一種人體液hsp70膠體金標檢測試紙條及其製備方法

2023-07-12 00:32:16 1

專利名稱：一種人體液hsp70膠體金標檢測試紙條及其製備方法
技術領域：
本發明屬於免疫學分析技術領域，具體涉及一種人體液中HSP70膠體金標檢測試紙條及製備方法。
背景技術：
熱休克蛋白家族(HSPs)是一類高度保守的蛋白，熱休克蛋白70 (heat shockprotein 70, HSP70)是熱休克蛋白家族中的重要成員，其分為誘導型的組成型的。當機體受到外界環境中多種不良因素刺激時，誘導型的HSP70蛋白表達升高。HSP70蛋白對細胞損傷的修復、存活和維持正常的細胞功能是必需的。在環境刺激、病原菌感染、疾病引起細胞應激損傷中發揮分子伴侶作用，阻止蛋白聚集，促進損傷蛋白的重新摺疊。在大多數的哺乳動物，只有在應激條件下誘導型HSP70表達，而且顯著的細胞和機體應激後才能檢測到，但是在人和靈長類，誘導型的HSP70有一個基準值，在一些特殊條件下如過熱、化學有毒物·質暴露、缺氧、缺體、感染、自身免疫性疾病、凋亡、器官移植、細菌和病毒引起的感染，動脈粥樣硬化等心體管疾病中，生物體的HSP70表達顯著升高；在正常老化過程，精子發生，月經，運動練習等正常生理過程中，生物體的HSP70表達也顯著升高，提示其在這些過程中可能發揮重要作用。酶聯免疫吸附分析(enzymelinked immμ nosorbent assay, ELISA)技術是目前進行體液生物蛋白檢測最為常用的方法，與其他檢測方法相比，ELISA檢測方法具有成本低、檢測設施設備簡單、快速高效的特點，並在不斷改進當中，已經有直接ELISA、間接ELISA、單抗體ELISA，微波ELISA、雙抗體夾心ELISA方法。但是ELISA方法，目前只適用於實驗室檢測，不能適用於現場檢測。應激是機體在對生存環境中多種不利因素適應過程中，實際或認知上的要求與適應和應付能力之間不平衡導致的身心緊張狀態及其反應。應激同人的健康有密切聯繫，這種聯繫是雙向的一方面應激可影響人的健康，另一方面一個人的健康狀況也會影響應激條件下心理應激反應的強度和對應激的耐受力。適度的心理應激是人成長和發展的必要條件，適當的應激有助於維持人的生理、心理和社會功能，應對挑戰既可以引起我們的緊張、勞累、苦惱和痛苦，又可以為我們帶來成功的喜悅、輕鬆和歡樂。但是長期、超過人適應和應對能力的應激就會損害人的健康，這是心理應激對健康的消極影響，主要表現在下述三個方面。首先，心理應激引起的心理和生理反應可以以症狀和體徵的形式見之於臨床，成為人們身體不適、虛弱和精神痛苦的根源和就醫需求幫助的原因；其次，心理應激可以加重已有的精神障礙和軀體疾病，或使這些疾病復發；最後，心理應激可以造成對疾病的易感狀態，並且在其他因素的共同作用下導致新的精神障礙和軀體疾病。隨著研究的深入，HSP70作為應激的生物標記物，可以檢測機體應激水平，預防應激損傷的發生，用於機體應激負荷健康風險評估。

發明內容
本發明的目的是克服現有檢測HSP70技術的不足，提供一種人體液HSP70膠體金檢測試紙條。本發明的目的還在於提供上述檢測試紙條的製備方法。一種人體液HSP70膠體金標檢測試紙條，此試紙條由設在固定板I上依次相連的樣品墊2、金標墊3、硝酸纖維素膜4和吸水紙9組成；在硝酸纖維素膜4上設有第一檢測線5、第二檢測線6和第三檢測線7和一條質控線8 ;在金標墊3上設有金標抗體。固定板I為具有壓敏膠的PVC板，樣品墊2為玻璃纖維膜，金標墊3為聚酯纖維膜。金標抗體為顯色抗體，檢測線為捕捉抗體，顯色抗體與捕捉抗體為I對雙抗體夾心配對的鼠抗人HSP70單克隆抗體。 金標抗體用粒徑為20nm-60nm的膠體金顆粒標記。質控線8為羊抗鼠免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)。上述人體液HSP70膠體金標檢測試紙條的製備方法，包括以下步驟(I)用常規的檸檬酸三鈉還原法製備均勻粒徑為20nm-60nm的膠體金；(2)調節上述膠體金pH為8. 5-10，然後加入顯色抗體與其反應，其中顯色抗體的濃度為O. 04mg/ml，離心得沉澱，重懸沉澱，得金標抗體溶液，將金標抗體溶液用噴墨儀噴印在聚酯纖維膜，晾乾；(3)將捕捉抗體用抗體稀釋液稀釋成濃度為lmg/ml的捕捉抗體溶液，用噴墨儀將捕捉抗體溶液在硝酸纖維素膜上噴劃三條平行檢測線，真空乾燥；(4)將羊抗鼠IgG用抗體稀釋液稀釋成濃度為O. 5mg/ml的羊抗鼠IgG溶液，用噴膜儀將抗體噴線在硝酸纖維素膜上形成質控線，真空乾燥；(5)按樣品墊、金標墊、硝酸纖維膜、吸水紙順序粘貼在固定板上，切條，裝入塑膠袋，乾燥包裝。離心的方法為反應液於5000xg離心30min，沉澱用lwt%牛血清白蛋白溶液重懸浮，反覆2次；其中I wt %牛血清白蛋白溶液為IOmM的Tris-HCl緩衝溶液，pH為8. 5，含lwt%的牛血清白蛋白。步驟(2)中重懸沉澱的溶液為20mM的Tris-HCl緩衝溶液，pH為8. 5，其中含30wt%的海藻糖，lwt%的牛血清白蛋白，Iwt %的酪蛋白，體積濃度為O. 01%的Tween-20,O. 02 wt % 的 NaN3。抗體稀釋液為IOmM的磷酸鹽緩衝溶液，pH為7. 6，其中含10wt%的海藻糖，體積濃度為3%的甲醇。本發明的有益效果為用於人體液HSP70用於人體液HSP70檢測，檢測靈敏度高，準確性強、成本低，結果易觀察，靈敏度達到15ng/mL，15min內能判讀結果，具有良好的穩定性和重複性，操作簡便，無需特殊儀器設備，可用於機體應激水平的監測，和其他疾病的輔助檢查，適宜在現場檢測基層醫院和實驗研究推廣和應用。


圖I為試紙條的結構示意圖；其中各標號為I-為固定板，2-為樣品墊，3-為膠體金墊，4-為硝酸纖維素膜，5-第一檢測線，6-第二檢測線，7-第三檢測線，8-為質控線，9-吸水紙。圖2為試紙條測試結果判定示意圖。圖3為HSP70單克隆抗體純化產物SDS-PAGE電泳分析圖。
具體實施例方式下面將結合附圖和具體實例對本發明作進一步的說明。實施例I試紙條的製備和檢測以下述方式進行(I)膠體金顆粒製備將HAuCl4配製成濃度為O. Olwt%水溶液，取IOOml加熱至沸。攪動下準確加入2ml的lwt%檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7CH2O)水溶液。繼續加熱煮沸 15min。此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入後很快變為灰色，續而轉成黑色，隨後逐漸穩定成紅色。冷卻至室溫後用蒸餾水恢復至原體積。(2)膠體金質量的分析採用多功能酶標儀對膠體金進行波長在400 800nm範圍光密度掃描，獲得其最大吸收波長和半峰寬。根據最大吸收波長判斷粒徑大小，根據半峰寬判斷粒徑均一程度。(3)顯色抗體金標記用K2CO3調整膠體金的pH值到8. 5,於IOOml金納米顆粒溶液中滴加顯色抗體4mg，攪拌5min，避光靜止放置30min，再加入25ml 5wt% BSA溶液(用IOmM的Tris-HCl緩衝溶液，pH為8. 5配製)，封閉2h以上，反應液5000xg離心30min，沉澱用125ml的lwt% BSA溶液(用IOmM的Tris-HCl緩衝溶液，pH為8. 5配製)重懸浮，反覆處理2次，沉澱用Iml重懸液重懸沉澱，得到金標抗體。(4)金標墊的製備將金標抗體用噴膜儀噴印在聚脂纖維素膜上，乾燥，用量最優為 2 μ I /cm。(5)檢測線的製備取HSP70捕獲抗體(可與顯色抗體形成夾心配對)作為檢測線抗體，用抗體稀釋液(IOmM的磷酸鹽緩衝溶液，pH為7. 6，其中含10wt%的海藻糖，體積濃度為3%的甲醇)稀釋成lmg/ml濃度，用噴墨儀在硝酸纖維素膜上將抗體噴線，每隔O. 5cm噴一線，共噴三條線，形成檢測線，噴線以1μ I /cm最優，真空乾燥。(6)質控線的製備將羊抗鼠IgG用抗體稀釋液(IOmM的磷酸鹽緩衝溶液，pH為7. 6，其中含10wt%的海藻糖，體積濃度為3%的甲醇)稀釋成O. 5mg/ml，用噴膜儀將抗體噴線在硝酸纖維素膜上形成質控線，以I μ I /cm為最優，真空乾燥。(7)試紙條的組裝將樣品墊2、金標墊3、硝酸纖維素膜4和吸水紙9按順序黏貼在具有壓敏膠的PVC板的固定板上I上，如圖I所示，硝酸纖維素膜4上含有捕獲抗體的3條檢測線5、6、7以及質控線8 ;將黏附好的大板切割成4_寬的試紙條，包裝於含有乾燥劑的密閉容器內，室溫保存。(8)檢測及結果判定將試紙條平放，樣品100 μ I滴加在樣品墊上，15min時觀察，檢測結果判讀檢測線顯示I條帶，表明弱陽性；檢測線顯示2條帶，表明中度陽性；檢測線顯示3條帶，表明強陽性；以上結果判定必須以質控線顯示條帶為基礎，若質控線無顯色條帶，表明試紙條失效，結果判定無效，重新測定。如圖2所示。實施例2實施例I製備的試紙條對人血清中HSP70的檢測
分別取正常人血樣，中度應激人血樣和高應激人群血樣，採用HSP70 ELISA檢測試劑盒測定HSP70水平，根據檢測結果，選取代表HSP70水平陰性或弱陽性、中度陽性和強陽性血樣各5份，15份血樣用移液器吸取100 μ I的血漿樣本，加在膠體金試紙條的樣品墊上，開始計時，等待紅色條帶出現，15分鐘時判斷結果。結果判定當質控線出現，檢測線出現不出現或出現一條線時，表明HSP70陰性或弱陽性，表明機體應激水平正常。當質控線出現，檢測線出現二條線時，表明HSP70中度陽性，表明機體處於次強應激狀態；當質控線出現，檢測線出現三條線時，表明HSP70強陽性，表明機體處於過強應激狀態；·
若質控線無顯色條帶，表明試紙條失效；結果15個試紙條質控線全部出現，15份血樣檢測結果與預測結果一樣，100%全都符合，表明試紙條準確有效。實施例3HSP70蛋白的製備純化以下述方法製成(I)設計PCR擴增引物，構建原核表達載體，其中上遊引物為5』 CGAATTCATGGCCAAGAAAACAGCG3 』 ；下遊引物為5 』 CCCAAGCTTCTAATCCACCTCCTCGAT3，；PCR擴增條件為第一階段溫度95°C，時間3min ；第二階段溫度95°C、時間:30s，溫度:56°C、時間:60s，溫度:72°C、時間60s,以上進行30個循環；第三階段溫度72°C、時間10min。PCR產物純化後經EcoRI和Hind III雙酶切後經膠回收試劑盒回收備用；(2)構建原核表達菌株表達載體PET32a經EcoRI和Hind III雙酶切後經膠回收試劑盒回收，與HSP70PCR產物回收片段進行連接，轉化至BL21感受態菌株中，塗平板，在培養箱中培養16h，挑克隆，於搖菌管中擴展，提質粒酶切鑑定，陽性菌凍存，作為HSP70表達菌株。(3)誘導表達並純化HSP70蛋白HSP70表達菌株於LB培養基中37°C振搖，擴增至OD值O. 5時，加入IPTG I. OM/ml,誘導4h，離心收集菌體，於PB緩衝液中超聲破碎，離心收集上清。將收集的上清GE公司HP HISTrip純化柱進行純化。純化條件為親和緩衝液(Buffer) 20mM的磷酸鹽緩衝液，氯化鈉濃度為500mM，pH為7. 4。洗脫Buffer 20mM的磷酸鹽緩衝液，氯化鈉濃度為500mM，咪唑濃度為500mM，pH為 7.4。取樣品10ml,經O. 45 μ m膜過濾；柱子(Histrap 5ml)用親和Buffer平衡10個柱體積，流速為5ml/min,上樣IOml,再經親和Buffer洗5個柱體積,用洗脫Buffer , IOOml線性梯度洗脫目標蛋白，收集目標峰，進行純度鑑定。(4)用SDS-PAGE電泳鑑定蛋白純度將洗脫純化的蛋白與上樣緩衝液混合，100°C加熱5min變性，IOOOrpm離心lOmin，取上清10 μ I上樣。SDS-PAGE膠濃度為12. 5%，電泳條件為:60V，30min, 120V, 80min ；電泳完畢後，膠進行考馬斯亮藍R250染色，脫色後，膠進行掃描並圖像分析，結果重組HSP70蛋白純度〉95%以上。HSP70單克隆抗體的製備以下述方法製備(I)動物免疫選取8-12周與骨髓瘤細胞同種系的Balb/c雌性小鼠，以上述純化的HSP70蛋白為抗原，以下述方法免疫第一次第I天80 μ g+等體積完全弗氏佐劑(Fre μ nd adj μ vant),皮下注射，O. 2ml/ 只；·第二次第14天SOyg+等體積不完全福氏佐劑，皮下注射，O. 2ml/只；第三次第21天80 μ g，皮下注射，O. 2ml/只；第四次第28天80 μ g，皮下注射，O. 2ml/只；第五次第31天80 μ g，靜脈注射(IV)，O. Iml/只；(2)製備脾細胞懸液並用1640無血清培養液洗滌乾淨後混入SP2/0細胞按脾細胞與SP2/0的比為(10:1) (5:2)混合併離心,離心條件為1200rpmX 5 min ;離心後滴幹混合細胞，輕敲彈松細胞團塊。按下述步驟進行融合於37°C水浴在混合細胞中加入預熱至40°C的聚乙二醇(PEG) lml，60秒內加完，加完後在37°C水浴中靜止Imin ;然後Imin內加入終止液1ml，30秒內加入終止液1ml，Imin內加入終止液5ml,2min內加入終止液20ml,靜止7_8min。(3)融合終止後於900rpmX8min離心,離心後把融合細胞轉入HAT培養基,並滴板200 μ I /孔，全過程應防止吹散融合細胞。(4)待融合細胞在HAT中培養7天左右後(即未融合的SP2/0和脾細胞死後)換成HT培養基。200 μ I /孔第8 10天檢測。(5)待融合板換液細胞長至中等大小約I萬個細胞以上開始檢測，採用間接ELISA法檢測融合細胞的陽性克隆。在ELISA質控合格(即陰性對照〈I. O,陽性對照>1. O)後挑選陽性孔(一般0D450彡O. 5)作亞克隆。(6)挑取亞克隆檢測陽性值高的孔計數作有限稀釋4:2:1:0. 5個細胞四個梯度鋪板I個陽性細胞株/塊。待單克隆生長7-10天，單克隆細胞長至中等大小(I萬/孔)時進行檢測，其中單克隆細胞>8個/株(一般檢測12個孔)，待檢測單克隆全陽後再進行一次同樣的單克隆，細胞株擴增凍存。(7)腹水製備在細胞株鑑定合格後收集培養瓶中細胞，打小鼠腹水方法如下選擇10周齡baleb/c雌性小鼠，小鼠毛髮油光，活潑約30克體重。選優鼠，在打腹水前，7-30天內致敏小鼠，選石蠟油(或其它礦物油)0. 5ml/只腹腔(IP)注射。收集合格雜交瘤細胞加入於磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS，PH值為7. 4)或生理鹽水(無菌)中，100萬-200萬/只鼠，IP注射。雜交瘤細胞注入小鼠腹腔後5-7天即可產生腹水。(小鼠狀態腹部篷隆，小鼠精神萎靡，不思飲)此時可用無菌注射器抽取約2-5ml/只。腹水特點血性或乳白色或微黃、脂性、略濃。一般隔天抽取一次，每隻小鼠抽取三次即可處死。腹水保存抽取腹水後置4°C過夜。離心IOOOrpmX lOmin，取上清存放。(8 )抗體純化及亞型鑑定然後對單克隆抗體亞類鑑定，採用Protein A親和純化柱純化單克隆抗體,純化的 單克隆抗體用SDS-PAGE分析，如圖3所示。其中泳道M為Protein Marker, I為HSP70單克隆抗體辛酸-硫酸銨純化；2為Protein G純化柱純化HSP70單克隆抗體，箭頭所示HSP70單克隆抗體的輕鏈與重鏈。
權利要求
1.一種人體液HSP70膠體金標檢測試紙條，其特徵在於此試紙條由設在固定板(I)上依次相連的樣品墊(2)、金標墊(3)、硝酸纖維素膜(4)和吸水紙(9)組成；在硝酸纖維素膜(4)上設有第一檢測線(5)、第二檢測線(6)和第三檢測線(7)和一條質控線(8);在金標墊(3)上設有金標抗體。
2.根據權利要求I所述的人體液HSP70膠體金標檢測試紙條，其特徵在於所述固定板(I)為具有壓敏膠的PVC板，樣品墊(2)為玻璃纖維膜，金標墊(3)為聚酯纖維膜。
3.根據權利要求I所述的人體液HSp70膠體金標檢測試紙條，其特徵在於所述金標抗體為顯色抗體，所述檢測線為捕捉抗體，顯色抗體與捕捉抗體為I對雙抗體夾心配對的鼠抗人HSP70單克隆抗體。
4.根據權利要求I所述的人體液HSP70膠體金標檢測試紙條，其特徵在於所述金標抗體用粒徑為20nm-60nm的膠體金顆粒標記。
5.根據權利要求I所述的人體液HSP70膠體金標檢測試紙條，其特徵在於所述質控線(8)為羊抗鼠IgG。
6.權利要求I所述人體液HSP70膠體金標檢測試紙條的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟 (1)用常規的檸檬酸三鈉還原法製備均勻粒徑為20nm-60nm的膠體金； (2)調節上述膠體金pH為8.5-10，然後加入顯色抗體與其反應，其中顯色抗體的濃度為O. 04mg/ml，離心得沉澱，重懸沉澱，得金標抗體溶液，將金標抗體溶液用噴墨儀噴印在聚酯纖維膜，晾乾； (3)將捕捉抗體用抗體稀釋液稀釋成濃度為lmg/ml的捕捉抗體溶液，用噴墨儀將捕捉抗體溶液在硝酸纖維素膜上噴劃三條平行檢測線，真空乾燥； (4)將羊抗鼠IgG用抗體稀釋液稀釋成濃度為O.5mg/ml的羊抗鼠IgG溶液，用噴膜儀將抗體噴線在硝酸纖維素膜上形成質控線，真空乾燥； (5)按樣品墊、金標墊、硝酸纖維膜、吸水紙順序粘貼在固定板上，切條，裝入塑膠袋，乾燥包裝。
7.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，離心的方法為反應液於5000xg離心30min，沉澱用lwt%牛血清白蛋白溶液重懸浮，反覆2次；其中I wt %牛血清白蛋白溶液為IOmM的Tris-HCl緩衝溶液，pH為8. 5，含lwt%的牛血清白蛋白。
8.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，步驟(2)中重懸沉澱的溶液為20mM的Tris-HCl緩衝溶液，pH為8. 5，其中含30wt%的海藻糖，lwt%的牛血清白蛋白，Iwt %的酪蛋白，體積濃度為O. 01%的Tween-20，O. 02 wt %的NaN3。
9.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述抗體稀釋液為IOmM的磷酸鹽緩衝溶液，PH為7. 6，其中含10wt%的海藻糖，體積濃度為3%的甲醇。
全文摘要
本發明公開了屬於免疫檢測技術領域的一種人體液HSP70膠體金標檢測試紙條及其製備方法，此試紙條包括設在固定板上依次相連的樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水紙；在硝酸纖維素膜上設有三條檢測線和一條質控線在金標墊上設有金標抗體。金標抗體為顯色抗體，所述檢測線為捕捉抗體，顯色抗體與捕捉抗體為1對雙抗體夾心配對的鼠抗人HSP70單克隆抗體，質控線為羊抗鼠IgG。本發明的人體液HSP70膠體金標檢測試紙條，特異性高，結果易觀察，靈敏度達到15ng／mL，15min內就能判讀結果，具有良好的穩定性和重複性，操作簡便，無需特殊儀器設備，適宜在現場檢測基層醫院和實驗研究推廣和應用。
文檔編號G01N33/68GK102890156SQ201210365240
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者錢令嘉, 弓景波, 王新興, 戰銳, 杲修傑 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所