發明者】石嶸, 周暉, 周珏宇, 危敏, 馬文麗 申請人:南方醫科大學