一種播散肝癌細胞的分離和鑑定方法

2023-08-07 04:45:36 3

專利名稱：一種播散肝癌細胞的分離和鑑定方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥領域，具體涉及一種播散肝癌細胞的分離和鑑定方法。
背景技術：
腫瘤轉移是一個多階段、多步驟的複雜過程。存在於原發瘤和轉移瘤之外的腫瘤細胞統 稱為播散腫瘤細月包(Disseminated tumor cell, DTC)，亦稱游離腫瘤細胞(Isolated tumor cell, ITC)，包括淋巴結、骨髓和血液等組織中的單個或小簇腫瘤細胞。其中進入血流的又 稱循環腫瘤細胞(Circulating tumor cell, CTC)。
原發性肝細胞癌是我國最常見、多發的惡性腫瘤之一。儘管近年來治療手段不斷增加， 但並沒有從根本上改變肝癌高死亡率的狀況。究其原因，轉移復發率高是影響肝癌遠期療效 的主要因素。肝癌細胞可以在很早期播散，大多通過血液和淋巴系統轉移，甚至播散到胸水， 腹水等體液中。因此，播散肝癌細胞檢測可以作為肝癌早期診斷的一個標記物、作為肝癌細 胞隱匿播散的一個確鑿證據以及作為監測療效和預測復發的一個獨立指標。
以往通常採用RT-PCR檢測白蛋白和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)mRNA來檢測血 循環中肝癌細胞，但RT-PCR法有其固有局限，如特異性不高、操作複雜、不能估算樣本中腫 瘤細胞的數目等。此外，更不可忽視的是，RT-PCR法須破壞細胞形態，不能對單個腫瘤細胞 進行觀察、分析和計數，而這些數據可提供CTC惡性程度和侵襲性方面的信息。故創建行之 有效的播散肝癌細胞分離/檢測系統，直接對分離到的播散肝癌細胞進行鑑定、分析和計數， 對於進一步提高肝癌的診斷水平乃至治療效果無疑具有重要意義。
目前常用的播散腫瘤細胞分離方法是利用單克隆抗體識別帶有特異表面標記的腫瘤細 胞.包括流式細胞儀和免疫磁珠細胞分選技術。前者儀器昂貴，費用很高，技術複雜，經常 會被所分選細胞的容量、活性、無菌度等問題所困擾，並且也不能提供有關細胞形態學方面 的信息。後者只要是具有特異性表面標記的細胞，不論其含量高低均可以得到分離或富集， 不僅細胞處理量大(可達109以上)，分離純度高(可達95%-99.9%)，而且易於獲得無菌的 細胞製劑。目前這一技術在腫瘤學研究上更多的是利用上皮細胞單克隆抗體來富集外周血上 皮細胞，進而應用RT-PCR等分子生物學方法或流式細胞術鑑定上皮類腫瘤細胞。遺撼的是， 由於缺乏相應的肝癌細胞表面抗體，迄今鮮見上述兩種方法用於分選播散肝癌細胞。雖然從理論上講上皮細胞抗體磁珠也可被用來分選屬於上皮類的肝癌細胞，但是這些抗體通常只能 識別部分肝癌細胞。比如上皮細胞抗體Ber-EP4單抗只能識別約67%的肝癌細胞(Latza U et al. Be:r-EP4: new monoclonal antibody which distinguishes epithelia from 腦othelial [J]. J Clin Pathol, 1990, 43(3) :213-9,)。
Ashwell和Morell於20世紀60年代發現，哺乳動物的肝實質細胞膜表面存在一種肝結 合蛋白——去唾液酸糖蛋白受體(asialoglyc叩rotein rec印tor， ASGPR)，又稱半乳糖受體 (Morell AG et al. Physical and chemical studies on ceruloplasmin, V. Metabolic studies on sialic acid-free ceruloplasmin in vivo [J]. J Biol Chem' 1968， 243(1) :155-159.) 。 ASGPR是一種跨膜蛋白，其胞外區含有糖識別區(carbohydrate recognition domain, CRD)，能專一性識別和結合以半乳糖殘基和N-乙醯半乳糖胺殘基為 端基的糖蛋白(配體)。ASGPR主要表達於哺乳動物肝賣狀隙的肝實質細胞表面，密度很高， 每個肝細胞表面可多達500， 000個受體。這一特性已被用於設計多種實驗研究，比如，利用 放射性核素標記這樣的糖蛋白進行肝顯像；而以這樣的糖蛋白為載體介導基因或藥物導向肝 實質細胞，則是肝靶向治療領域的一個研究命題。但至今未有基於ASGPR來分離播散肝癌細 胞的報導。
因此，本領域迫切需要開發出敏感、特異、高效和簡便的播散肝癌細胞分離方法和檢測方法。

發明內容
本發明的目的是提供一種肝癌細胞的分離和鑑定方法，以及本發明方法所分離到的肝癌細胞。
發明人利用ASGPR配體或針對ASGPR胞外區的單克隆抗體，創建了基於ASGPR的免疫磁 珠分離播散肝癌細胞的技術，從而解決由於缺乏肝癌細胞表面單克隆抗體所面臨的困擾。由 於正常肝細胞不會進入血循環或體液中，只有肝癌細胞才有可能，因此按照本發明方法分離 得到的細胞就是肝癌細胞。然後採用針對上皮組織來源腫瘤細胞的抗體CK3-6H5進行免疫細 胞化學檢測或者採用流式細胞儀檢測分離到的播散肝癌細胞。
本發明的第一方面提供了一種肝癌細胞的分離方法，所述分離方法包括下述步驟-
(a) 採集樣品；
(b) 從樣品中分離單個核細胞；
(c) 以與ASGPR特異結合的物質A與單個核細胞中表達ASGPR的細胞結合，所述物質A與磁珠間接連接，形成複合物B;
(d)磁性分離步驟(c)中的複合物B。 上述物質A選自ASGPR的配體或抗體。
上述ASGPR的配體為可與ASGPR的糖識別區(CRD)特異結合的蛋白、糖、多肽或核酸。 上述與ASGPR的CRD特異結合的蛋白為以半乳糖殘基或N-乙醯半乳糖胺殘基為端基的糖蛋白， 優選去唾液酸胎球蛋白。
上述ASGPR的抗體為針對ASGPR胞外區的抗體。上述抗體為單克隆抗體。在實施例中， 所述抗體為小鼠抗人ASGPR單抗、兔抗人ASGPR單抗或大鼠抗人ASGPR單抗。
上述肝癌細胞的分離方法，所述樣品選自骨髓、血液或其他體液。其他體液為淋巴液、 胸水或腹水等。
上述步驟(b)中採取的分離方法為密度梯度細胞分離法。上述密度梯度細胞分離法所 採用的密度梯度液為Ficoll或Percoll。
上述物質A為ASGPR的配體，上述步驟(c)的具體歩驟為
(f) 先以ASGPR的配體-生物素與單個核細胞中的肝癌細胞結合形成複合物1;
(g) 再以C-磁珠與複合物1結合，形成複合物Bl;
所述C為與生物素特異結合的物質。 上述C為生物素抗體或鏈黴親和素。
上述步驟(f)中去唾液酸胎球蛋白的反應濃度為0. 1-0.8mg/ml，較佳的去唾液酸胎球 蛋白的反應濃度為0. 4-0. 8mg/ml ，優選0. 4mg/ml 。
上述物質A為ASGPR抗體，上述步驟(c)的另一具體步驟為
(h) 先以ASGPR抗體與單個核細胞中的肝癌細胞結合形成複合物3; (I)再以二抗-磁珠與複合物3結合，形成複合物B3。
上述抗體為ASGPR單抗；上述步驟(h)中ASGPR單抗的濃度為0. 1-5. On g/ml，較佳的 ASGPR單抗濃度為2. 0-4. 0 u g/ml ，優選2. 0 u g/ml 。
上述ASGPR單抗為小鼠抗人ASGPR單抗、兔抗人ASGPR單抗或大鼠抗人ASGPR單抗。
本發明的第二方面提供一種上述分離方法分離到的肝癌細胞。所分離到的肝癌細胞完整 無破壞。所述肝癌細胞可以用於形態學觀察、免疫細胞化學染色，從而進行計數；並可用於 培養擴增以及進一步的分子生物學研究。
本發明的第三方面提供了一種肝癌細胞的鑑定方法，所述鑑定方法為在上述分離方法後增加步驟(e)，檢測鑑定肝癌細胞是否存在。
上述步驟(e)中可以採用免疫細胞化學法或者流式細胞儀檢測鑑定。 免疫細胞化學法是一個成熟的技術。將磁性分離獲得的細胞，通過細胞離心塗片機或手 工製成細胞塗片，然後進行免疫細胞化學染色，即可在一張細胞塗片上進行肝癌細胞的檢測 和計數。所採用的一抗可為針對上皮組織來源腫瘤細胞的抗體、針對肝癌細胞的抗體或針對 肝細胞的抗體。上述抗體包括但不限於針對上皮組織來源腫瘤細胞的抗體如CK3-6H5;針 對肝癌細胞的抗體如AFP抗體；或針對肝細胞的抗體如Hep par 1抗體或白蛋白抗體等都可 以用於鑑定肝癌細胞。
對於流式細胞儀檢測鑑定，若採用ASGPR抗體，其工作濃度為0. l-5.0ng/ml。較佳的 工作濃度為2. 0-4. On g /ml，優選2.0itg /ml。若採用去唾液酸胎球蛋白，其工作濃度為 0. 1-0. 8mg/ml 。較佳的工作濃度為0. 4-0. 8mg/ml ，優選0. 4mg/ml 。
在流式細胞儀檢測中，根據螢光標記抗體的情況不同，我們將螢光染色法分為直接螢光 染色法和間接螢光染色法，然而直接螢光標記法雖然簡單快速，引入的非特異性結合千擾少， 但是需要有相對應的螢光直接標記抗體，不僅價格較貴，而且在抗體的來源和使用上也受到 極大限制。螢光標記的ASGPR配體和ASGPR抗體並無現成的商品，標記起來也比較複雜。因 此，本發明實施例中採用間接螢光染色法。
採用本發明的分離方法和鑑定方法，敏感性高，特異性強，操作簡便。
本發明的其他方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1.氨基生物素試劑Sulfo-NHS-lC-Biotin與蛋白質的反應原理。 圖2.不同濃度的生物素化去唾液酸胎球蛋白標記H印3B細胞的流式圖。 A、 B、 C中，生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度依次為0. 2mg/ml、 0.4mg/ml、 0.8mg/ml。 D 中，生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度為0. 4mg/ml。
圖3.不同濃度的小鼠抗人ASGPR單抗標記Hep3B細胞的流式圖。
A、 B、 C中，小鼠抗人ASGPR單抗濃度依次為1.0ug/ml、 2. Oug/ml、 4. Owg/ml。 D中， 小鼠抗人ASGPR單抗濃度為2. 0 u g/ml 。
圖4.利用生物素化去唾液酸胎球蛋白從肝癌患者外周血中分離到的播散肝癌細胞 (CK3-6H5， DAB染色)(X200)。
圖5.利用ASGPR單抗從肝癌患者外周血中分離到的播散肝癌細胞(CK3-6H5， DAB染色)(X200)。
具體實施例方式
本文所述二抗，即第二抗體，是相對第一抗體而言的。在本發明中，ASGPR為抗原，ASGPR 抗體為第一抗體，針對ASGPR抗體的抗體是二抗。
本發明所述其他體液為除血液外的常規體液，包括但不限於淋巴液、胸水、腹水。
所述"反應濃度"為步驟(f)或步驟(h)中與肝癌細胞上的ASGPR結合時，ASGPR的配體 或者抗體的初始濃度，在具體實施例中，為去唾液酸胎球蛋白的初始濃度或小鼠抗人ASGPR 單抗的初始濃度。在本發明中，分別通過在分離到的單核細胞中加入無血清DMEM培養液或 PBS洗液來調節ASGPR的配體或抗體的初始濃度。
本發明所述"多肽"是指由3-50個胺基酸通過醯胺鍵(也稱肽鍵)相互連接而成的化合 物。胺基酸數目在50個以上的多肽稱為蛋白質。
本發明所述"糖"包括多糖和單糖。單糖如半乳糖或N-乙醯半乳糖等，均可以作為配體 與肝癌細胞上的ASGPR結合。
本發明所述步驟(b)中從樣品中分離單個核細胞的方法有多種方法。如可以採用Ficoll
或Percoll等密度梯度液分離單個核細胞，也可以採用紅細胞裂解液裂解樣品中的紅細胞，
再離心獲得單個核細胞。
本發明所述"磁珠間接連接"指，生物素化的ASGPR的配體或ASGPR的抗體先與目的細
胞(即肝癌細胞)上的ASGPR結合，然後用鏈黴親和素-磁珠或二抗-磁珠與ASGPR的抗體或
生物素化的ASGPR的配體結合。因此複合物B的結構為目的細胞-ASGPR的配體-生物素-C-
磁珠(複合物B1)或目的細胞-ASGPR的抗體-二抗-磁珠(複合物B3)。上述C選自生物素抗
體或鏈黴親和素。當然本發明也可以採取其他磁性顆粒。生物素與ASGPR的配體以共價鍵連接。
本發明所述螢光素選自異硫氰酸螢光素(FITC)、四乙基羅達明、四甲基異硫氰酸羅達 明或藻紅蛋白(PE)。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用 於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重 量計算。實施例l生物素化去唾液酸胎球蛋白的製備
主要材料氨基生物素化試劑Sulfo-NHS-lC-Biotin (Pierce)，去唾液酸胎球蛋白 (Sigma) ， BCA蛋白定量試劑盒(Pierce) ， L-賴氨酸(國藥)，離心超濾管(截留分子量 50， 000) (Millipore)。
實驗步驟去唾液酸胎球蛋白與氨基生物素化試劑反應按照產品說明書進行。氨基生物 素化試劑Sulfo-NHS-lC-Biotin能選擇性地與蛋白質中的游離氨基發生反應，反應式如圖1 所示。
反應結束後，將反應液移入離心超濾管，25°C， 4000g，離心20min。然後在離心管中加 入雙蒸水和L-賴氨酸，使總體積為3ml， L-賴氨酸終濃度為0. 08mg/ml，室溫放置lh。再將 離心超濾管於25°C， 4000g，離心20min。吸出超濾管中殘留液體，加適量雙蒸水稀釋。用 BCA蛋白定量試劑盒按照說明書操作，測定生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度。最後用雙蒸水 調整去唾液酸胎球蛋白濃度為3mg/ml， 0.22um濾器無菌過濾後50ul/管分裝，-20'C保存。
實施例2確定ASGPR配體和抗體的理想流式工作濃度
1.以下實驗用流式細胞儀驗證生物素化去唾液酸胎球蛋白與ASGPR的反應性，及確定生 物素化去唾液酸胎球蛋白的理想流式工作濃度。
主要材料PE標記的小鼠抗人CD45單抗(IgGl)、 PE標記的小鼠同型單抗(IgGl) 、 FITC 標記的鏈黴親和素，均購自晶美公司。生物素化去唾液酸胎球蛋白，自製。PBS洗液 (PBS+1%FBS)，自配。
實驗步驟
1) 計數500萬個H印3B肝癌細胞(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)，20'C， 300g，離心5min,棄上清，用550 U 1無血清DMEM培養液重懸，充分混勻，100pl/管，分裝 入5個EP管，依次編為1 5號。l號管為空白對照管，2號管為同型對照管，3 5號管為 測試管。
2) 向3 5號管中加入生物素化去唾液酸胎球蛋白，使得3 5號管生物素化去唾液酸胎 球蛋白的終濃度依次為O. 2mg/ml、 0.4mg/ml、 0.8mg/ml'終體積均為150ul (體積不足部分 用無血清DMEM培養液補充)。向1、 2號管中各加入無血清DMEM培養液50u 1。 1~5號管 37。C孵育lh。
3) 向1 5號管中各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，離心5min，棄上清。重複1次。4) 向1 5號管中各加入100 u 1無血清DMEM培養液。向2 5號管中各加入10 u 1 FITC 標記的鏈黴親和素。向l號管中加入10y l無血清DMEM培養液。l 5號管室溫避光孵育20min。
5) 向1 5號管中各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，離心5min，棄上清。重複1次。 每管500nl PBS洗液重懸。
6) FACSAria流式細胞儀及CellQuest軟體檢測分析。 結果
圖2中，A、 B、 C所對應的生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度依次為O. 2mg/ml、 0.4mg/ml、
0. 8mg/ml。從圖中可以看出，當生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度從0. 2mg/ml增加到0. 4mg/ml 時，H印3B細胞螢光強度也相應增加；而當濃度繼續增加到0.8mg/ml時，H印3B細胞螢光強 度與濃度為0. 4mg/ml時相比並未增加。可見，生物素化去唾液酸胎球蛋白與ASGPR的反應性 好，當生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度為0. 4mg/ml時，H印3B細胞表面的ASGPR即已飽和； 而當濃度為0.8mg/ml時，生物素化去唾液酸胎球蛋白是過量的。故選擇0.4mg/ml作為生物 素化去唾液酸胎球蛋白的候選流式工作濃度。
以下實驗進一步評價0. 4mg/ml是否為生物素化去唾液酸胎球蛋白的理想流式工作濃度。 實驗步驟
1) 計數250萬個HL-60細胞(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)和100萬個 H印3B肝癌細胞，混合後2(TC， 300g，離心5min，棄上清，用350 u 1無血清DMEM培養液重 懸，充分混勻，100ul/管，分裝入3個EP管，依次編為1 3號。l號管為空白對照管，2號 管為同型對照管，3號管為測試管。
2) 向3號管中加入生物素化去唾液酸胎球蛋白，使得3號管生物素化去唾液酸胎球蛋白 的終濃度為0.4mg/ml,終體積均為150 ixl (體積不足部分用無血清DMEM培養液補充)。向
1、 2號管中各加入無血清DMEM培養液50u 1 。 1 3號管37。C孵育lh。
3) 向1 3號管中各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，離心5min，棄上清。重複1次。
4) 向1 3號管中各加入100ul無血清DMEM培養液。向3號管中各加入10 u 1 PE標記 的小鼠抗人CD45單抗和10 u 1 FITC標記的鏈黴親和素。向2號管中加入10ul PE標記的小 鼠同型單抗和10 u 1 FITC標記的鏈黴親和素。向1號管中加入20ul無血清DMEM培養液。1 3號管室溫避光孵育20min。
5) 向1 3號管中各加入lml PBS洗液'20'C， 300g，離心5min，棄上清。重複1次。 每管500ul PBS洗液重懸。
6) FACSAria流式細胞儀及CellQuest軟體檢測分析。結果-
圖2 (D)中，橫坐標為ASGPR-FITC，縱坐標為CD45-PE。 CD45-ASGPR+定義為H印3B細胞， CD45+ASGPR—定義為HL-60細胞，CD45+ASGPR+定義為非特異性染色細胞。從圖中可以看出，當 生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度為0. 4mg/ml時，H印3B細胞被充分標記，且無非特異性染色。 可見，0.4mg/ml為生物素化去唾液酸胎球蛋白的理想流式工作濃度。
2、流式細胞儀驗證小鼠抗人ASGPR單抗與ASGPR胞外域的反應性，及確定小鼠抗人ASGPR 單抗的理想流式工作濃度。
主要材料小鼠抗人ASGPR單抗(IgGl)，為法國Dendritics公司產品。小鼠同型單抗 (IgGl) 、 FITC標記的大鼠抗小鼠IgGl抗體、PE標記的大鼠抗人CD45單抗(IgG2a)、 PE標 記的大鼠同型單抗(IgG2a)，均購自晶美公司。PBS洗液(PBS+1%FBS)，自配。FACSAria 流式細胞儀，為Becton Dickinson公司產品。
實驗步驟-
1) 計數500萬個H印3B肝癌細胞，20°C， 300g，離心5min，棄上清，用550 u 1 PBS洗 液重懸，充分混勻，100y 1/管，分裝入5個EP管，依次編為1 5號。l號管為空白對照管， 2號管為同型對照管，3 5號管為測試管。
2) 向3 5號管中加入小鼠抗人ASGPR單抗(IgGl)，使得3 5號管小鼠抗人ASGPR單抗 的終濃度依次為1.0ug/ml、 2.0ug/ml、 4.0ug/ml，終體積均為110ul。向1號管中加入 PBS洗液10u 1，向2號管中加入lOu 1小鼠同型單抗(IgG1)。1 5號管室溫避光孵育20min。
3) 向1 5號管中各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，離心5min，棄上清。重複1次。
4) 向1 5號管中各加入10CUi1 PBS洗液。向2 5號管中各加入10ul FITC標記的大 鼠抗小鼠IgGl。向l號管中加入10ul PBS洗液。1 5號管室溫避光孵育20min。
5) 向1 5號管中各加入lml PBS洗液，20'C， 300g，離心5min，棄上清。重複1次。 每管500ul PBS洗液重懸。
6) FACSAria流式細胞儀及CellQuest軟體檢測分析。 結果
圖3中，A、 B、 C所對應的小鼠抗人ASGPR單抗濃度依次為1.0ug/ml、 2. Oug/ml、 4.0 Ug/ml。從圖中可以看出，當小鼠抗人ASGPR單抗濃度為2. 0ug/ml和4. Owg/ml時，H印3B 細胞螢光強度也相應增加；而當濃度繼續增加到4.0ug/ml時，H印3B細胞螢光強度與濃度 為2.0ng/ml時相比並未增加。可見，小鼠抗人ASGPR單抗與ASGPR的反應性好，當小鼠抗人ASGPR單抗濃度為2. 0 u g/ml時，H印3B細胞表面的ASGPR即已飽和；而當濃度為4. 0 u g/ml 時，小鼠抗人ASGPR單抗是過量的。故選擇2.0ug/ml作為小鼠抗人ASGPR單抗的候選流式
工作濃度。
以下實驗進一步評價2. 0 u g/ml是否為小鼠抗人ASGPR單抗的理想流式工作濃度。 實驗步驟
1) 計數250萬個HL-60細胞和100萬個H印3B肝癌細胞，混合後20'C， 300g，離心5min， 棄上清，用350ulPBS洗液重懸，充分混勻，100yl/管，分裝入3個EP管，依次編為1 3 號。l號管為空白對照管，2號管為同型對照管，3號管為測試管。
2) 向3號管中加入小鼠抗人ASGPR單抗，使終濃度為2. Ong/ml，終體積為110ul。向 1號管中加入PBS洗液10n 1，向2號管中加入10n 1小鼠同型單抗(IgGl) 。 1 3號管室 溫避光孵育20min。
3) 向1 3號管中各加入lml PBS洗液，20°C， 300g，離心5min，棄上清。重複1次。
4) 向1 3號管中各加入100u 1PBS洗液。向3號管中各加入10ulPE標記的小鼠抗人 CD45單抗(IgG2a)禾卩10ul FITC標記的大鼠抗小鼠IgGl抗體。向2號管中加入10ul PE 標記的大鼠同型單抗(IgG2a)和10u 1 FITC標記的大鼠抗小鼠IgGl抗體。向1號管中加入 20ulPBS洗液。1 3號管室溫避光孵育20min。
5) 向1 3號管中各加入lml PBS洗液，20°C， 300g，離心5min，棄上清。重複1次。 每管500y 1 PBS洗液重懸。
6) FACSAria流式細胞儀及CellQuest軟體檢測分析。 結果
圖3 (D)中，橫坐標為ASGPR-FITC，縱坐標為CD45-PE。 CD45-ASGPR+定義為H印3B細胞， CD45+ASGPR—定義為HL-60細胞，CD45+ASGPR+定義為非特異性染色細胞。從圖中可以看出，當 生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度為2. Oug/ml時，H印3B細胞被充分標記，且無非特異性染 色。可見，2.0ug/ml是小鼠抗人ASGPR單抗的理想流式工作濃度。
實施例3利用ASGPR配體分離和鑑定播散肝癌細胞
主要材料5ml肝癌患者志願者的外周血，肝素抗凝。Ficoll-Paque Plus,購自GE Healthcare。磁性分離器、抗生物素磁珠、MS磁性分選柱、30 n m濾網、CK3-6H5抗體(上 皮組織來源的腫瘤細胞標誌物抗體)均購自德國Miltenyi公司。Labofuge②400R臺式離心機 (帶細胞離心塗片附件)，購自德國Heraeus公司。多聚賴氨酸玻片，購自福建邁新公司。PV9000 二步法免疫組化試劑盒，購自美國GBI公司。生物素化去唾液酸胎球蛋白，自製。PBS 洗液(含O. 5%BSA、 80UAil肝素)，自配。試劑1: PBS洗液(含0. 5%BSA、 80U/ml肝素)試劑2:無血清DMEM培養液試劑3:生物素化去唾液酸胎球蛋白，3mg/ml試劑4:抗生物素磁珠步驟(A) Ficoll分離外周血單個核細胞1) 將5ml肝素抗凝血、0. 2ml肝素、5ml試劑1於50ml離心管中混勻，平鋪於7ml Ficoll 上，18°C， 600g，離心25min。2) 吸棄上層血清。3) 吸取單個核細胞層，置於15ml離心管中。4) 加3倍體積試劑1， 18'C， 300g，離心10min。5) 吸棄上清，8ml試劑l重懸，18°C， 300g，離心10min。6) 徹底吸棄上清。(B) 磁珠分離播散肝癌細胞1) 力口 130y 1試齊U2。2) 力口20uli式齊U3，混勻。3) 37°C，孵育lh。4) 加5ml試劑l， 18。C, 300g，離心10min，吸棄上清。5) 重複上一步。6) 力口80u 1試齊U 1。7) 力口20u 1試齊IJ4，混勻。8) 4°C，孵育15min。9) 加5ml試劑l， 18°C， 300g，離心10min。10) 吸棄上清，500ul試劑l重懸(注意儘量不要產生氣泡)。11) 安裝MS磁性分選柱和濾網。12) 500 u 1試劑1加入濾網。13) 待分選柱下方液滴剛剛停止，即向濾網加入500u 1細胞懸液。14) 加500 u 1試劑1於15ml離心管中，洗滌殘留細胞。15) 待分選柱上方液體快流完時，加入500ul細胞懸液。16) 待分選柱上方液體快流完時，加入500ul試劑l。17) 重複上一步2次。18) 待分選柱下方液滴剛剛停止，將分選柱移出磁場，置於另一個無菌的15ml離心管上。19) 加lml試劑1於分選柱中，立即用活塞將液體快速推入離心管中。20) 重複上一步。21) 18°C， 300g，離心10min。22) 吸棄上清，100ul試劑l重懸。(C)播散肝癌細胞的免疫細胞化學鑑定。 步驟1) 用離心塗片機將細胞塗片於多聚賴氨酸玻片上。2) 將玻片置於烤箱中，48°C。3) 待完全乾燥後取出。4) 涼至室溫後，滴加lml固定液(95%乙醇)，置於溼盒中，15min 。5) 自來水衝洗數秒後浸泡於PBS中，2min。6) 甩去PBS，用吸水紙吸去細胞周圍水分。7) 免疫組化油筆畫圈(距離細胞區域邊緣約O. 5mm)。8) 滴加l滴Triton X-100,溼盒中常溫孵育10min。9) PBS洗，2min。10) 甩去PBS，滴加1滴3XHA，溼盒中常溫孵育10min。11) PBS洗，2minX3次。12) 加50nl l:50—抗(CK3-6H5)，溼盒中常溫孵育lh。13) PBS洗，2minX3次。14) 滴加1滴PV卯00試劑1，溼盒中常溫孵育20min。15) PBS洗，2minX3次。16) 滴加1滴PV9000試劑2，溼盒中常溫孵育20min。17) PBS洗，2minX3次。18) 力Q70ti1 DAB顯色液，顯色3 8min，鏡下觀察顯色情況。19) PBS衝洗，終止反應。 結果從肝癌患者外周血中分離到19個播散肝癌細胞。免疫細胞化學染色結果見圖4(CK3-6H5， MB染色)(X200) 。 A、 B、 C所示視野中分別有l個、2個、1個較大的、胞漿呈棕黃色(圖 中為深灰)的細胞，即肝癌細胞。實施例4生物素化去唾液酸胎球蛋白/生物素抗體磁珠與Ber-EP4抗體磁珠的回收率比較主要材料健康志願者靜脈血，採用真空肝素抗凝管採血。H印3B肝癌細胞系，用含10%FBS (GIBCO)的DMEM培養液(GIBC0)培養。磁性分離器、Ber-EP4抗體磁珠、抗生物素磁珠、 MS磁性分選柱、30ym濾網、CK3-6H5抗體(上皮組織來源的腫瘤細胞標誌物抗體)均購自 德國Miltenyi公司。Labofuge 400R臺式離心機(帶細胞離心塗片附件)，購自德國Heraeus 公司。多聚賴氨酸玻片，購自福建邁新公司。PV9000 二步法免疫組化試劑盒，購自美國GBI 公司。生物素化去唾液酸胎球蛋白，自製。PBS洗液(含0.5MBSA、 80U/ml肝素)，自配。實驗方法將10 40個H印3B肝癌細胞摻入5ml肝素抗凝的健康志願者靜脈血樣本中。 按照實施例3的方法分離單個核細胞。生物素化去唾液酸胎球蛋白/生物素抗體磁珠組分離 H印3B細胞步驟同實施例3。 Ber-EP4抗體磁珠組分離H印3B細胞步驟按照說明書進行。離心 塗片、免疫細胞化學鑑定步驟同實施例3。實驗重複4次。回收率用均數土標準差表示。健康志願者的靜脈血中摻入不同數目(10 40)的H印3B細胞，經Ficoll分離單個核細 胞後，分別用生物素化去唾液酸胎球蛋白/生物素抗體磁珠和Ber-EP4抗體磁珠分離回收 H印3B細胞，生物素化去唾液酸胎球蛋白/生物素抗體磁珠的回收率(82. 6 0顯著高於Ber-EP4 抗體磁珠的回收率(48.9%)(代0.Q5)(見表l)。表l.不同磁珠從播散肝癌細胞實驗模型中分離所摻入的H印3B肝癌細胞細胞株磁珠摻入的細胞數回收率(％)H印3B生物素化去唾液 酸胎球蛋白/生物 素抗體磁珠10/20/30/4082. 6±6. 7H印3BBer-EP4抗體磁珠10/20/30/4048. 9±5. 6實施例5利用針對ASGPR胞外區的單克隆抗體分離和鑑定播散肝癌細胞 主要材料5ml肝癌患者志願者的外周血，EDTA抗凝。Ficoll-Paque Plus,購自GE Healthcare。小鼠抗人ASGPR單抗(IgGl)，購自法國Dendritics公司。磁性分離器、大鼠抗小鼠IgGl抗體磁珠、MS磁性分選柱、30um濾網、CK3-6H5 (針對上皮組織來源腫瘤細胞的 抗體)均購自德國Miltenyi公司。LabofUge 400R臺式離心機(帶細胞離心塗片附件)，購 自德國Heraeus公司。多聚賴氨酸玻片，購自福建邁新公司。PV9000 二步法免疫組化試劑盒， 購自美國GBI公司。PBS洗液(含2mM EDTA和0. 5%BSA),自配。 步驟(A) Ficoll分離外周血單個核細胞 具體操作步驟同實施例3 Ficoll分離外周血單個核細胞部分。(B) 磁珠分離播散肝癌細胞1) 130ul PBS洗液重懸細胞。2) 加20u 1小鼠抗人ASGPR單抗，混勻。3) 室溫孵育20min。4) 加5ml PBS洗液，18°C， 300g，離心10min，吸棄上清。5) 重複上一步。6) 力口80u 1 PBS洗液。7) 加20ul大鼠抗小鼠IgGl抗體磁珠，混勻。8) -22)步同實施例3相應部分。(C) 播散肝癌細胞的免疫細胞化學鑑定 操作步驟同實施例3相應部分。結果從肝癌患者外周血中分離到13個播散肝癌細胞。免疫細胞化學染色結果見圖5(CK3-6H5， DAB染色)(X200) 。 A、 B所示視野中各有l個較大的、胞漿呈棕黃色(圖中為深灰)的細 胞，即肝癌細胞。實施例6抗ASGPR單抗/二抗磁珠與Ber-EP4抗體磁珠的回收率比較主要材料健康志願者靜脈血，採用真空EDTA抗凝管採血。H印3B肝癌細胞系，用含10%FBS (GIBC0)的DMEM培養液(GIBC0)培養。小鼠抗人ASGPR單抗(IgGl)，購自法國Dendritics 公司。磁性分離器、Ber-EP4抗體磁珠、大鼠抗小鼠IgGl抗體磁珠、MS磁性分選柱、30 y m 濾網、CK3-6H5 (針對上皮組織來源腫瘤細胞的抗體)均購自德國Miltenyi公司。 LabOfuge 400R臺式離心機(帶細胞離心塗片附件)，購自德國Heraeus公司。多聚賴氨酸 玻片，購自福建邁新公司。PV9000 二步法免疫組化試劑盒，購自美國GBI公司。PBS洗液(含2mM EDTA禾tl 0. 5%BSA)，自配。實驗方法將10 40個H印3B肝癌細胞摻入5ml EDTA抗凝的健康志願者靜脈血樣本中。 按照實施例5的方法分離單個核細胞。抗ASGPR單抗/二抗磁珠組分離H印3B細胞步驟同實施 例5。 Ber-EP4抗體磁珠組分離H印3B細胞步驟按照說明書進行。離心塗片、免疫細胞化學鑑 定步驟同實施例5。實驗重複4次。回收率用均數土標準差表示。健康志願者的靜脈血樣本中摻入不同數目(10 40)的H印3B細胞，經Ficoll分離單個 核細胞後，分別用抗ASGPR單抗/二抗磁珠和Ber-EP4抗體磁珠分離回收H印3B細胞，抗ASGPR 單抗/二抗磁珠的回收率(85. 3%)高於Ber-EP4抗體磁珠的回收率(48.9%)(代0.05)(見 表2)。表2.不同磁珠從播散肝癌細胞實驗模型中分離所摻入的H印3B肝癌細胞細胞株磁珠摻入的細胞數回收率(％)Hep3BASGPR單抗/二抗 磁珠10/20/30/4085. 3±4. 1Hep3BBer-EP4抗體磁珠10/20/30/4048. 9±5. 6本發明使用生物素化去唾液酸胎球蛋白/生物素抗體磁珠或抗ASGPR單抗/二抗磁珠分離 肝癌細胞，其回收率均顯著高於Ber-EP4抗體磁珠的回收率。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作 為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本 發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.一種肝癌細胞的分離方法，其特徵在於，包括下述步驟(a)採集樣品；(b)從樣品中分離單個核細胞；(c)以與去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)特異結合的物質A與單個核細胞中的肝癌細胞結合，所述物質A與磁珠間接連接，形成複合物B；(d)磁性分離步驟(c)中的複合物B。
2. 權利要求1所述的分離方法，其特徵在於，所述物質A選自ASGPR的配體或抗體。
3. 權利要求1所述的分離方法，其特徵在於，所述步驟(b)中採取的分離方法為密度梯度細 胞分離法。
4. 權利要求1所述的分離方法，其特徵在於，所述樣品選自骨髓、血液或其他體液。
5. 權利要求4所述的分離方法，其特徵在於，所述其他體液為淋巴液、胸水或腹水。
6. 權利要求2所述的分離方法，其特徵在於，所述物質A為ASGPR的配體，所述ASGPR的配 體為可與ASGPR的糖識別區(CRD)特異結合的蛋白、糖、多肽或核酸。
7. 權利要求6所述的分離方法，其特徵在於，所述可與ASGPR的CRD特異結合的蛋白為以半 乳糖殘基或N-乙醯半乳糖胺殘基為端基的糖蛋白。
8. 權利要求7所述的分離方法，其特徵在於，所述可與ASGPR的CRD特異結合的蛋白為去唾 液酸胎球蛋白。
9. 權利要求2所述的分離方法，其特徵在於，所述物質A為ASGPR胞外區的抗體。
10. 權利要求9所述的分離方法，其特徵在於，所述ASGPR胞外區的抗體為單克隆抗體。
11. 權利要求1-8任一權利要求所述的肝癌細胞的分離方法，其特徵在於，所述物質A為ASGPR 的配體，所述步驟(c)的具體步驟為(f )先以ASGPR的配體-生物素與單個核細胞中的肝癌細胞結合形成複合物1; (g)再以C-磁珠與複合物1結合，形成複合物B1; 所述C為與生物素特異結合的物質。
12. 權利要求11所述的分離方法，其特徵在於，所述步驟(f)中ASGPR的配體為去唾液酸胎 球蛋白；C為鏈黴親和素或生物素抗體。
13. 權利要求12所述的分離方法，其特徵在於，所述步驟(f)中去唾液酸胎球蛋白的反應濃 度為0. 1-0. 8mg/ml。
14.權利要求13所述的肝癌細胞的分離方法，其特徵在於，所述步驟(f)中去唾液酸胎球蛋 白的反應濃度為0.4-0.8mg/ml。
15. 權利要求1-5、 9-10任一權利要求所述的肝癌細胞的分離方法，其特徵在於，所述物質A 為ASGPR抗體，所述步驟(c)的具體步驟為(h)先以ASGPR抗體與肝癌細胞結合形成複合物3;(I)再以二抗-磁珠與複合物3結合，形成複合物B3。
16. 權利要求15所述的分離方法，其特徵在於，所述步驟(h)中ASGPR抗體為小鼠抗人ASGPR 單抗、兔抗人ASGPR單抗或大鼠抗人ASGPR單抗。
17. 權利要求16所述的分離方法，其特徵在於，所述步驟(h)中ASGPR單抗的反應濃度為 0.l-5 y g/ml。
18. 權利要求17所述的肝癌細胞的分離方法，其特徵在於，所述步驟(h)中ASGPR單抗的反 應濃度為2-4u g/ml。
19. 權利要求1-10、 12-14、 16-18任一權利要求所述的分離方法所分離的肝癌細胞。
20. —種肝癌細胞的鑑定方法，其特徵在於，包括下述步驟(a) 採集樣品；(b) 從樣品中分離單個核細胞；(c) 以與去唾液酸糖蛋白受體特異結合的物質A與單個核細胞中的肝癌細胞結合，所述物質 A與磁珠間接連接，形成複合物B;(d) 磁性分離步驟(c)中的複合物B;(e) 檢測鑑定肝癌細胞是否存在。
21. 權利要求20所述的鑑定方法，其特徵在於，所述物質A選自ASGPR的配體或抗體。
22. 權利要求20所述的鑑定方法，其特徵在於，所述步驟(b)中採取的分離方法為密度梯度 細胞分離法。
23. 權利要求20所述的鑑定方法，其特徵在於，所述樣品選自骨髓、血液或其他體液。
24. 權利要求23所述的鑑定方法，其特徵在於，所述其他體液為淋巴液、胸水或腹水。
25. 權利要求21所述的鑑定方法，其特徵在於，所述物質A為ASGPR的配體，所述ASGPR的 配體為可與ASGPR的糖識別區(CRD)特異結合的蛋白、糖、多肽或核酸。
26. 權利要求25所述的鑑定方法，其特徵在於，所述可與ASGPR的CRD特異結合的蛋白為以 半乳糖殘基或N-乙醯半乳糖胺殘基為端基的糖蛋白。
27. 權利要求26所述的鑑定方法，其特徵在於，所述可與ASGPR的CRD特異結合的蛋白為去 唾液酸胎球蛋白。
28. 權利要求21所述的鑑定方法，其特徵在於，所述物質A為ASGPR胞外區的抗體。
29. 權利要求28所述的鑑定方法，其特徵在於，所述ASGPR胞外區的抗體為單克隆抗體。
30. 權利要求20-27任一權利要求所述的肝癌細胞的鑑定方法，其特徵在於，所述物質A為 ASGPR的配體，所述步驟(c)的具體步驟為(f) 先以ASGPR的配體-生物素與單個核細胞中的肝癌細胞結合形成複合物l;(g) 再以C-磁珠與複合物1結合，形成複合物B1; 所述C為與生物素特異結合的物質。
31. 權利要求30所述的鑑定方法，其特徵在於，所述步驟(f)中ASGPR的配體為去唾液酸胎 球蛋白；C為鏈黴親和素或生物素抗體。
32. 權利要求31所述的鑑定方法，其特徵在於，所述步驟(f)中去唾液酸胎球蛋白的反應濃 度為0. 1-0. 8mg/ml。
33. 權利要求32所述的肝癌細胞的鑑定方法，其特徵在於，所述步驟(f)中去唾液酸胎球蛋 白的反應濃度為0. 4-0. 8mg/ml 。
34. 權利要求20-24任一權利要求所述的肝癌細胞的鑑定方法，其特徵在於，所述物質A為 ASGPR抗體，所述步驟(c)的具體步驟為(h) 先以ASGPR抗體與肝癌細胞結合形成複合物3; (I)再以二抗-磁珠與複合物3結合，形成複合物B3。
35. 權利要求34所述的鑑定方法，其特徵在於，所述步驟(h)中ASGPR抗體為小鼠抗人ASGPR 單抗、兔抗人ASGPR單抗或大鼠抗人ASGPR單抗。
36. 權利要求35所述的鑑定方法，其特徵在於，所述步驟(h)中ASGPR單抗的反應濃度為 0.卜5u g/ml。
37. 權利要求36所述的肝癌細胞的鑑定方法，其特徵在於，所述步驟(h)中ASGPR單抗的反 應濃度為2-4y g/ml。
38. 權利要求20所述的肝癌細胞的鑑定方法，其特徵在於，所述步驟(e)中採用免疫細胞化 學法或者流式細胞儀檢測鑑定。
全文摘要
本發明提供了一種播散肝癌細胞的分離和鑑定方法，所述方法基於肝癌細胞膜上的去唾液酸糖蛋白受體，利用去唾液酸糖蛋白受體的配體或者抗體與肝癌細胞結合，然後用磁珠間接標記所述肝癌細胞進行陽性分離富集，再用免疫細胞化學方法或流式細胞儀等方法鑑定、檢測，可判斷標本中是否存在肝癌細胞。該方法可用於肝癌的診斷、轉移復發預測及療效監測等。本發明方法可以檢測播散肝癌細胞，其敏感性高、特異性好，且操作簡便。
文檔編號C12N5/08GK101302495SQ20081004019
公開日2008年11月12日 申請日期2008年7月3日 優先權日2008年7月3日
發明者康曉燕, 文 徐, 殷正豐 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學